園林植物再生與遺傳轉化體系研究進展

李懿鑫， 果弘毅， 儲歆彤， 高俊峰， 吳瑜瑋， 劉國元， 張 健

(南通大學生命科學學院觀賞植物遺傳育種重點實驗室，江蘇南通 226000)

園林植物指觀葉、觀花、觀果、觀莖、觀形的木本和草本植物，是園林綠化的主要材料，在城市綠化方面起著至關重要的作用，如調節氣候、凈化空氣、美化城市環境等。由于土地鹽堿化、荒漠化等生態問題日趨嚴重，普通的園林植物已滿足不了正常需求。因此，快速開發和培育出更多的新品種園林植物來滿足生產、生活需要，是解決這一問題的關鍵。遺傳轉化技術打破了常規育種方式，可以高效、快速創造新種質。隨著植物組織培養技術的廣泛應用和遺傳轉化技術的不斷深入發展，研究人員在成功建立高效再生體系的基礎上，運用多種遺傳轉化技術，將關聯性狀的耐鹽、耐旱、耐高溫、抗蟲、抗病等相關基因用于轉基因遺傳育種，已成功建立了多種植物的遺傳轉化體系。

本研究結合國內外研究進展對影響園林植物再生的關鍵因素、遺傳轉化的相關技術以及影響農桿菌遺傳轉化效率的因素等方面進行綜述，旨在為進一步利用遺傳轉化技術進行園林植物的轉基因育種奠定基礎。

1 園林植物再生體系的研究進展

植物的組織培養流程清晰，具體包括外植體的選擇、外植體的消毒、誘導愈傷組織、誘導不定芽、誘導生根、煉苗、移栽等過程。在植物再生的過程中，要根據材料的不同取材部位，取材部位的不同發育階段，對培養基類型、激素濃度、光照時間等進行調整。

近年來，有許多的園林植物已成功建立了組培再生體系。如菊科(Asteraceae)的萬壽菊(L.)、向日葵(L.)、甜葉菊[(Bertoni) Hemsl.]等，蘭科(Orchidaceae)的蝴蝶蘭(H. G. Reichenbach)、蕙蘭(Rolfe)、君子蘭()等，報春花科(Primulaceae)的報春花(Franch.)、小報春(Franch.)、鄂報春(Hance)等，鳳仙花科(Balsaminaceae)的鳳仙花(L.)，毛茛科(Ranunculaceae)的芍藥(Pall.)，鳶尾科(Iridaceae)的鳶尾(Maxim.)、香雪蘭(Klatt.)等，百合科(Liliaceae)的百合(var.Baker)、郁金香(L.)等10余科的草本園林觀賞植物組培再生體系已相當成熟，具體如表1所示。

表1 草本園林植物組培再生體系的構建

與草本植物相比，木本植物外植體的木質化程度較高，在培養過程中容易出現褐化現象，隨著組培技術的提高，一批重要木本園林植物如楊柳科(Salicaceae)的楊樹(L.)、胡楊(Oliv.)等，銀杏科(Ginkgoaceae)的銀杏(L.)，松科(Pinaceae)的油松(Carriere )、云杉(Mast.)等，木蘭科(Magnoliaceae)的玉蘭[(Desrousseaux) D.L.Fu]、鵝掌楸[(Hemsl.) Sarg.]等，桑科(Moraceae)的桑樹(L.)，薔薇科(Rosaceae)的月季(Jacq.)、海棠()等，蕓香科(Rutaceae)的柑橘(Blanco)、花椒(Maxim.)等，山茶科(Theaceae)的山茶(L.)、油茶(Abel.)等50余科的木本園林植物已成功建立再生體系，具體如表2所示。

表2 木本園林植物組培再生體系的構建

目前，國內外關于園林植物再生體系的研究報道很多，大量研究報道證明了外植體類型、基礎培養基、激素種類及配比等均影響園林植物的再生。

1.1 外植體類型

外植體類型是影響園林植物再生的關鍵因素之一，同一外植體的不同取材部位或同一取材部位的不同發育階段，其不定芽的分化能力均不相同。再生培養時，要根據植物的生長特性、繁殖方式來選取合適的外植體。一般選擇幼嫩的器官或組織，如幼葉、莖尖、嫩莖、種胚等，也可選擇種子、幼根、下胚軸、子葉、花器官等。吳青青等將百合的組培苗進行4 ℃低溫處理，發現處理后的組培苗生長點活動旺盛，適宜進行莖尖培養，并成功獲得了再生的脫毒苗；而張西英等采用熱處理與莖尖培養結合的方式得到了脫毒的郁金香，同時研究了不同莖尖大小對郁金香莖尖培養的影響，發現莖尖大小為1.5～2.0 mm時便于剝取，也能取得一定的脫毒效果。何艷等通過對葉片的部位及葉齡進行研究，將葉片切成0.50 cm×0.50 cm的小片，發現試管苗下段葉片較上端更易形成愈傷組織，試管苗發育狀態良好的葉基比未完全發育的葉尖、葉中部愈傷組織誘導效率高。孫瑞芬等對甜葉菊帶腋芽的莖段和莖尖進行叢生芽的誘導，發現在相同培養條件下，帶芽莖段作為外植體誘導叢生芽的效率更高，成功培育出成活率達70%的再生植株。楊柳科的木本園林植物已經建立了較完整的再生體系，研究者常以葉片、莖尖、莖段、腋芽等為外植體，誘導不定芽，獲得再生植株。張瑞芝等以歐美楊的葉柄、葉片、莖段為外植體，發現葉柄產生愈傷組織的時間較短，誘導率高，而莖段相比較葉柄、幼葉愈傷產率較低，利用帶有腋芽的莖段來誘導產生無菌苗的效率則更高。

在園林植物中，常采用莖段進行快繁得到無菌苗，以縮短植物的發育時間。在誘導愈傷組織時，葉柄的誘導率要優于葉片和莖段。因此，在選擇外植體時，要根據植物的生長特性、取材部位及發育階段等多方面進行考慮。

1.2 培養基類型

在組織培養中，培養基對外植體的培養具有非常重要的作用，MS、1/2MS、WPM、B5、N6等是植物組織培養中常用的培養基，這些培養基中均含有豐富的無機營養物質和部分有機營養成分等。不同植物在脫分化、再分化、生長等過程中適宜的培養基各不相同。

陳長征對影響金線蓮愈傷組織增殖的培養基進行了選擇，使用MS、1/2MS和N6這3種培養基，證明MS培養基的效果顯著優于1/2MS和N6培養基。而馮寧使用MS、1/2MS和1/3MS這3種基本培養基，研究了帶有腋芽的蝴蝶蘭莖段的生長和褐化情況，發現適當降低培養基中大量元素的含量，蝴蝶蘭組培的褐化率也隨之降低，蝴蝶蘭腋芽的萌發率則隨之升高，在1/2MS培養基上的莖段，其腋芽萌發率超過90%，且長勢良好。

周熙瑩等使用MS、WPM培養基誘導84K楊的葉片和莖段的愈傷組織，發現葉片以MS為基礎培養基，愈傷組織的誘導效率更高、更加穩定，而莖段誘導愈傷組織及愈傷組織誘導不定芽使用WPM培養基則更合適。孫永蓮以簸箕柳的莖段為外植體，用B5、MS、WPM、1/2MS 這4種基本培養基誘導腋芽，篩選出MS為簸箕柳組織培養的最適基本培養基。而Jardak等使用MT培養基，以柑橘的胚軸為外植體，成功建立了柑橘的再生體系。

綜上，MS培養基對木本園林植物和草本園林植物均適用，一般用于誘導愈傷組織，而WPM培養基常用于木本園林植物，適用于愈傷組織的誘導和不定芽的分化，1/2MS培養基也可用于園林植物不定芽的分化生和根。在實際的組織培養過程中，要根據培養階段來選擇合適的培養基，同時植物激素、其他培養物的添加也十分重要。

1.3 植物生長調節劑種類

在組織培養中，為了促進外植體的生長發育，常添加不同濃度、不同種類和配比的植物生長調節劑。盡管植物生長調節劑用量非常微小，但其在植物生長中卻起著不可替代的作用。一般常用的有生長素、細胞分類素、赤霉素、脫落酸等。

生長素有萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2，4-D等，它們不僅可以促進細胞分裂，還能誘導愈傷組織形成和生根，具有極其重要的作用。2，4-D常用于愈傷組織的誘導，但高濃度的2，4-D有一定的毒害作用。NAA、IBA常用于生根培養，單一或者混合使用均可。王善娥使用單一激素NAA、BA、ZT、2，4-D、KT對誘導柳樹葉片愈傷組織率進行了探究，發現NAA、2，4-D產生愈傷組織的速度較快，其他幾種激素誘導愈傷組織則較慢，且很快便褐化死亡。在誘導愈傷組織時，生長素和細胞分裂素的搭配使用，誘導出的愈傷組織狀態更佳。張大鵬等以KT、TDZ、6-BA、IBA、IAA、2，4-D、NAA為不同的激素處理，分析油棕葉片在不同激素誘導下的褐化率，發現6-BA和IBA處理下的褐化率明顯高于其他5種激素，KT處理下葉片的褐化率則顯著低于其他激素，而2，4-D、NAA、IAA對葉片的褐化率影響在各個水平上均無顯著差異，因此在愈傷誘導率相近的情況下，可優先使用KT對油棕葉片進行誘導。

6-芐氨基嘌呤、玉米素(ZT)、激動素、噻苯隆等細胞分裂素用于促進細胞分裂和分化，促進愈傷組織分化不定芽。其中，6-BA和KT使用較廣泛。例如，孫永蓮等研究發現，6-BA對簸箕柳愈傷組織的誘導率要高于KT，而6-BA 和TDZ結合使用時不定芽的分化數目最多且生長旺盛，分化率達100%。而與KT相比，相同濃度下的6-BA更易使試管苗玻璃化。于非等使用6-BA和TDZ直接將麗格海棠葉片誘導出不定芽。還有研究表明，在誘導不定芽的過程中，極其微量的TDZ可能是芽分化的關鍵。例如，甄成得到的毛果楊莖段分化最佳培養基中，加入的TDZ僅為0.000 8 mg/L。

赤霉素和脫落酸(ABA)有時也用于植物組織培養中。赤霉素對枝條生長和伸長區節間的發育具有一定的作用，對根的生長沒有促進作用，能顯著促進莖葉的生長，有時也用于誘導愈傷組織。脫落酸則對植物生長有抑制作用。

在培養基中添加植物激素時，常以生長素和細胞分裂素不同濃度的配比進行搭配。一般認為，細胞分裂素和生長素比值低時，有利于愈傷組織的形成，如生長素的濃度范圍一般為0.01～1.00 mg/L NAA或0.1～2.0 mg/L 2，4-D，與細胞分裂素 0.1～3.0 mg/L 6-BA搭配使用，用于誘導愈傷組織；而細胞分裂素和生長素比值高時，則有利于不定芽的分化，0.1～1.0 mg/L NAA和0.1～4.0 mg/L 6-BA 常被用于不定芽的分化，有時也使用2種以上的激素組合，如NAA+6-BA+0.000 1～0.100 0 mg/L TDZ，微量的TDZ在分化過程中起著不可替代的作用。但這并非絕對的，如烏日罕使用河北楊葉片誘導不定芽時，使用的激素濃度為 0.3 mg/L TDZ+0.4 mg/L IBA。

1.4 其他因素

溫度、光照、繼代次數、培養時間、封口材料等因素也會影響組織培養的效果。如王馨使用不同光質的LED燈(藍光、綠光、紅光、白光和藍綠紅混合光)，對東北紅豆杉的愈傷組織進行照射，探究不同光照條件下愈傷組織紫杉烷類化合物的積累，發現5種光質均可促進化合物的積累，紅光為最佳光質。尚瑀琪等對連續繼代培養中馬尾松的芽生根能力進行了分析，發現繼代次數的增加對馬尾松的生根能力有顯著影響，繼代次數在15～20次時，繼代芽生根能力最強，生根率達98.7%，而繼代40次以后，生根能力顯著下降。而有些植物卻能夠長期繼代，如玫瑰等在多次繼代后仍能保持原來的增殖能力和分化能力，還有些植物在繼代過程中發生變異的概率會增加。

2 園林植物遺傳轉化體系研究進展

植物遺傳轉化也稱轉基因技術，以植物的原生質體、器官、組織、細胞等材料為受體，通過不同的方法將外源基因轉入到受體中，從而獲得外源基因穩定表達的再生植株。在園林植物再生體系的基礎上，已在菊花、蘭花、百合、郁金香等草本園林植物及銀杏、楊樹、油松、柑橘、黃楊等木本園林植物上成功實現了遺傳轉化。草本園林植物的生長周期短，與生長周期長的木本園林植物相比，不論是傳統育種方式還是轉基因育種都相對容易。而木本園林植物常以傳統的育種方式進行育種，其遺傳性狀改良較復雜、周期長，通過基因工程育種能夠極大地縮短育種年限。

目前，多數園林植物利用植物的葉片、種子、莖段、下胚軸等都能實現遺傳轉化，通過脫分化形成愈傷組織后再分化不定芽、體細胞胚發生、外植體直接再生不定芽等途徑，得到穩定的遺傳轉化體系，從而達到驗證基因功能的目的。在柑橘遺傳轉化研究中，常用根癌農桿菌介導幼苗上胚軸片段，由于種子具有季節依賴和基因型依賴等特點，使得柑橘的遺傳轉化效率大幅降低，因此利用細胞懸浮培養進行遺傳轉化可能是一種更好的選擇，具有更高的器官發生潛力，細胞懸浮液的轉化更有利于非嵌合轉基因柑橘植株的產生，轉化效率為35%，而且細胞懸浮培養能有效地維持細胞的活力和再生潛能。因此，建立高效的遺傳轉化系統對植物基因功能的研究和新品種選育有非常重要的作用。

在遺傳轉化過程中，除了高效的再生體系外，遺傳轉化方法也很重要。目前，遺傳轉化的方法主要有農桿菌介導法、基因槍法、聚乙二醇(PEG) 介導法、顯微注射法、電擊法、花粉管通道法、離子束法等。其中，將DNA直接轉移的方法有電擊法和顯微注射法等，利用植物的原生質體作為轉化受體，此方法對原生質體的再生要求比較高，對于一些原生質體再生困難的物種研究難度較大。利用花粉管通道法的研究也有相關報道，如茶樹利用花粉管通道法成功獲得了轉基因植株，但轉基因植株的結實率明顯低于正常植株，技術仍需進一步改進。目前，常用的轉化方法有農桿菌介導法、基因槍法和聚乙二醇(PEG)介導法。

2.1 農桿菌介導法

農桿菌介導法是通過農桿菌將外源目的基因導入植物基因組的方法，以此形成含有外源基因的再生植株，實現遺傳性狀的改良。用于轉化的農桿菌主要是根癌農桿菌和發根農桿菌。在自然條件下，根癌農桿菌的Ti質粒上有1段T-DNA，農桿菌通過感染多數裸子植物和雙子葉植物的傷口部位，將T-DNA插入到植物的基因組中，在植物基因組中進行整合表達；而發根農桿菌則能夠誘導產生高度分支的毛狀根。目前根癌農桿菌遺傳轉化系統理論機制最清楚、技術方法最成熟，是當前研究中使用最多的方法，具有操作簡便易行、轉化方法簡單高效、轉化效率高、重組后的外源DNA結構完整且不易變異等優點。

在遺傳轉化研究過程中，外植體類型、農桿菌菌株類型、濃度和侵染時間、共培養時間、抗生素種類等也是影響農桿菌遺傳轉化的重要因素。

2.1.1 外植體類型 不同類型的外植體是農桿菌遺傳轉化過程中的重要影響因素之一。一般選取分裂能力強、生長旺盛的材料，使獲得的轉化材料效率高，轉化后再生植株的活力較強。用于遺傳轉化材料主要有體細胞胚、嫩莖、嫩葉、下胚軸、莖尖等。對于不同品種的植物、選擇不同的外植體進行轉化，轉化效率也存在顯著差別。在柳樹的轉化體系中，以種子為外植體，由胚頂芽直接誘導出多芽，農桿菌轉化效率為7.2%。利用體細胞胚為外植體，在牡丹、百合、火炬松、日本柳杉等品種中，均獲得了較好的遺傳轉化效果。還有以嫩葉為外植體通過直接誘導不定芽進行轉化的，如楊樹葉片的遺傳轉化效率為32.2%。此外，柑橘的胚性懸浮細胞能夠有效維持細胞活力和再生潛力，也可以作為遺傳轉化材料，轉化效率為35%。還有毛狀根作為外植體也成功建立了遺傳轉化體系。

2.1.2 菌株類型、濃度和侵染時間 在農桿菌轉化過程中，農桿菌菌株的類型、菌液濃度和侵染時間也是影響遺傳轉化的重要因素之一。農桿菌菌株LBA4404、EHA105、AGL1、GV3101等常用來侵染植物外植體。Wang等對白楊和山楊葉片進行農桿菌侵染，發現農桿菌EHA105的轉化頻率最高，而GV3101的致病力很小或沒有毒力，因此選擇農桿菌EHA105進行試驗，在共培養基中添加50 mg/L乙酰丁香酮，獲得了較好的GUS表達效果。

在適宜的菌液濃度下，合適的侵染時間有利于提高轉化效率，降低染菌率。菌液密度越高，侵染時間越長，農桿菌在培養過程中長勢越旺盛，外植體發生染菌、褐化的可能性會大幅提高；而菌液密度越低、侵染時間越短，外植體傷口與菌液接觸不充分，使得農桿菌難以附著在外植體上。Wu等使用根癌農桿菌GV3101和LBA4404對桑樹葉片進行侵染，設置3種菌液濃度(為0.5、1.0、1.7)，發現3種菌液之間的GUS信號并沒有明顯差別，因此，選擇=0.5濃度進行試驗。大量研究表明，在以葉片為外植體進行轉化時，菌液一般為0.4～1.0，轉化效果最佳的侵染時間為5～20 min。

2.1.3 共培養時間 外植體與菌株的共培養時間對轉化效率有顯著影響。共培養時間過短，會導致農桿菌在外植體上不能充分生長，降低了T-DNA的整合效率；而共培養時間過長，則會導致農桿菌過度繁殖，抑菌難度大大增加，增加了接種次數。Song等將白楊幼葉共培養3、4、5 d，發現共培養3 d最為合適，且隨著共培養時間的延長，芽誘導效率逐漸降低，而轉化效率則無明顯差別。研究表明，農桿菌在外植體傷口處共培養16 h以上誘導形成冠癭瘤，才會發生轉化，通常以暗培養2～3 d 為最佳。

遺傳轉化過程中，共培養后的植物材料表面有大量農桿菌附著，因此抑菌處理成為一個重要的環節。合適的抗生素不僅可以篩選出抗性植株，還能抑制和殺死農桿菌的生長。

抑菌抗生素能夠有效抑制農桿菌的活性，且抑菌抗生素的濃度在外植體的生長過程中也起著重要的作用。如果濃度過低，起不到抑制農桿菌生長的作用，會導致農桿菌過度繁殖；而濃度過高，則會抑制外植體的生長甚至導致外植體褐化死亡。常用的抑菌抗生素主要有頭孢霉素(Cef)、特美汀(Tim)、羧芐青霉素(Carb)等，在遺傳轉化體系中加入特美汀，愈傷組織的抑菌效果和再生效果比頭孢霉素和羧芐青霉素效果要好，且對植物材料的影響更小。可以根據植物外植體的特點，選擇合適的抑菌抗生素及濃度。Hayta等在培養基中添加硝酸銀，能夠明顯抑制農桿菌的生長和促進植株再生。Bruegmann等將白楊葉片共培養后，用 500 mg/L 頭孢霉素無菌水溶液對外植體進行沖洗，抑制農桿菌的生長。

農桿菌轉化過程中，只有少數外植體能將外源DNA整合到自身的基因組中，大多數則未能轉化成功。利用轉化質粒或載體帶有的選擇標記，通過篩選抗生素來篩選轉化成功的外植體，抑制未轉化外植體的生長，從而高效地篩選轉化成功的抗性材料。常用的篩選抗生素有潮霉素(Hyg)和卡那霉素(Kana)。根據轉化過程中所用質粒載體的不同，來選擇合適的抗生素。如報春花屬植物在遺傳轉化過程中常使用新霉素磷酸轉移酶Ⅱ()基因，基因對氨基糖苷類抗生素卡那霉素、新霉素和G-418具有耐藥性，得出卡那霉素是最常用的選擇性藥物，在125 mg/L的濃度下，卡那霉素抑制未轉化細胞的生長，而使轉化細胞從花梗愈傷組織中再生。

2.2 基因槍法

基因槍法又稱粒子轟擊技術，是利用高速微彈將外源DNA導入植物組織或細胞的方法。在微小的金粒或鎢粒表面包裹著外源DNA，然后加速穿透細胞壁進入目標植物。當微投射體進入細胞時，轉移的DNA從粒子中分離出來，整合到宿主基因組中并穩定表達。基因槍法不僅可以將目的基因轉入雙子葉植物，也能導入到單子葉植物，克服了農桿菌轉化過程中寄主的限制問題，幾乎所有的器官、組織都可以作為轉化受體。此外，還能將多個質粒共同轉化至受體細胞，縮短了工作時間，提高了試驗效率。但是，在轉化過程中，使用的金粉或鎢粉價格較高，增加了試驗成本，且獲得的轉基因植株嵌合體比率較高、轉基因效率低、轉化不穩定，仍需要進一步改進。

2.3 聚乙二醇介導法

PEG是一種細胞融合劑，能引起細胞膜表面電荷的紊亂，干擾細胞間正常的信息交流，從而促進細胞之間的融合，誘導外源DNA分子進入原生質體。該方法操作簡便、不受品種的局限、成本低，但需要原生質體作為受體，而許多植物原生質體再生困難，因此該方法的使用受到了一定的限制。

3 展望

園林植物高效再生體系的建立已有很多報道，在莖尖脫毒、微體快繁等領域取得了重大的研究進展，高效的再生體系和成熟的轉基因技術是實現園林植物遺傳育種和新品種改良的重要條件，再生及遺傳轉化的關鍵步驟如圖1所示。

但有些物種仍停留在愈傷誘導階段，不定芽的分化成了制約該類物種再生體系構建的難題，還會遇到褐化、玻璃化等問題。因此，仍需繼續加大研究力度，參考前人的研究基礎，加強技術、方法等方面的創新，加強基礎研究體系的構建，攻克再分化過程這一難關，推進園林植物再生體系的構建。同時盡量降低組織培養過程中的玻璃化、褐化及染菌等問題，培育出生長狀態良好的愈傷組織，為再分化做準備。

目前，多數園林植物利用農桿菌介導法，成功培育出耐鹽、耐高溫、耐旱等的轉基因新品系，但此方法轉化效率較低，易出現假陽性，需對轉基因植株進行分子鑒定。同時農桿菌的菌液濃度、侵染時間、共培養時間等因素，也影響著農桿菌的轉化效率。而基因槍法的轉化率要比農桿菌的高，但在可操作性、受體細胞被轟擊后DNA的變化等方面，還需要進一步完善。此外，花粉管通道法、PEG法、顯微注射法等遺傳轉化技術，可借鑒不同種類植物中的研究。隨著遺傳轉化技術的不斷創新和進步，未來會成功培育出更多高效轉化的轉基因新品種。

外植體的選擇、不同種類激素配比是園林植物再生體系成功建立的關鍵。而植株再生低、遺傳轉化效率低、轉基因植株離體再生率低等，是遺傳轉化過程中所面臨的瓶頸問題。因此，仍需不斷優化培養條件，建立高效的再生及遺傳轉化體系，為園林植物遺傳育種及基因功能的研究提供有力的方法支撐，為新品種的選育和推廣奠定基礎。