過敏性紫癜患兒外周血miR-223 NLRP3表達及臨床意義

黃麗芳 劉景珍 徐江維 饒 媚 謝 根

過敏性紫癜(henoch-schonlein purpura，HSP)也稱為免疫球蛋白A(immanoglobulin A,IgA)血管炎[1]，是一種IgA介導的疾病，該病在2～6歲的兒童中最常見，最顯著的特征是紫色皮疹，通常出現在小腿和臀部，還可引起腹痛和關節疼痛[2]。如不能及時診斷并治療可出現持續性紫癜或關節炎及進行性腎損傷等[3]。目前HSP的確切病因尚不清楚，因此了解HSP的相關重要因素進行早期診斷、加強防治，對臨床工作具有重要意義。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)是一種炎性相關因子，可以誘導NLRP3炎性小體的形成，NLRP3炎癥小體不僅在先天免疫中起關鍵效應器的作用，還會引發炎癥疾病中相關促炎細胞因子的產生[4]。miR-223首次在造血系統中被識別，在骨髓體系中特異性表達，目前認為其在多種炎癥疾病中發揮作用。有研究[5]表明，NLRP3的表達可被miR-223調控，但二者在HSP患兒中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在通過檢測HSP患兒外周血中NLRP3、miR-223的水平變化，探討二者在HSP中的關系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年7月至2020年5月在恩施土家族苗族自治州中心醫院就診并確診為HSP的患兒60例，其中男性患兒28例，女性患兒32例，年齡5～10歲，平均(8.60±3.50)歲。選取60例同期來本院體檢的健康兒童為對照組，其中男性患兒30例，女性患兒30例，年齡5～12歲，平均(8.65±2.70)歲。HSP組和對照組的性別、年齡比較，差異無統計學意義(χ2=0.133，t=0.088，P>0.05)，具有可比性。HSP組納入標準：①所有患兒符合諸福棠主編第8版《實用兒科學》[6]中小兒HSP診斷標準；②首次發病；③入院前未使用激素、免疫抑制劑等相關藥物治療。排除標準：①患有紅斑狼瘡或其他自身免疫性疾病者；②有凝血功能障礙者；③臨床資料不完整。本研究所有樣品采集均取得受試者知情同意，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 實時熒光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：MA-5000，蘇州雅睿生物技術股份有限公司)；全自動高速分析分選流式細胞儀(貨號：DLK0002866，美國BD公司)；全自動生化分析儀(型號：CH930，上海聚慕醫療器械有限公司)；RNA提取試劑盒(貨號：YT9197，北京伊塔生物科技有限公司)；反轉錄試劑盒(貨號：YT9036，北京伊塔生物科技有限公司)；AceQ qPCR SYBR?Green Mix(貨號：Q511-02/03，南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；miScript SYBR? Green qPCR Kit(貨號：QP071，美國GeneCopoeia)；人NLRP3 酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(貨號：EH4202，武漢菲恩生物科技有限公司)。

1.2.2 標本采集 兩組研究對象均空腹采集外周血5 mL，放至室溫靜置15 min后，一部分將其放入離心機，采用3 000 r/min離心處理30 min，取上層血清置于-80℃保存備用。另一部分采用Ficoll分離液分離外周血單個核細胞，用于流式細胞術檢測。

1.2.3 ELISA法檢測外周血中NLRP3測定 采用ELISA法檢測各組外周血中NLRP3的表達水平，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 qRT-PCR法檢測外周血中miR-223水平 取上層血清標本200 μL，Tizol法提取總RNA，再取1 μg總RNA作為模板進行反轉錄，獲得cDNA。反應體系為：正、反向引物各1 μL，無RNA酶的滅菌水3 μL，Mix 10 μL，50 ng/μL的cDNA模板1 μL。反應步驟：95℃下預變性3 min，然后95℃，30 s；95℃，10 s；60℃，30 s的條件進行，共設40個循環，所有條件均按照檢測系統嚴格進行。采用2-ΔΔCT法對血清miR-223表達水平進行定量分析。miR-223及內參U6的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 觀察指標 采用免疫比濁法檢測外周血中IgA、IgG、IgM免疫球蛋白水平；采用流式細胞儀對T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+進行檢測，并計算CD4+/CD8+。檢測并比較兩組對象外周血免疫球蛋白和T細胞亞群水平差異。

2 結果

2.1 兩組研究對象免疫學指標水平比較 HSP組與對照組CD3+表達比較,差異無統計學意義(P>0.05)。HSP組患兒外周血中IgA、IgG、IgM、CD8+水平均高于對照組，CD4+、CD4+/CD8+水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象一般資料及免疫學指標水平比較

2.2 兩組研究對象外周血中NLRP3和miR-223水平比較 HSP組NLRP3表達水平低于對照組， miR-223水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組研究對象外周血中NLRP3、miR-223表達水平

2.3 NLRP3和miR-223表達與免疫功能指標的相關性分析 NLRP3和miR-223分別與IgA、IgG、IgM、CD8+、CD4+、CD4+/CD8+進行相關性分析，結果表明，外周血NLRP3與IgA、IgG、IgM、CD8+均呈正相關(P<0.05)，與CD4+、CD4+/CD8+呈負相關(P<0.05)；miR-223與CD4+、CD4+/CD8+均呈正相關(P<0.05)，與IgA、IgG、IgM、CD8+呈負相關(P<0.05)。見表4。

表4 HSP組NLRP3和miR-223表達水平與免疫功能指標的相關性

2.4 HSP患兒外周血中NLRP3、miR-223表達的相關性 Pearson法分析結果顯示，HSP患兒外周血中NLRP3、miR-223表達呈負相關，差異有統計學意義(r=-0.340，P<0.05)，見圖1。

圖1 HSP患兒外周血中NLRP3、miR-223表達相關性分析

2.5 外周血中NLRP3、miR-223水平對HSP發生的診斷價值 ROC曲線分析顯示，外周血miR-223、NLRP3水平預測HSP患兒的AUC分別為0.974(95%CI：0.928～0.995)、0.956(95%CI：0.902～0.985)，對應的敏感度分別為98.33%、83.33%，特異度分別為88.33%、96.67%，外周血miR-223、NLRP3水平聯合預測HSP患兒的AUC為0.987(95%CI：0.947～0.999)，敏感度為98.33%，特異度為90.00%。見圖2。

圖2 NLRP3、miR-223單獨及聯合診斷HSP疾病的ROC曲線

3 討論

HSP是兒童時期最常見的全身性血管炎，它的特點是在小血管中存在IgA為主的免疫沉積物[7-8]。這些免疫沉積物可以激活中性粒細胞并增加炎性細胞因子的產生，從而引起皮膚、腸道和腎臟的變化[9]。HSP的發病誘因涉及免疫紊亂、感染以及藥物反應等多個方面，該病早期實驗室檢查對HSP的診斷特異性較低，對癥狀不明顯的患兒容易出現漏診、誤診[10]，嚴重威脅患兒的生命安全。

miRNA是長度約為21～25 nt的內源性非編碼RNA小分子。據報道[11]，miRNA在多種自身免疫性疾病中表達失調，在維持免疫穩態中起著至關重要的作用。miR-223定位于Xq12，參與造血系統分化過程，研究[12]表明，miR-223與機體免疫反應、造血功能等過程密切相關，參與了多種疾病發展進程，包括癌癥、炎癥以及自身免疫性疾病等。本研究中HSP患兒外周血中miR-223水平明顯低于對照組，HSP患兒的免疫功能指標IgA、IgG、IgM、CD8+表達水平均高于健康兒童，CD4+、CD4+/CD8+表達均低于健康兒童，miR-223與IgA、IgG、IgM、CD8+呈負相關，與CD4+、CD4+/CD8+呈正相關，提示HSP患兒體內免疫功能發生紊亂，miR-223表達降低與HSP的發生發展相關。ROC結果顯示，miR-223水平預測HSP的AUC為0.974，對應的敏感度為98.33%，特異度為88.33%，表明miR-223可能參與HSP疾病的發生，且可在一定程度上評估HSP的發生。

NLRP3是體內固有免疫的重要組分，由細胞內多種蛋白復合物組成，在炎癥反應中有重要作用[13-15]。譚之能等[16]研究的表明，NLRP3在慢性阻塞性肺病患者外周血中的水平升高，其水平變化與疾病嚴重程度密切相關。王瑾等[17]報道了miR-223可靶向作用NLRP3，減輕大鼠腎臟損傷。本研究中HSP患兒外周血中NLRP3表達水平明顯高于對照組，外周血NLRP3水平與IgA、IgG、IgM、CD8+呈正相關，與CD4+、CD4+/CD8+、miR-223表達水平呈負相關，與既往研究文獻報道一致，提示NLRP3可能通過調控miR-223參與HSP的病理過程。ROC結果顯示，NLRP3水平預測HSP的AUC為0.956，對應的敏感度為83.33%，特異度為96.67%， miR-223、NLRP3二者聯合預測HSP患兒的AUC為0.987(95%CI：0.947～0.999)，敏感度為98.33%，特異度為90.00%，二者聯合聯測高于單一指標。推測二者在HSP病情進展中的可能作用為：miR-223在病理作用下表達水平降低，減弱了NLRP3炎性體的抑制作用，并使其表達水平升高，二者之間存在某種負反饋機制，與以往研究結果相符合[18-19]。而NLRP3是免疫應答的重要組成部分，其異常高表達會誘導多種炎性因子分泌，尤其是IgA的升高，進而引起小血管炎癥，導致皮膚、腸道和腎臟的變化，最終發生HSP。

綜上所述，NLRP3在HSP患兒外周血中高表達，miR-223低表達，二者呈顯著負相關，參與兒童HSP的發生，還可作為HSP疾病的早期診斷指標，具有重要的臨床意義。但NLRP3、miR-223在HSP的發生的機制有待進一步研究，需要進一步擴大樣本量。