鵝糞便中特基拉芽孢桿菌和類腸膜魏斯氏菌的分離鑒定

魏 笑，王秋菊，孫 愉，張 昊，李暢洋，陶燕子

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319)

微生物制劑具有維持腸道菌群平衡，分泌益生物質提高動物免疫力，改善食物消化和吸收，誘導免疫反應等優點，為抗菌藥替代物的研發提供了依據和保障，逐漸被人們接受并廣泛應用在養殖業上，以達到預防疾病、促進畜牧業健康發展的目的，因此需要進一步了解其最佳的生長環境及主要的功能。特基拉芽孢桿菌是一種產芽孢的革蘭氏陽性桿菌，嚴格好氧。芽孢桿菌屬產生的芽孢對植物病原體具有抑制能力，研究表明特基拉芽孢桿菌抑菌譜廣，具有較高的生防能力，是天然的抗菌活性物質[1]，尤其對植物的土傳病害——青枯病有良好的防治效果。周瑚等[2]研究發現，特基拉芽孢桿菌有穩定的抑菌作用，對高溫、紫外線和酸堿環境有較強抵抗性，Oberoi等[3]報道，抗菌蛋白的溫度和酸堿度穩定性對其產品的研發應用起關鍵作用，可用特基拉芽孢桿菌制成農藥。孫龍龍[4]研究發現，特基拉芽孢桿菌可以提高鯽的消化能力、抗氧化能力和免疫力，并增加鯽腸道菌群中有益菌的豐度，降低有害菌的豐度。因此特基拉芽孢桿菌具有較強的抗菌、助消化及改善腸道菌群豐度的功能，可以進一步作為功能菌開發利用。魏斯氏菌是一種存在于發酵產品中的革蘭氏陽性乳酸菌，不運動不產生孢子，兼性厭氧，呈不規則的短桿狀。研究表明，類腸膜魏斯氏菌產酸能力高，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有良好的抑制作用[5]。劉韶娜[6]研究表明，類腸膜魏斯氏菌能夠降低豬糞便中的粗蛋白和銨態氮，降低豬的腹瀉率和便秘率，能夠提高腸道內的脂肪酸含量并促進脂類代謝和維生素合成。由此可見類腸膜魏斯氏菌可作為豬飼料添加劑應用，但在禽上的應用還鮮見報道。本試驗擬從鵝腸道中分離芽孢桿菌屬和乳桿菌屬細菌，檢測其最佳生長時間、pH和溫度及其對酸堿度、膽鹽和抗菌藥的耐受性，旨在為后續作為功能菌開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 選取黑龍江省某畜牧場50周齡左右健康的體重為(6.7±1.2)kg的大群散養北方白鵝種鵝30只，在采食30 min后，取糞盒懸掛于鵝的泄殖腔外收集新鮮直腸糞便。將收集的糞便放入裝有冰袋的保溫盒中帶回實驗室。

1.1.2 主要試劑 甘露醇卵黃多黏菌素培養基(HB0248)、MRS培養基(HB0109)、LB肉湯培養基(HB0128)、Mueller-Hinton瓊脂(HB6232)均購自青島海博生物科技有限公司；醋酸鉛培養基(L8490)購自北京索萊寶科技有限公司；羧甲基纖維素鈉培養基購自山東拓普生物工程有限公司。抗菌藥慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環素、頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢噻肟、氨芐西林、克拉霉素、紅霉素、復方新諾明、呋喃妥因、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、萬古霉素均購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.1.3 培養基配制 ①硝酸鹽還原培養基：100 mL蒸餾水中加入1.00 g琥珀酸鈉、0.10 g硝酸鈉、0.10 g磷酸二氫鉀、0.05 g七水硝酸鎂、0.02 g氯化鉀。②淀粉培養基：100 mL蒸餾水中加入2.00 g可溶性淀粉、0.50 g蛋白胨、0.50 g氯化鈉、2.00 g瓊脂，pH 7.0。③酪素培養基：100 mL蒸餾水中加入1.00 g干酪素、0.10 g酵母膏、2.00 g瓊脂。④酸性汞指示劑：100 mL蒸餾水中加入15.00 g氯化汞、20 mL濃鹽酸。配制后，121 ℃高壓滅菌15 min后倒入培養皿中待用。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離 按1 g/只分別稱取30只鵝的糞便，各加入9 mL生理鹽水振蕩混勻，取100 μL混合液加900 μL生理鹽水進行倍比稀釋，取稀釋到10-6、10-7、10-8的菌液各100 μL加入到已配好的MRS固體培養基中，用涂布棒涂抹均勻，37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。用接種環挑取單一菌落重新劃線培養，重復3～4次。

1.2.2 細菌篩選及生化鑒定 通特異性培養基和革蘭氏染色對所得菌株進行形態上的初步篩選，保留形態明顯的菌株。將初篩的細菌純化后分別接種至LB肉湯中培養，再通過硝酸鹽還原、產淀粉酶、產硫化氫、產纖維素酶、產蛋白酶和接觸酶試驗等生化反應進一步篩選。

1.2.3 16S rDNA鑒定 采用煮沸法提取細菌DNA。利用細菌16S rDNA基因通用引物343F：5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R：5′-AGGG-TATCTAATCCT-3′[7]進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL：2×PremixTaq12.5 μL,上、下游引物各1 μL，DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。將得到的PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的大小及濃度，并PCR擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rDNA測序。最后獲得的DNA部分序列與GenBank中參考菌株特基拉牙孢桿菌(Bacillustequilensis)、枯草牙孢桿菌(Bacillussubtitis)等序列進行比對，用Mega 11.0構建進化樹，用MegAlign進行相似性比對。

1.2.4 生長曲線繪制 取100 μL篩選出的分離菌菌液按2.0%接種量分別接種到5 mL LB液體培養基中，以未接種細菌的LB液體培養基為對照，37 ℃、150 r/min搖床中培養，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48 h時取培養液測量D600 nm值，以時間為橫坐標、D600 nm值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.5 細菌培養基酸堿度測定 用HCl和NaOH將LB液體培養基pH調至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，取100 μL篩選出的分離菌菌液按2.0%接種量接種，以未接種菌液的LB液體培養基為空白對照，37 ℃、150 r/min搖床中培養24 h，測量D600 nm值。

1.2.6 細菌適宜培養溫度測定 取100 μL篩選出的分離菌菌液分別接種到5 mL LB液體培養中，分別將溫度調至36.0、36.5、37.0、37.5和38 ℃，以未接種菌液的LB培養基作為空白對照，培養24 h后測量D600 nm值。

1.2.7 酸性和高膽鹽濃度環境下細菌存活率測定 取篩選出的分離菌菌液接至pH=7.0的LB液體培養基中作為耐酸試驗的空白對照，將菌液接至無膽鹽的LB液體培養基中為耐膽鹽試驗的空白對照，分別將菌液接至pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0及膽鹽濃度為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%的培養基中，37 ℃、150 r/min搖床中培養24 h，測定D600 nm值。酸性環境下細菌存活率(%)=各pH組D600 nm值/未經酸處理組D600 nm值×100%；高膽鹽濃度環境下細菌存活率(%)=各膽鹽濃度組D600 nm值/無膽鹽組D600 nm值×100%。

1.2.8 抗菌藥耐受性測定 取100 μL篩選出的分離菌菌液，活菌數>1×109CFU/mL，分別涂布到MH培養基中，用涂布棒涂抹均勻，放置抗菌藥藥片，輕輕壓實，置恒溫培養箱內培養24 h，并用直尺測量抑菌圈直徑，以美國SCLA抗微生物敏感性試驗執行標準M100做比較以判定菌株藥物敏感性(表1)。

表1 藥物敏感性判斷標準

2 結 果

2.1 細菌的分離及生化鑒定

利用MRS培養基分離乳酸菌，在培養基上形成表面光滑的乳白色菌落，革蘭氏染色呈長桿狀、產芽孢的菌體，為革蘭氏陽性菌(圖1A)；芽孢桿菌使甘露醇卵黃多黏菌素培養基變色，在表面形成不透明的白色菌落，革蘭氏染色呈短桿狀、單個或鏈狀排列的菌體，為革蘭氏陽性菌(圖1B)。從30只鵝中共獲得9株菌，3株為乳酸菌(編號1～3)，6株為芽孢桿菌(編號4～9)。由表2生化試驗結果可知，乳酸菌中2號產淀粉酶和纖維素酶，芽孢桿菌中7號產淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶，屬于產酶較多的菌株，因此選擇這2株進行后續試驗，并分別編號為2020V1和2020V2。

A,乳酸菌；B,牙孢桿菌

表2 細菌生化試驗結果

2.2 細菌種屬的鑒定

由圖2可知，1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果表明2株細菌DNA大小均在1 600 bp左右。由圖3、4可知，2020V1菌株和NCBI庫中序列編號KU601351.1的細菌進化距離為100，相似性為99.9%；2020V2菌株和NCBI庫中序列編號MT975238.1的細菌進化距離為100，相似性為99.9%，因此確定2020V1為特基拉芽孢桿菌CC2FG2，2020V2為類腸膜魏斯氏菌JY0R2。

1～4，2020V1；5～9，2020V2；M，DL2000 DNA Marker

圖3 2020V1(A)和2020V2(B)菌株基于16S rDNA基因的進化樹

圖4 2020V1(A)和2020V2(B)菌株相似性比對

2.3 細菌生長曲線

由圖5可知，2020V1菌株的菌液濃度從4 h開始迅速增加，到16 h時到達對數生長期頂峰，隨后進入穩定期，濃度變化不大；2020V2菌株在培養4 h后菌液濃度大幅增加進入對數生長期，18 h時進入生長穩定期濃度不再發生較大波動。因此后續試驗中為獲得最高活菌數，2020V1菌株至少培養16 h，2020V2菌株至少培養18 h。

圖5 2020V1和2020V2菌株生長曲線

2.4 細菌培養基酸堿度測定

由圖6知，2020V1菌株在pH為6.5的環境下生長較好，2020V12菌株在pH為6.0的偏酸性環境下生長狀況良好。

圖6 不同pH下2020V1和2020V2菌株的濃度

2.5 細菌適宜培養溫度測定

由圖7可知，2020V1菌株在環境溫度為36 ℃時D600 nm值最高，且隨著溫度升高D600 nm值逐漸降低；2020V2菌株在36.5 ℃時D600 nm值最高，36.5 ℃前后隨著溫度的降低或升高，D600 nm值均降低。

圖7 不同溫度下2020V1和2020V2菌株的濃度

2.6 酸性和高膽鹽濃度環境下細菌存活率測定

2020V1和2020V2菌株在酸性和高膽鹽濃度濃度環境下的存活率如表3和4所示。由表3可知，在pH=3.5環境下2株菌均能生長繁殖，且存活率超過半數，說明2株菌都具有耐酸能力。由表4可知，2020V1菌株能在1.5%膽鹽濃度環境下生長繁殖，且存活率超過半數，2020V2菌株在1.2%膽鹽濃度環境下存活超過半數，說明2株菌均具有較好的耐膽鹽能力，且2020V1菌株的耐受力高于2020V2菌株。

表3 不同pH環境下2020V1和2020V2菌株的存活率

表4 不同膽鹽濃度下2020V1和2020V2菌株的存活率

2.7 抗菌藥耐受性的測定

由表5可知，20202V1菌株對頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢噻肟、氨芐西林、呋喃妥因、環丙沙星、慶大霉素和四環素不敏感；對氧氟沙星、諾氟沙星、卡那霉素、鏈霉素、克拉霉素、紅霉素、復方新諾明和萬古霉素敏感。2020V2菌株對頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢噻肟、氨芐西林、復方新諾明、萬古霉素、慶大霉素和鏈霉素不敏感；對呋喃妥因、四環素、卡那霉素中度敏感；對氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、克拉霉素和紅霉素敏感。

表5 2020V1和2020V2菌株藥物敏感試驗結果

3 討 論

特基拉芽孢桿菌和類腸膜魏斯氏菌均屬于畜牧生產益生菌[8-9]，也是組成畜禽腸道微生物群落重要的成員。Pradhan等[10]研究發現，特基拉芽孢桿菌可通過產生脂肽及生物表面活性劑等物質破壞病原菌的生物膜，從而起到抑菌作用。特基拉芽孢桿菌可提高血清溶菌酶、脂肪酶和肝臟谷丙轉氨酶的活性，從而達到促進消化、提高免疫的作用[11]。在自然界中類腸膜魏斯氏菌是一類廣泛分布于肉類、新鮮果蔬、發酵食物、青貯飼料中的乳酸菌[12]，其可廣泛定植于宿主腸道[13-14]。研究發現，魏斯氏菌應用于食品發酵時，可合成葡聚糖和果聚糖等低聚糖，這些低聚糖可促進人體對微量元素的吸收，減輕人體腸胃不適，促進雙歧桿菌增殖[15]。本試驗中，2020V1菌株屬于芽孢桿菌屬中的特基拉芽孢桿菌，2020V2菌株屬于乳酸菌屬中的類腸膜魏斯氏菌，2株菌均具有較強的耐酸耐膽鹽能力，能夠在腸道中定植并發揮作用，并能與部分抗菌藥聯合用藥。

2020V1和2020V2菌株作為微生物制劑的潛在益生菌，需測定其生長特性和耐酸耐膽鹽能力以確定能否經過口腔進入消化道，通過胃液和膽汁最終定植并發在腸道發揮作用。2020V1和2020V2菌株在pH為3.5環境下存活率分別為81.5%和87.6%，在膽堿濃度為1.2%環境下存活率分別為69.2%和50.6%，均超過pH=7和無膽鹽組半數，證明2種微生物可以通過胃酸和膽汁且活菌數仍然保持在正常范圍，說明其能夠順利定植在腸道發揮作用，這與樊炳君等[16]和李文等[17]試驗結果相符。2020V1菌株的生長特性研究結果表明，在4 h達到對數生長期，在36 ℃、pH為6.5的環境下培養較好，這與王旭[18]的生長特性研究一致。2020V2菌株的生長特性結果表明，在4 h達到對數生長期，在36.5 ℃、pH為6的環境下進行培養最為適宜，與高靜等[19]研究結果相符合。

為確定2020V1和2020V2菌株對抗菌藥的耐受性，采用美國SCLA抗微生物敏感性試驗執行標準M100作為耐藥、敏感和中介值進行判定。選擇與抗菌藥同時使用時，注意選擇那些可相容的抗菌藥，試驗結果顯示，2020V1菌株能耐受部分β-內酰胺類、硝基呋喃類、喹諾酮類、氨基糖苷類、四環素類抗菌藥，與郭佳等[20]研究的芽孢桿菌菌抗菌藥耐受部分結果一致，部分結果不同可能是因為菌種雖然同屬但不同種，微生物自身攜帶的耐藥基因不同所導致，這需要后續試驗來證明；2020V2菌株能耐受部分β-內酰胺類、磺胺類、糖肽類、氨基糖苷類抗菌藥，這與部分乳酸菌對抗菌藥耐受性結果一致。在本研究中，通過分離得到2020V1和2020V2 2株益生菌，其對抗菌藥具有不同程度的耐受性，可為將來在動物治療過程中抗菌藥的選用提供理論依據。

4 結 論

本研究成功從健康成年北方白鵝直腸糞便中分離到9株細菌，生化試驗鑒定為特基拉芽孢桿菌CC2FG2和類腸膜魏斯氏菌JY0R2，2種菌均具有耐酸、耐膽鹽的特性。特基拉芽孢桿菌CC2FG2能與β-內酰胺類、喹諾酮類和四環素類四環素聯合使用；類腸膜魏斯氏菌JY0R2能與β-內酰胺類、磺胺類、糖肽類、氨基糖苷類聯合使用。該結果可為鵝源功能菌的研發及其對抗菌藥的選用提供思路。