流式細胞術鑒定結核分枝桿菌利福平異質性耐藥可行性分析

李 華， 王偉亮， 謝 貝， 楊 瑜， 孟繁榮， 王 楠， 劉志輝， 張言斌

（1.廣州市胸科醫院肺部疾病研究所，廣東 廣州 510095；2.佛山市第四人民醫院結核病防治科，廣東 佛山 528000；3.廣州市胸科醫院結核內科，廣東 廣州 510095）

耐藥結核病給結核病的防治工作帶來了極大的挑戰，世界衛生組織在2020年全球結核年報中指出，2019年全球估算新發利福平（rifampicin，RFP）耐藥結核病病例46.5萬例，其中78%為耐多藥結核病，有18.2萬例患者死于耐多藥結核病[1]。結核異質性耐藥是指在同一樣本中同時存在對藥物敏感和耐藥的結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）。快速、靈敏、特異地檢測MTB異質性耐藥可有針對性地指導臨床用藥，大大提高結核病的治愈率。目前，應用于結核異質性耐藥檢測的技術包括表型法和基因法。表型法檢測大約需要3～4周，下一代測序技術（next-generation sequencing，NGS）和限制性片段長度多態性技術（restriction fragment length polymorphism，RFLP）可發現MTB菌群基因序列的不一致，從而揭示MTB菌群的異質性[2-6]，但該方法只能檢測與表型明確相關的耐藥基因突變[7-8]。

流式細胞術（flow cytometry，FCM）可用于白念珠菌、MTB、金黃色葡萄球菌等微生物的藥物敏感性檢測[9-12]，該方法基于表型檢測細菌的藥物敏感性，具有高效、準確的優點。相關研究證實了FCM可用于檢測傷寒沙門菌和酵母細胞的異質性[13-14]。本研究團隊前期研究結果顯示，基于熒光素雙醋酸酯（fluorescein diacetae，FDA）或碘化丙錠的FCM在MTB RFP藥物敏感性檢測中具有較高的檢測效率和效能[15]。本研究以廣州市胸科醫院MTB菌株庫為基礎，進一步探究基于FDA的FCM檢測RFP異質性耐藥MTB樣本RFP耐藥菌比例的可行性，評估FCM在耐RFP MTB異質菌液樣本檢測中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

RFP敏感MTB臨床分離株和耐RFP MTB臨床分離株均為廣州市胸科醫院“廣州地區分枝桿菌菌種保藏庫”保存菌株。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 FACSAria Ⅱ流式細胞儀（美國BD公司）；BACspreader 1100細菌超聲分散儀（廣東體必康生物科技有限公司）；Middlebrook 7H10固體培養基、Middlebrook 7H9液體培養基、OADC（美國BD公司），FDA（美國LIFE公司），RFP（美國SIGMA公司）。

1.2.2 菌液制備 采用隨機數字表法從生物樣本庫中挑選RFP耐藥和敏感MTB臨床分離株各100株，復蘇培養。挑選生長良好的MTB單菌落，將全敏感MTB接種于7H10固體培養基（10%OADC），耐藥RFP MTB接種于含1 μg/mL RFP的7H10固體培養基（10% OADC），培養3代，并進行比例法藥物敏感性試驗。挑選生長狀況良好的MTB，刮取菌落至7H9培養液（10%OADC），用細菌超聲分散儀配置成1麥氏濁度菌懸液。隨機選擇1對RFP敏感MTB臨床分離株和耐RFP MTB臨床分離株，按RFP耐藥MTB比例為0%、25%、50%、75%和100%進行混合，配制成RFP異質性耐藥MTB混懸液，共30組。所有活菌相關操作均在生物安全柜中進行。

1.2.3 菌液的RFP處理 充分混勻菌液，移取1 800 μL菌液于無菌試管中，分別加入濃度為0、125、250、500和1 000 μg/mL的RFP工作液（用7H9培養液稀釋）200 μL，充分混勻，使RFP終濃度分別為0、12.5、25、50和100 μg/mL，置于37 ℃恒溫箱中孵育，分別在用RFP處理的第3、7和10天后行FDA染色。異質菌液用50 μg/mL的RFP作用10和14 d后進行FDA染色。

1.2.4 菌液的FDA染色和FCM檢測 取1 000 μL待檢菌液于無菌試管中，15 000×g離心10 min，去掉上清，加入1 000 μL 0.9%NaCl溶液，用超聲分散儀分散，取300 μL菌液于流式細胞儀上樣管中，加入300 μL FDA工作液（0.5 μg/mL，磷酸鹽緩沖液配置），混勻，避光染色30 min后，用流式細胞儀檢測，記錄其平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）值。

1.2.5 RFP異質性耐藥檢測藥物處理濃度和作用時間的確定 計算各處理組的敏感指數（實驗管MFI/對照管MFI）。為了檢測到異質性菌液中最低混合比的耐藥菌，理想的藥物處理濃度和作用時間應既不影響混合菌液樣本中微量耐RFP MTB臨床分離株的生長，又能使混合菌液樣本中RFP敏感MTB臨床分離株的敏感指數最低，即背景信號降到最低，此時耐RFP MTB臨床分離株和RFP敏感MTB臨床分離株染色的敏感指數差異最大，檢測靈敏度最高。分別用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP處理RFP敏感MTB臨床分離株3、7 和10 d后，比較不同處理時間FDA染色敏感指數間的差異，確定最佳藥物處理時間。通過比較MTB臨床分離株經12.5 、25 、50和100 μg/mL的RFP處理10 d后的FDA染色敏感指數間的差異，確定最佳藥物處理濃度。

1.2.6 比例法藥物敏感性試驗 按照《實驗結核病學》中“結核分枝桿菌藥物敏感性試驗”操作方法進行比例法藥物敏感性試驗[16]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。正態分布計量數據用±s表示，兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗或校正t檢驗，多組比較采用單因素方差分析；非正態分布計量數據用中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，兩兩比較采用兩獨立樣本秩和檢驗，多組比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價不同比例異質菌液的敏感指數界值和檢測性能。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基于FDA的FCM檢測MTB RFP異質性耐藥的藥物處理濃度和作用時間

分別用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP作用RFP敏感MTB臨床分離株3、7和10 d，結果顯示，不同作用時間FDA染色的敏感指數差異有統計學意義（P<0.001）；分別用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP作用RFP敏感MTB臨床分離株和耐RFP MTB臨床分離株10 d后，不同藥物濃度處理組FDA染色的敏感指數差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 基于FDA的FCM檢測MTB RFP異質性耐藥的藥物處理濃度和作用時間分析

2.2 基于FDA的FCM檢測MTB RFP異質性耐藥的性能

用50 μg/mL RFP作用10、14 d后，不同比例RFP耐藥MTB的異質菌液樣本FDA染色的敏感指數見表1。用50 μg/mL RFP作用10、14 d，基于FDA的FCM對含有0% RFP耐藥MTB的異質菌液樣本和含有25%及以上RFP耐藥MTB的異質菌液樣本具有較高的鑒別效能；對含有25%RFP耐藥MTB的異質菌液樣本和100% RFP耐藥MTB的異質菌液樣本也具有較高的鑒別效能；對其他比例RFP耐藥MTB的異質菌液樣本之間的鑒別效能較低。見表2、圖2、圖3。

表1 50 μg/mL RFP作用不同比例RFP耐藥MTB異質菌液樣本10、14 d后FDA染色敏感指數

表2 RFP異質性耐藥MTB經50 μg/mL RFP作用后FDA染色敏感指數的ROC曲線分析結果

圖2 RFP異質性耐藥MTB經50 μg/mL RFP作用后FDA染色敏感指數的ROC曲線

圖3 30組RFP異質性耐藥MTB混懸液經50 μg/mL RFP處理后FDA染色敏感指數的分布

3 討論

結核病異質性耐藥的本質是致病MTB為藥物敏感菌群和耐藥菌群的混合，當患者感染異質性耐藥MTB時，如果根據其感染異質性耐藥MTB中耐藥MTB和敏感MTB的比例，制定個性化的治療方案[17]，可大大提高該類結核病治療的成功率。本研究團隊前期研究結果表明，基于FDA染色的FCM能夠高效、準確地鑒定MTB的RFP敏感性，這為應用FCM檢測MTB異質性耐藥提供了實驗基礎[15]。

基于FDA的FCM檢測MTB RFP異質性耐藥的本質是通過染料監測細菌在藥物處理后的活力。FDA是一種具有細胞膜透性的疏水熒光素衍生物，其進入細胞后可被細胞內的酯酶催化水解生成發綠色熒光的熒光素，不具有完整細胞膜或新陳代謝活性弱的細胞會因酯酶失活而降低水解FDA的能力。為了確認基于FDA的FCM在MTB RFP異質性耐藥檢測中合適的RFP處理濃度和作用時間，本研究對不同RFP處理濃度作用不同時間后，MTB RFP敏感或耐藥臨床分離株經FDA染色后的敏感指數進行了差異性分析，結果顯示，分別用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP處理RFP敏感MTB臨床分離株3、7和10 d后，3 d處理組、7 d處理組和10 d處理組之間FDA染色的敏感指數差異均有統計學意義（P<0.001），提示RFP敏感MTB臨床分離株經RFP處理的時間越長，其活力越差，基于FDA染色的FCM檢測MTB RFP異質性耐藥的藥物處理時間可以選擇10 d或更長；分別用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP處理RFP敏感MTB臨床分離株和耐RFP MTB臨床分離株10 d后，不同藥物濃度處理組之間FDA染色的敏感指數差異均無統計學意義（P>0.05），但用100 μg/mL的RFP處理后，耐RFP MTB臨床分離株敏感指數明顯低于用50 μg/mL RFP處理的敏感指數，提示用100 μg/mL RFP處理對耐藥MTB的活力有影響，基于FDA染色的FCM檢測MTB RFP異質性耐藥較優的RFP處理濃度為50 μg/mL。

本研究結果顯示，基于FDA的FCM在檢測MTB RFP異質性耐藥時，較合適的藥物處理條件是50 μg/mL RFP處理10 d，既不影響異質菌液樣本中RFP耐藥MTB的生長，又可使樣本中RFP敏感MTB的敏感指數最低。本研究摸索實驗的最長時間是10 d，不排除增加時間后會使RFP敏感MTB臨床分離株敏感指數下降到更低，而耐RFP MTB則不受影響，故在后續RFP異質性耐藥檢測中增加了處理14 d的研究。我們用基于FDA的FCM檢測30組耐RFP MTB所占比例分別為0%、25%、50%、75%和100%的MTB RFP異質性耐藥菌液樣本，通過ROC曲線分析其檢測不同比例MTB RFP異質性耐藥菌液的敏感指數界值和檢測效能，結果顯示，50 μg/mL RFP處理10 d時，基于FDA的FCM在MTB RFP異質性耐藥檢測中鑒別含0%、25%和100% RFP耐藥MTB的異質菌液樣本的敏感指數界值分別為0.48和0.83，敏感性分別為96.2%和86.7%，特異性分別為96.7%和83.3%；處理14 d時，該方法鑒別含0%、25%和100% RFP耐藥MTB的異質菌液樣本的敏感指數界值分別為0.37和0.77，敏感性分別為96.7%和96.7%，特異性分別為93.3%和86.7%，提示50 μg/mL RFP處理10和14 d時，基于FDA的FCM均可準確區分含0%、25%和100%RFP耐藥MTB的異質菌液樣本，且處理14 d的檢測性能略優于處理10 d，耗時與比例法（3～4周）相比大大減少。在指導臨床用藥方面，當異質樣本中RFP耐藥MTB比例為0%～25%時，說明樣本中耐藥菌比例較低，敏感菌比例較高，如果在治療早期加入RFP，或可明顯加快痰液樣本病原菌轉陰速度，縮短治療時間。

本研究預實驗嘗試評估了基于PI的FCM用于MTB RFP異質性耐藥檢測的效能，該方法無法用于MTB RFP異質性耐藥樣本的檢測，可能原因為不同的RFP耐藥臨床分離株之間活力差異較大，經藥物處理后PI染色的MFI值及敏感指數差異較大，導致相同比例下，含有不同耐RFP MTB臨床分離株的異質菌液樣本經PI染色所得敏感指數變異較大，無法分析得到統一的界值用于檢測。截至文章撰寫之日，尚未見該方法在MTB異質性耐藥檢測方面的其他研究報道。與比例法相比，FCM可檢測單個粒子的熒光強度，FDA可不依賴于細菌的增殖檢測細菌活力，因而理論上基于FDA的FCM在異質性耐藥檢測方面具有快速、高效的優點，這對于慢生長菌的異質性耐藥檢測意義重大[15，18]。DE BOER等[7]發現，RFLP等基因型檢測技術能檢測出混合比例為1∶9的異質性菌液，但只能檢測與表型明確相關的耐藥基因突變，無法識別未明確的耐藥基因，準確率較低。因此，與基因型檢測相比，基于FDA的FCM是基于表型的檢測方法，能避開基因型異質性耐藥檢測存在的耐藥基因突變位點不明、耐藥基因突變與表型不符等問題[19]，檢測的準確性較基因檢測高。本研究中基于FDA的FCM可在10 d內準確區分含0%、25%和100%RFP耐藥MTB的異質菌液樣本，耗時遠低于比例法，但是依然不夠理想。可能原因為FDA是細胞內酯酶依賴的熒光素，藥物作用后酯酶的失活需要一定的時間。因此，在FCM法檢測細菌異質性耐藥的研究中，尋找一種可靈敏指示細胞活力的染料將有助于縮短檢測所用的時間，提高檢測的靈敏度。