響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳新品種森盛1號液體發(fā)酵條件

解修超， 賈 嬌， 宋 玉， 謝海彬， 鄧百萬， 孫 婭， 徐易潔

(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000； 2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中 723000；3.漢中植物研究所，陜西漢中 723000)

黑木耳()作為擔(dān)子菌門中重要的藥食同源真菌，含有豐富的氨基酸、多糖、黑色素和維生素等成分，具有增強機體免疫功能、補血、補腦、抗衰老、抗凝血和抑制腫瘤生長等保健效果和藥用功效，是維持人體健康的絕佳食材。近年來，隨著“菌糧”等新名詞的出現(xiàn)，黑木耳在人類健康重要性中的體現(xiàn)越為明顯。

黑木耳作為食藥兩用真菌，在我國的國民經(jīng)濟、人類健康中展現(xiàn)出巨大的開發(fā)前景。從藥用角度來講，主要是黑木耳天然藥物活性成分的提取、分離純化以及相關(guān)藥品、保健品的開發(fā)等；然而，目前市場上的相關(guān)藥品甚少，部分產(chǎn)品只是局限于動物試驗測試。從食用角度來講，我國是世界黑木耳產(chǎn)量最多、食用最多的國家。近年來，黑木耳已成為我國栽培量第二大的食用菌品種，但各個產(chǎn)地生產(chǎn)的黑木耳品質(zhì)參差不齊，具有優(yōu)良性狀的黑木耳新品種更是少見。

秦巴山區(qū)是我國黑木耳的主要產(chǎn)地之一，其獨特的溫潤氣候條件造就了當(dāng)?shù)睾谀径百|(zhì)厚、肉嫩、味美”的品質(zhì)。黑木耳是秦巴山區(qū)主栽食用菌之一，該地區(qū)現(xiàn)在的傳統(tǒng)栽培方式相較于近年來發(fā)展的液體種栽培技術(shù)顯得十分低效，在一定程度上限制了區(qū)域產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展。研究表明，食用菌液體菌種的生產(chǎn)周期短、菌齡整齊、接種簡便、接種點多、發(fā)菌快且不易污染，是解決栽培效率低下的有效途徑之一。目前，有關(guān)黑木耳液體發(fā)酵工藝的報道甚少，并且由于菌種、培養(yǎng)條件及其優(yōu)化方法等因素的差異，所得到的液體菌種品質(zhì)的差別較大。唐業(yè)剛采用單因子試驗和正交試驗對毛木耳998菌種液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化試驗，所得菌絲轉(zhuǎn)化量干質(zhì)量為15.17 g/L。謝意珍等利用正交試驗對黑木耳AU-5菌種液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化試驗，所得菌絲轉(zhuǎn)化量干質(zhì)量為26.5 g/L。研究表明，相較于正交方法，響應(yīng)面方法能真實地反映各影響因素間的交互作用，并能得到較好的試驗結(jié)果。

本研究以黑木耳新品種森盛1號為試驗材料，在前期研究的基礎(chǔ)上，擬先通過Plackett-Burman試驗從可能影響其菌絲生物量的9個因素[馬鈴薯含量、葡萄糖含量、麥麩含量、蛋白胨含量、磷酸二氫鉀(KHPO)含量、七水硫酸鎂(MgSO·7HO)含量、初始pH值、接種量、溫度]中篩選出顯著性因素；再通過最陡爬坡試驗得到最佳響應(yīng)區(qū)域；最后采用Box-Behnken設(shè)計對顯著性因素做響應(yīng)面試驗，并通過分析和驗證得到最優(yōu)的液體發(fā)酵工藝條件，為黑木耳或其他食用菌的液體菌種生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 森盛1號黑木耳菌株由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心選育。

1.1.2 主要試劑 葡萄糖、KHPO、MgSO·7HO等均為分析純，馬鈴薯和麥麩(均為食品級)市購，蛋白胨和瓊脂購自北京百奧萊博科技有限公司，試驗用水為純化水。

1.1.3 主要儀器 LS-B50L型高壓蒸汽滅菌鍋(上海醫(yī)用核子儀器廠)、ZHWY-2102C型數(shù)顯式恒溫?fù)u床(上海志成有限公司)、TB-214型電子分析天平(北京賽得利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、LRH-250-GS型數(shù)顯式恒溫培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)、101A-3E型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海試驗儀器廠有限公司)、SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.1.4 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基(CPDA)：液體母種培養(yǎng)基，為不添加瓊脂的CPDA培養(yǎng)基；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、麥麩10.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、KHPO2.0 g/L、MgSO·7HO 1.0 g/L，初始pH值自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化及其液體母種的制備 將森盛1號黑木耳菌株接種于PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)至滿管，備用。取0.5 cm大小的斜面菌塊接種于液體母種培養(yǎng)基，靜置24 h后于28 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng) 6 d 備用。

1.2.2 菌絲干質(zhì)量的測定 抽濾收集菌絲體，純化水洗滌3～5次后，60 ℃烘干至恒質(zhì)量，電子分析天平稱質(zhì)量。

1.2.3 Plackett-Burman試驗 根據(jù)前期預(yù)試驗選定適合森盛1號菌株生長的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并根據(jù)培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件選取9個因素(馬鈴薯含量、葡萄糖含量、麥麩含量、蛋白胨含量、KHPO含量、MgSO·7HO含量、初始pH值、接種量、溫度)作為研究對象，設(shè)計Plackett-Burman試驗，各因素取值見表1。根據(jù)各試驗組中不同因素組合配制培養(yǎng)基(每組設(shè)置3個重復(fù))，接液體母種并靜置 24 h，振蕩培養(yǎng)8 d后測定菌絲干質(zhì)量，取平均值，結(jié)果借助Minitab 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 Plackeet-Burman試驗設(shè)計各因素及水平

1.2.4 最陡爬坡試驗 根據(jù)Plackett-Burman試驗設(shè)計中各個顯著影響因素效應(yīng)的大小，確定對菌絲干質(zhì)量影響顯著的因素。其中，影響顯著的正效應(yīng)因素的值逐漸增加，影響顯著的負(fù)效應(yīng)因素的值逐漸減小，設(shè)計最陡爬坡試驗方案，使結(jié)果逼近最佳響應(yīng)區(qū)域。

1.2.5 Box-Behnken試驗及回歸模型分析 在最陡爬坡試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，采用A(葡萄糖含量)、B(KHPO含量)、C(初始pH值)進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗。試驗因素水平編碼見表2。采用Design-Expert 12.0軟件對Box-Behnken試驗結(jié)果進(jìn)行分析并建立回歸模型，根據(jù)模型預(yù)測其最佳工藝條件組合。

喬十二郎是一個瘦弱少年，沉默寡言，初一看并不起眼，然而目光堅毅，異乎常人，更為奇特的是，額頭被寬寬的布帶纏著。秦鐵崖看看對方眉眼，一邊眼角偏高，隨即推測出對方額角曾被焰火燒傷，留下永久疤痕，疤痕愈合不好，把一邊眼角牽引上去。這么想時，秦鐵崖心頭有些沉重。算起來，這孩子才十四歲。

表2 3因素3水平Box-Behnken試驗設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗結(jié)果

選用試驗次數(shù)=12的 Plackett-Burman試驗設(shè)計方案，考察、等9個因素(每個因素取2個水平)對菌絲干質(zhì)量的影響，結(jié)果見表3和表4。

表3 Plackeet-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值

從表3和表4可以看出，對森盛1號菌絲干質(zhì)量影響的顯著因素分別是葡萄糖含量()、KHPO含量()、初始pH值()。其中，、增加時，菌絲干質(zhì)量顯著增加(<0.05)，為正效應(yīng)因素；而增加時，菌絲生物量顯著降低，為負(fù)效應(yīng)因素。另外，蛋白胨含量、溫度、麥麩含量增加時，菌絲干質(zhì)量有一定增加，其取值應(yīng)為高水平(表1)；接種量、馬鈴薯含量、MgSO·7HO含量增加時，菌絲干質(zhì)量量反而減少(>0.05)，其取值應(yīng)為低水平(表1)。因此，選取不顯著因素(馬鈴薯200.0 g/L、蛋白胨4.5 g/L、麥麩15.0 g/L、MgSO·7HO 1.0 g/L、溫度28.0 ℃、接種量4%)為發(fā)酵工藝的基本參數(shù)，將顯著性因素(葡萄糖含量、KHPO含量和初始pH值)作為最陡爬坡試驗的考察對象。

表4 Plackett-Burman試驗分析結(jié)果(已編碼單位)

2.2 最陡爬坡試驗結(jié)果

響應(yīng)面擬合只有先逼近最佳響應(yīng)區(qū)域才能最好地反映真實情況，將、逐步增加，逐步減小，最陡爬坡試驗結(jié)果詳見表5。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

從表5可以看出，隨著、逐步增加，以及逐步減小，森盛1號菌絲干質(zhì)量呈現(xiàn)先增大后減少趨勢。當(dāng)葡萄糖含量45.0 g/L、KHPO含量 4.5 g/L、pH值4.5時，森盛1號菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大(13.1 g/L)。因此，第4組為最佳響應(yīng)區(qū)域，可作為Box-Behnken試驗的考察對象。

2.3 Box-Behnken試驗結(jié)果

以A(葡萄糖含量)、B(KHPO含量)和C初始(初始pH值)為考察對象，根據(jù)Box-Behnken原理和表2，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，考慮各因素間的交互作用對森盛1號菌絲干質(zhì)量的影響，試驗及分析結(jié)果見表6和表7。

表6 Box-Behnken試驗結(jié)果

采用Design Expert 12.0軟件對17個試驗點的菌絲干質(zhì)量()進(jìn)行回歸統(tǒng)計分析，得出二次模型回歸統(tǒng)計分析表(表7)。

表7 回歸分析結(jié)果

=2026+169+242+269+11725-108+0335-4125-3848-3603。

2.4 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)回歸方程繪制隨各因素(葡萄糖含量、KHPO含量和初始pH值)變化的響應(yīng)曲面圖，當(dāng)響應(yīng)面圖的坡度越陡峭時，等高線越密集，等高線呈扁圓形時，兩因素交互作用較顯著。由此分析，葡萄糖含量、KHPO含量和初始pH值等3個因素對菌絲干質(zhì)量的影響(圖1、圖2、圖3)。每個響應(yīng)曲面分別代表著2個獨立因素間的相互作用，其余因素均保持在編碼水平的0水平。

由圖1可知，A和B的交互作用較顯著；會隨著A和B的增加先增加后降低，其中葡萄糖含量起著主要作用。

由圖2可知，A和C的交互作用較顯著；A和C的值在低水平時，基本不變；A在一定的水平下，隨C的增加，呈緩慢增加趨勢；相比較于C在低水平時，C在高水平時隨A的增加，增加迅速，但最終的仍然比C在高水平時要小。可見，大量葡萄糖的存在在一定程度減少了較高初始pH值對黑木耳菌絲生長的抑制作用。

由圖3可知，B和C的交互作用不顯著，但隨2因素值的增加呈先升高后降低趨勢。

2.5 最佳工藝條件的驗證

綜合以上研究，由回歸模型得到，影響Y的各因素最優(yōu)值：葡萄糖50.27g/L、KHPO4.93 g/L、初始pH值5.1，此時的最大預(yù)測值為21.2 g/L。為了檢驗該工藝的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行驗證試驗，得到的驗證值為21.57 g/L，與最大預(yù)測值(21.2 g/L)非常接近，相對誤差僅為1.75%，小于5%。因此，Box-Behnken響應(yīng)面法在森盛1號黑木耳液體發(fā)酵工藝優(yōu)化中的應(yīng)用是成功的。

3 結(jié)論與討論

本研究采用Plackett-Burman、最陡爬坡、Box-Behnken響應(yīng)面以及驗證試驗對森盛1號黑木耳新品種的液體發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到了最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件：馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖50.27g/L、蛋白胨4.5 g/L、麥麩15.0 g/L、KHPO4.93 g/L、MgSO·7HO 1.0 g/L、初始pH值 5.1、接種量4%、溫度28.0 ℃、160 r/min搖床發(fā)酵8 d，菌絲干質(zhì)量可達(dá)到21.57 g/L，比優(yōu)化前提高了23.53%。

響應(yīng)面相較于其他優(yōu)化方法，可以反映碳氮源等因素間的交互作用。與錢雪婷等的研究結(jié)論進(jìn)行比較，與“葡萄糖是影響黑木耳菌絲生物量的顯著性因素”的結(jié)論相同，這是由于在發(fā)酵初期黑木耳菌株不能產(chǎn)生分解復(fù)雜有機物的酶系，而單糖更容易得到吸收利用；與結(jié)論“影響黑木耳菌株神農(nóng)A8干質(zhì)量順序為KHPO含量>葡萄糖含量>牛肉粉含量”不同，影響菌絲干質(zhì)量的順序是初始pH值>KHPO含量>葡萄糖含量，可能是由菌種的差異導(dǎo)致；從液體菌種的實際生產(chǎn)來看，較高的菌絲生物量是判斷液體菌種質(zhì)量的一個重要標(biāo)準(zhǔn)，森盛1號在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下的菌絲干質(zhì)量比神農(nóng)A8多94%，可見新品種森盛1號具有更大優(yōu)勢。

另外，響應(yīng)面分析得到的二次回歸模型可以較好地反映試驗的真實結(jié)果。本研究得到的菌絲干質(zhì)量驗證值(21.57 g/L)與最大預(yù)測值(21.2 g/L)較接近，相對誤差僅為1.75%(<5%)。因此，優(yōu)化得到的森盛1號黑木耳液體發(fā)酵工藝是有效可行的，可為森盛1號新品種及其他黑木耳菌株的液體菌種生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。