呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎嬰幼患兒外周血miR-155與PDCD4表達的相關性研究

王剛，王瓊，姜昕，鄭靜

毛細支氣管炎屬下呼吸道感染性疾病，臨床癥狀主要為咳嗽、喘憋，因嬰幼兒的免疫抵抗力較差，因此該疾病多發人群以嬰幼兒為主［1］。其中，由呼吸道合胞病毒（RSV）誘發的毛細支氣管炎占比較大。病情較輕的患兒經治療后可恢復，嚴重者如未得到及時有效治療則可能發展為肺氣腫、哮喘甚至死亡，嚴重威脅嬰幼兒的生命健康［2］。目前尚未發現診斷RSV 毛細支氣管炎的有效因子，因此尋找生物標志物十分必要。微小RNA（miRNA）是一類高度保守的小RNA，通過與其靶基因特異性結合，調控人類約30%的基因表達，在多種生理和病理過程中發揮重要作用，其中miR-155 是其家族中重要的一員［3］。有研究表明，RSV 肺炎嬰幼兒外周血miR-155 水平升高，且miR-155 水平與炎性因子呈正相關［4］。程序性細胞死亡因子4（PDCD4）在多種腫瘤中發揮抑瘤作用，參與細胞周期、增殖、凋亡等過程。PDCD4受多種miRNA的調控。有研究發現，糖尿病腎病血管鈣化患者血清miR-155 和PDCD4 mRNA呈顯著負相關，且兩者之間存在結合位點，推測可能是miR-155 通過靶向PDCD4 影響糖尿病腎病患者發生血管鈣化［5］。目前，關于miR-155 和PDCD4 在RSV 毛細支氣管炎中的研究較少。本研究擬探究RSV毛細支氣管炎嬰幼兒外周血miR-155與PDCD4表達的關系，旨在為該疾病的診治提供一定的參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 以2018 年2 月—2021 年2 月上海浦濱兒童醫院兒內科收治的106 例RSV 毛細支氣管炎嬰幼兒為研究組，其中男57 例，女49 例，年齡36 d～36 個月，平均（6.32±1.74）個月。按照《毛細支氣管炎診斷、治療與預防專家共識（2014 年版）》［6］分為輕癥組36 例、中癥組41 例和重癥組29例。納入標準：（1）符合《諸福棠實用兒科學》中RSV 毛細支氣管炎的診斷標準［7］。（2）從發病到入院≤3 d。（3）年齡≤36個月。（4）鼻咽部RSV檢查陽性。（5）雙肺伴有濕啰音和哮鳴音。排除標準：（1）患有先天免疫系統疾病者。（2）伴有心、肝、腎疾病者。（3）2周內服用過糖皮質激素及抗菌藥物者。（4）精神系統紊亂、不能積極配合治療者。另選擇同期在本院兒保門診健康體檢的嬰幼兒65 例為對照組，體檢結果正常，排除2周內服用過糖皮質激素及抗菌藥物者，其中男36 例，女29例，年齡38 d～36 個月，平均（6.65±1.79）個月。2 組性別（χ2=0.042）、年齡（t=1.175）比較差異無統計學意義（均P＞0.05），具有可比性。本研究經嬰幼兒家屬簽署知情同意書，并經上海浦濱兒童醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol 試劑（廣州東盛生物科技有限公司）；RNA 逆轉錄試劑盒（北京泰澤嘉業科技發展有限公司）；miScript SYBR?Green qPCR 試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司）；miR-155、U6 引物（廣東文華氏生物科技有限公司）；人PDCD4酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海仁捷生物科技有限公司）；人超敏C反應蛋白（hs-CRP）、白細胞介素（IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；PCR儀（上海凈信實業發展有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集 采集各組嬰幼兒空腹外周靜脈血3～5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃保存備用。

1.3.2 血清miR-155水平檢測 在血清樣品中加入Trizol試劑提取總RNA。將RNA 反轉錄為cDNA，利用miScript SYBR?Green qPCR 試劑盒進行實時熒光定量PCR（qPCR）反應。反應條件：95 ℃60 s；95 ℃15 s，63 ℃30 s，72 ℃15 s，共40 個循環，以U6為miR-155的內參，其相對表達量采用2-ΔΔCt法計算，引物序列見表1。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.3.3 血清PDCD4 及炎性因子水平檢測 采用ELISA 法檢測血清PDCD4 及炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 水平，其試驗操作均嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法 采用軟件SPSS 23.0處理數據。計數資料以例表示，2 組間比較行χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較行t檢驗，多組間比較行單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗。Pearson 相關分析RSV 毛細支氣管炎嬰幼兒血清miR-155和PDCD4的關系，以及兩者與炎性因子的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組嬰幼兒血清miR-155 和PDCD4 表達水平比較 與對照組相比，研究組患兒血清miR-155 水平升高，PDCD4水平降低（P＜0.01），見表2。

Tab.2 The serum expression levels of miR-155 and PDCD4 in the two groups of infants表2 2組嬰幼兒血清miR-155、PDCD4表達水平（±s）

Tab.2 The serum expression levels of miR-155 and PDCD4 in the two groups of infants表2 2組嬰幼兒血清miR-155、PDCD4表達水平（±s）

＊＊P＜0.01。

組別對照組研究組t n 65 106 miR-155/U6 1.02±0.18 2.14±0.36 23.339＊＊PDCD4（μg/L）4.97±0.96 2.84±0.41 20.078＊＊

2.2 病情輕、中、重3 組患兒血清miR-155 和PDCD4 表達水平比較 與輕癥組嬰幼兒相比，中癥組血清miR-155 水平上升，PDCD4 水平下降（P＜0.05），與中癥組相比，重癥組miR-155 水平上升，PDCD4水平下降（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Expression levels of serum miR-155 and PDCD4 in the three groups of infants表3 3組患兒血清miR-155、PDCD4表達水平（±s）

Tab.3 Expression levels of serum miR-155 and PDCD4 in the three groups of infants表3 3組患兒血清miR-155、PDCD4表達水平（±s）

＊＊P＜0.01；a與輕癥組比較，b與中癥組比較，P＜0.05。

組別輕癥組中癥組重癥組F n 36 41 29 miR-155/U6 1.71±0.26 2.01±0.31a 2.85±0.56ab 75.469＊＊PDCD4（μg/L）4.19±0.62 2.44±0.34a 1.74±0.26ab 276.596＊＊

2.3 2組嬰幼兒血清炎性因子水平比較 與對照組相比，研究組患兒血清炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α水平均上升（P＜0.01），見表4。

Tab.4 Comparison of serum inflammatory factors between the two groups表4 2組嬰幼兒血清炎性因子水平比較 （±s）

Tab.4 Comparison of serum inflammatory factors between the two groups表4 2組嬰幼兒血清炎性因子水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01。

組別對照組研究組t n 65 106 hs-CRP（mg/L）131.39±30.27 225.43±49.36 13.838＊＊IL-6（ng/L）109.61±21.47 196.93±33.85 18.616＊＊IL-10（ng/L）116.96±28.59 189.33±31.47 15.105＊＊TNF-α（ng/L）4.02±1.16 5.67±1.54 7.438＊＊

2.4 血清miR-155 與PDCD4 及兩者與炎性因子的關系 生物信息學網站ENCORI 顯示，miR-155 和PDCD4 之間存在結合位點，見圖1。且Pearson 相關性分析顯示，兩者水平呈負相關（r=-0.790，P＜0.01）。此外，血清miR-155 水平與炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 均呈正相關（r分別為0.561、0.701、0.651 和0.676，均P＜0.01），PDCD4 與上述炎性因子均呈負相關（r分別為-0.580、-0.752、-0.713和-0.671，均P＜0.01）。

Fig.1 Binding site map between miR-155 and PDCD4圖1 miR-155和PDCD4之間的結合位點圖

3 討論

3.1 RSV 毛細支氣管炎研究目的及意義 毛細支氣管炎是由細菌、病毒、支原體等多種病原體引發的感染性疾病，RSV 是感染較多的病原體，約占36.32%，該病多發于3歲以下的嬰幼兒，由于該類人群免疫力差，容易反復感染，傷及肺部［8-9］。因此，探究可以準確診斷RSV毛細支氣管炎以及評估患兒病情發展狀況的輔助指標具有積極意義。

3.2 血清miR-155 表達與RSV 毛細支氣管炎發展及炎癥指標的關系 miRNA 是長為20～25 nt 的小RNA，具有一定的內源性，參與調控細胞的增殖、分化、凋亡等重要生理過程，miRNA 在基因網絡中與多種靶基因形成調控網，通過降解mRNA 參與多種疾病的發生、發展過程［10］。多種miRNA在機體炎癥反應中發揮重要作用［11］。miR-155 是一種多功能miRNA，其作為促炎基因通過多種調控過程參與炎性疾病的發展［4］。馮瓊等［12］研究表明，與對照組相比，新生兒肺炎患者血清miR-155水平明顯上調，經治療后其水平顯著降低，且miR-155 水平與炎性因子降鈣素原（PCT）、IL-6水平呈正相關，對新生兒肺炎有一定的診斷價值。Arroyo 等［13］研究發現，RSV感染患兒鼻腔樣本中miR-155水平較對照組明顯升高，且過表達的miR-155 與患兒呼吸道疾病嚴重程度有關。在本研究中，研究組嬰幼兒血清miR-155水平顯著升高，且miR-155 水平隨著RSV 毛細支氣管炎嚴重程度加重而明顯上升，與Arroyo 等［13］研究結果一致，提示miR-155 參與了RSV 毛細支氣管炎的發生和發展。此外，本研究結果顯示研究組患兒血清炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 水平均上升，且其水平與miR-155 水平均呈正相關。這與黃佩等［14］研究結果一致，提示miR-155 可作為輔助指標與常見炎性因子共同監測RSV下呼吸道感染疾病的發生。

3.3 血清PDCD4 表達與RSV 毛細支氣管炎發展及炎癥指標的關系 PDCD4 是新型的腫瘤抑制因子，廣泛表達于多種組織，在多種腫瘤中抑制癌細胞的生長，并促進其凋亡。有研究發現，下調的PDCD4可為腫瘤生長創造適宜的環境［15］。另有研究表明，冠心病心源性猝死患者心肌組織中PDCD4 水平呈低表達，推測其作用與調控炎癥反應密切相關［16］。Wang 等［17］研究發現，缺乏PDCD4 可上調促炎因子（如IL-6）表達，加重急性結腸炎病情，進而誘發向結直腸癌演變。本研究中，研究組嬰幼兒血清PDCD4水平較對照組顯著降低，且其水平隨著RSV 毛細支氣管炎嚴重程度加重而明顯下調，提示PDCD4在該病的發生、發展中發揮調控作用。PDCD4與炎性因子均呈負相關，推測PDCD4在RSV毛細支氣管炎中可能發揮抑制炎癥的作用。Xia等［18］研究發現，多囊卵巢綜合征患者卵巢組織中miR-155 呈高表達，且miR-155 靶向負調控PDCD4，從而促進人卵巢顆粒細胞株（KGN）的增殖、遷移和侵襲。Liu等［19］研究表明，非小細胞肺癌細胞中miR-155表達上調，PDCD4表達下調，表明miR-155可通過直接靶向PDCD4發揮致癌作用。結合本研究，生物信息學分析顯示miR-155 和PDCD4 有結合位點，相關性分析顯示兩者水平呈負相關，提示miR-155與PDCD4共同參與該疾病的進展。

綜上所述，RSV毛細支氣管炎嬰幼兒血清miR-155和PDCD4水平異常表達，兩者呈負相關關系，且其水平與炎性因子密切相關，有望成為早期檢測病情發展的輔助生物標志物。但本研究樣本量偏少，且缺少機制方面的研究，下一步研究將擴大樣本量，補充動物實驗，為RSV 毛細支氣管炎的診治和病情評估提供更加詳實的數據參考。