球孢白僵菌侵染普通齒蛉幼蟲的顯微觀察和感病癥狀

袁靖澤，馮毅，曹成全，陳浩

（1.吉首大學生物資源與環境科學學院,湖南 吉首 416000;2.西北農林科技大學植物保護學院,陜西 楊凌 712100;3.樂山師范學院生命科學學院,四川 樂山 614004）

廣翅目Megaloptera齒蛉科Corydalidae巨齒蛉屬與大型齒蛉屬的幼體被通稱為“爬沙蟲”（曹成全，2014），是一類珍稀的藥食兩用昆蟲（楊冬梅等，2012；石晏丞等，2019），在四川攀西地區有上百年的食用歷史（曹成全等，2019），產業價值極高。但近年來，自然環境破壞和濫捕等因素造成了野生爬沙蟲數量驟減，因此，人工繁育爬沙蟲刻不容緩。

普通齒蛉為中國廣布種（劉星月，2008），具有個體大、分布地域廣、數量多等優點，成為人工繁育爬沙蟲的重點種類。普通齒蛉的生活史較長，1～2年發生1代，幼蟲期占整個生活史的絕大部分，需要經過10～12個齡期才能化蛹和羽化成蟲。在人工養殖過程中發現，普通齒蛉幼蟲死亡率較高，被菌類侵染是死亡原因之一，且普通齒蛉幼蟲一旦相遇，極易發生打斗行為，進而在蟲體表面產生嚴重程度不一的創傷，這些創傷成為了菌類侵染的易感區域。

前期養殖實踐和試驗發現，寄主范圍較廣的蟲生寄生菌——球孢白僵菌易侵染普通齒蛉幼蟲并造成蟲體大量死亡。本文對球孢白僵菌侵染普通齒蛉幼蟲體表與傷口進行了詳細的研究，為了解侵染機理及防治球孢白僵菌侵染普通齒蛉幼蟲進而提高養殖成活率提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和蟲體

供試菌株購自山西綠海農藥科技有限公司。菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）的斜面上進行分離并培養7 d左右，4℃儲存。供試普通齒蛉末齡幼蟲由樂山師范學院昆蟲資源研發基地提供。

1.2 球孢白僵菌孢子懸浮液的配置

將供試菌種轉接在PDA平板培養基上，在25℃、光周期12L∶12D的條件下培育至10 d，待大量產孢后，4℃保存備用。實驗時，用滴管向PDA培養器（直徑9 cm）中添加0.03%吐溫80無菌水3～5 mL，然后用滅菌后的接種環刮取平板表面上孢子，每次刮取3～4個平板。將得到的菌液注入250 mL燒杯中并用磁力攪拌器攪拌40 min。待孢子全部散開后，再用雙層醫用方紗濾出菌液，得到孢子懸浮液母液。用血球計數器計數每毫升母液的分生孢子含量，然后用0.03%吐溫80無菌水將其配制為1×10個/mL的供試孢子懸濁液。

1.3 普通齒蛉接菌方法

將普通齒蛉迅速置于底部直徑10 cm、頂部直徑12 cm、高8 cm的玻璃缸中，再用裝滿供試孢子懸濁液的自動噴霧器，將菌液噴至供試蟲體表（每只試蟲均勻噴灑）。當缸底菌液完全浸沒蟲體后，快速地把經過處理后的蟲體置于底面墊有海綿的玻璃杯（底面口徑10 cm、頂端口徑12 cm、高9 cm），25℃、相對濕度85%培育，8 h后撿出死亡的蟲體。

1.4 感染球孢白僵菌的普通齒蛉幼蟲掃描電鏡樣品制備

每6 h在處理后的幼蟲中選10頭活蟲，經3%戊二醛溶液固定過夜，再用PBS緩沖液浸洗3次，10 min/次；分別用50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐層脫水，每級10 min，其間用100%乙醇脫水處理2次。用醋酸正戊酯置換2次，每次停留15 min。最后用CO臨界點干燥2 h。取出試樣，噴金（李庚午，1994）。在掃描電子顯微鏡（S-3400N，Hatachi）下觀察并拍攝。

1.5 普通齒蛉幼蟲感病癥狀

將30頭普通齒蛉末齡幼蟲用1.3中的接菌方法侵染。每12 h觀察是否出現感病癥狀，記錄感病癥狀以及死亡時間，統計各感病癥狀出現時間以及蟲體數量。

1.6 普通齒蛉幼蟲傷口侵染與拍照

將30頭普通齒蛉末齡幼蟲放入玻璃缸（長40 cm×寬20 cm×高10 cm）中使其互相打斗，每隔30 min觀察1次，挑選出傷口在背部1～3腹節、長度為2～4 mm的試蟲，每拿出1頭蟲就補充1頭新蟲。將20頭受傷試蟲平均分為2組，每隔24 h對其傷口進行拍照，觀察并記錄其恢復情況。其中1組使用供試孢子懸浮液侵染傷口（受傷后立刻侵染），用膠頭滴管吸取供試孢子懸浮液，在每頭蟲傷口部位滴5滴，每隔24 h對其傷口進行拍照，觀察并記錄侵染與恢復情況。

因傷口脫水后會變形，無法進行電鏡掃描，故使用LY-WN超清顯微系統進行拍照。因拍照時需要殺死試蟲，故無法選取同一只蟲進行不同時間球孢白僵菌入侵狀態的拍攝，所以選擇傷口位置、大小盡量一致的不同試蟲拍照。

2 結果與分析

2.1 球孢白僵菌侵染普通齒蛉幼蟲體表的部位、時間和入侵方式

在普通齒蛉幼蟲接種球孢白僵菌后，分生芽孢在節間膜處（圖1：A）、體壁凹陷處（圖1：B）、體壁管狀凸起處（圖1：C）、剛毛窩附近（圖1：D，E）粘附；8 h后，分生孢子就已開始萌發并形成芽狀凸起，繼而形成芽管（圖 1：F，G）；接種后 12 h內，已有較多芽管穿透幼蟲的體壁（圖1：H）；而接種18 h后，幼蟲體表位于節間的分生孢子已經萌發侵入表皮（圖1：H～L）。

圖1 球孢白僵菌分生孢子在普通齒蛉幼蟲體表的附著部位觀察Fig.1 Attachment sites of Beauveria bassiana conidia on the body surface of Neoneuromus ignobilis larvae

球孢白僵菌對普通齒蛉幼蟲的入侵主要包含了孢子粘附、萌發、透過體壁和細胞發育與繁殖等階段。球孢白僵菌的分生孢子和試蟲體表的接觸與粘附并非單純的物理接觸，而是一個生物相互作用的過程，在普通齒蛉幼蟲體表各個區域，球孢白僵菌的入侵也具有一定差別，一般分為2種方式：（1）通過芽管直接入侵：分生孢子吸水膨脹開始萌發，并在孢子的一端生成芽狀凸起，萌發后直接入侵節間膜以及體表有縫隙的薄弱部位（圖2：A）；（2）產生附著胞后進行入侵（圖2：B，C）：這種情況一般是在體壁較厚的部位發生，分生孢子萌發后，伸出芽管沿體壁生長（圖2：D），芽管生長過程中如遇適宜部位，則會生成附著胞向體壁入侵。接種后48～60 h，附著在體壁較厚部位如背部凸起等的孢子均萌發并侵入表皮（圖2：E，F）；在接種96 h左右后，體表產生大量菌絲（圖2：H，I）。

圖2 分生孢子在普通齒蛉幼蟲體表上不同部位的入侵Fig.2 Invasion of conidia on different parts of the body surface of Neoneuromus ignobilis larvae

同一時期侵染球孢白僵菌的普通齒蛉幼蟲中，在體表節間膜部位的分生孢子首先萌發，而且比其他區域的芽管和菌絲更長，說明球孢白僵菌具有選擇性地對蟲體表皮侵染，因蟲體薄弱環節為節間膜，所以球孢白僵菌侵染的部位也大多在此。

2.2 普通齒蛉幼蟲感染球孢白僵菌后的感病癥狀

正常普通齒蛉幼蟲在感染球孢白僵菌24 h時，10.00%出現反應遲鈍、身體麻痹的癥狀；48 h時，76.67%出現反應遲鈍的癥狀，且有少數死亡；72 h時，66.67%身體變柔軟，這種癥狀持續時間最長（圖3：A）；96 h時，死亡數量逐步增多，且蟲體僵硬數量最多，占50.00%；感染108 h后，開始產生菌絲；感染120 h后，60.00%產生菌絲，此時死亡數量最大（83.33%）。帶有傷口的普通齒蛉幼蟲在感染球孢白僵菌后，死亡數量高峰比沒有傷口的正常試蟲提前約12 h，在108 h時，累計死亡數量達到總數的73.33%（圖3：B）。帶有傷口但未感染球孢白僵菌的試蟲幾乎不會因為受傷而死亡，除了傷口超過5 mm時因體內組織流出而死亡。

圖3 普通齒蛉幼蟲感染球孢白僵菌感病的反應（A）與死亡數（B）Fig.3 Response(A)and mortality(B)of Neoneuromus ignobilis larvae challenged by Beauveria bassiana

2.3 普通齒蛉幼蟲傷口感染球孢白僵菌后的感病癥狀

接菌后24 h內，試蟲的外表和對觸碰的反應與正常蟲體均無差別（圖4：A，B）；48 h后，反應遲鈍、麻痹；72～120 h后，開始死亡，剛死去時軀體柔軟，但隨后身體漸漸僵硬，且隨著時間推移死亡率逐步上升。部分剛死去的蟲體表面被密集生長的白色菌絲所掩蓋，而部分蟲體表層未見菌絲，但傷口部位有明顯的菌株且凸起明顯（圖4：C，D），與未感染球孢白僵菌的傷口有很大差異。

圖4 普通齒蛉幼蟲感染后的傷口愈合情況Fig.4 Wound healing of Neoneuromus ignobilis larvae after infection

2.4 普通齒蛉幼蟲傷口愈合情況

普通齒蛉幼蟲打斗受傷后24 h，傷口不再有液體流出并開始結痂（圖5：A）；48 h后，傷口黑色變淡，并開始出現1層半透明薄膜（圖5：B）；72 h后，傷口逐漸恢復，凹陷逐漸減輕（圖5：C）；120 h后，傷口幾乎復原，只有受傷后的痕跡和1個很小的黑色疤痕（圖5：D）。這類傷口在恢復期幾乎全是凹陷，隨著時間推移，傷口逐漸平整。

圖5 普通齒蛉幼蟲的傷口愈合情況Fig.5 Wound healing of uninfected Neoneuromus ignobilis larvae

3 結論與討論

本研究結果和之前的研究都表明節間膜是蟲生真菌侵入的主要部位（張愛文等，1994；王曉紅等，2009；鄧彩萍等，2012），這可能是因為節間膜較薄，有利于菌絲的穿透。球孢白僵菌孢子在各種幼蟲蟲體表面平緩的體壁區產生附著胞，而有的則以粗度和菌絲大小一致的芽管形式進入，進入后還帶有主動尋求適合侵染位點的功能，在不適合的體表部位又進行了平行繁殖，直到遇到適合的侵染位點才發生侵染，說明球孢白僵菌對進入普通齒蛉幼蟲的表皮部位存在一定的選擇性，這或許與各個部位的表面構造不同有關。研究結果表明，正常蟲體分生孢子萌發的時間大約為12 h，在24 h左右時，大部分分生孢子侵入蟲體，感染傷口的普通齒蛉幼蟲與感染正常蟲體的試蟲死亡時間提前約12 h。在傷口的位置，球孢白僵菌侵入速度更快，可能是與傷口部位較為粗糙、適合分生孢子的附著，以及不需要再尋找較薄的表皮即可侵入蟲體有關。

應用球孢白僵菌進行生物防治時發現，昆蟲蟲齡越小，越易感病（季香云，楊長舉，2003；仝亞娟等，2010；賀然等，2020）。普通齒蛉生活史較長，可達1～2年（劉星月，2008），易成為白僵菌的寄主。學者對球孢白僵菌侵染昆蟲寄主過程的研究一般著眼于如何殺滅昆蟲，用于生物防治，且研究對象多為陸生昆蟲（王曉紅等，2008；王龍江等，2010；王雅卉等，2011；張艷梅等，2011；曹慶杰等，2015；申宇等，2018；劉忱，郭志紅，2019），但旨在避免球孢白僵菌侵染昆蟲（尤其是水生昆蟲），從而提高資源昆蟲養殖成活率的研究鮮有。本文選取具有代表性的水生資源昆蟲——普通齒蛉為研究對象，研究了球孢白僵菌侵染正常試蟲體表和傷口的過程和感病情況，對降低普通齒蛉人工養殖過程中因球孢白僵菌侵染而造成的死亡提供了理論依據，也豐富了球孢白僵菌侵染不同生態類型昆蟲的研究。