西瓜霜潤喉片微生物限度檢查方法的建立

曹魯娜，畢言鋒，王靜，鄭兆顯

菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，菏澤 274032

西瓜霜潤喉片為《中國藥典》2020 年版一部收載的中成藥，屬獨家生產品種，由西瓜霜、冰片、薄荷素油、薄荷腦4 種原料藥制成，具有清音利咽、消腫止痛的功效，用于防治咽喉腫痛、聲音嘶啞等病癥，療效顯著［1-2］，臨床應用廣泛［3-5］。鄒節明等［6］研究發現，西瓜霜潤喉片具有抑菌作用。為確保微生物限度檢查結果的準確性，使其可客觀反映樣品被微生物污染的真實水平，需在進行微生物限度檢查前通過查閱文獻、分析組方藥味的抑菌活性等對樣品特性進行初步研判并進行預試驗，對有抑菌活性的樣品，應選擇適宜的方法去除其活性后再進行檢查。

本研究首先通過平皿法篩選出敏感菌株，而后參考相關文獻［7-9］，結合微生物限度標準和生產企業提供的資料，采用3 批樣品進行3 次獨立平行試驗的方法，建立了基于中和法的西瓜霜潤喉片微生物限度檢查方法。現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

BSC-1300ⅡA2 型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；JE1201 型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；DNP-9162BS-Ⅱ型電熱恒溫培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）；BPH-9272 型精密恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；MLS-3781L-PC 型高壓蒸汽滅菌器（松下健康醫療器械株式會社）。

1.2 試藥

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號201225）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號201214）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB，批號201214）、沙氏葡萄糖液體培養基（SDB，批號201112）、腸道菌增菌液體培養基（EE，批號191231）、pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號210310）均由北京陸橋技術股份有限公司提供；聚山梨酯80（國藥集團化學試劑有限公司）；培養基經過適用性檢查，均符合標準要求。西瓜霜潤喉片（桂林三金藥業股份有限公司，批號210307、210308、210617）。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］及乙型副傷寒沙門菌［CMCC（B）50094］均購自廣東環凱微生物科技有限公司，經本實驗室復蘇復壯傳代并鑒定合格，本次試驗所用菌株均為第4 代。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 平皿傾注法

取西瓜霜潤喉片10g，加入TSB 至100ml，用勻漿儀混勻，制成1∶10 的供試品溶液。取1∶10的供試液適量，加入TSB 依法制成1∶50、1∶100的不同濃度供試品溶液［10］。

2.1.2 中和法

取西瓜霜潤喉片10g，加入含10%聚山梨酯80 的TSB 至100ml，用勻漿儀混勻，制成1∶10的供試品溶液。

2.2 菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于TSB 中，33℃培養24h；白色念珠菌接種于SDB 中，23℃培養3 天；黑曲霉接種于SDA中，23℃培養7 天，制成新鮮培養物。取上述新鮮培養物，用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗脫、稀釋，分別制備成菌落數為1000～10 000cfu/ml 的菌懸液或孢子懸液，用于微生物計數。將銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌分別接種于TSB 中，33℃培養24h，制成新鮮培養物。取上述新鮮培養物用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗脫、稀釋，制備成菌落數為10～100cfu/ml 的菌懸液，用于控制菌檢查。

2.3 計算方法與結果判斷

需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的回收比值依據公式計算：回收比值=（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數（公式1）。計數方法適用性試驗采用平皿法或薄膜過濾法時，各試驗菌回收比值應在0.5～2 范圍內；控制菌檢查適用性試驗陽性對照組應檢出試驗菌，陰性對照組應無菌落生長。

2.4 計數方法適用性試驗

2.4.1 平皿傾注法（1∶10）

試驗組：取“2.1.1”項下1∶10 供試液9.9ml共5 份，分別加入“2.2”項下金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉5 種試驗菌液各0.1ml，使每1ml 供試液中含菌量不大于100cfu，混勻，取1ml 注入平皿，平行制備2 個平皿。

供試品對照組：取“2.1.1”項下1∶10 供試液9.9ml，以TSB 代替試驗菌液，其余操作同試驗組。

菌液對照組：取TSB 9.9ml 共5 份，分別加入“2.2”項下金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉5 種試驗菌液各0.1ml 進行菌種回收試驗。

按照《中國藥典》2020 年版四部［1］要求，在各組平皿中加入15～20ml 相對應的SDA（用于霉菌和酵母菌總數計數）或TSA（用于需氧菌總數計數），測定各平皿菌落數，計算3 次獨立試驗的平均回收比值，結果詳見表1。

由表1 數據可知，采用平皿傾注法（1∶10）進行需氧菌總數計數時，金黃色葡萄球菌回收比值低于0.5，枯草芽孢桿菌回收比值為0，表明西瓜霜潤喉片對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌活性，且對枯草芽孢桿菌的抑菌活性更強，提示可將二者作為敏感菌株進一步開展試驗。霉菌和酵母菌總數計數的試驗菌株回收比值均在0.5～2，表明該方法可行。

表1 平皿傾注法（1∶10）微生物計數適用性試驗各試驗菌株回收比值

2.4.2 增加稀釋液體積

選取敏感菌株金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，采用平皿傾注法（1∶50，1∶100），選用1 批樣品進行試驗。取“2.1.1”項下1∶50、1∶100 供試液，試驗菌液選取“2.2”項下用于微生物計數的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，其余操作按“2.4.1”項下方法進行。結果顯示，金黃色葡萄球菌的回收比值分別為0.35、0.56，枯草芽孢桿菌的回收比值分別為0.14、0.21。表明西瓜霜潤喉片對枯草芽孢桿菌的抑菌活性很強，不宜繼續采用增加稀釋倍數的方法去除。

2.4.3 需氧菌總數測定

取“2.1.2”項下1∶10 供試液9.9ml 5 份，分別加入“2.2”項下用于微生物計數的5 種試驗菌液各0.1ml，以含10%聚山梨酯80 的TSB 為稀釋劑（代替TSB），其余操作按“2.4.1”項下步驟制備試驗組、供試品對照組和菌液對照組。另取含10%聚山梨酯80 的TSB 9.9ml 作為中和劑對照組，共2 份，操作同“2.4.1”項下試驗組操作步驟，進行中和劑的菌種回收試驗。按照《中國藥典》2020 年版四部［1］要求，在各組平皿中加入15～20ml TSA，測定各平皿菌落數，計算3 次獨立試驗的平均回收比值，結果詳見表2。

由表2 可知，中和劑對照組菌株回收比值均符合標準，表明含10%聚山梨酯80 的TSB 對試驗菌株無抑菌性且無損傷［11］。西瓜霜潤喉片采用中和法進行需氧菌總數計數方法適用性試驗時，試驗菌株的回收比值均在0.5～2 范圍內，表明該方法能有效去除西瓜霜潤喉片的抑菌活性，可用于其微生物限度檢查。

表2 中和法需氧菌總數適用性試驗各試驗菌株回收比值

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗

按照《中國藥典》2020 年版四部［1］要求，西瓜霜潤喉片的控制菌檢查應為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌5 種。

陽性對照組：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌3 種控制菌檢查取“2.1.1”項下1∶10 供試液10ml；耐膽鹽革蘭陰性菌檢查取相當于0.1g、0.01g 和0.001g 的預培養物（“2.1.1”項下1∶10 供試液23℃培養2h）；沙門菌檢查取西瓜霜潤喉片10g。上述供試液及供試品分別加入“2.2”項下用于控制菌檢查的對應菌液，接種至對應的規定培養基，混勻，33℃培養24h。

試驗組：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌3 種控制菌檢查取“2.1.1”項下1∶10供試液10ml；耐膽鹽革蘭陰性菌檢查取1ml 預培養物；沙門菌檢查取西瓜霜潤喉片10g，均不加試驗菌液，其余操作同陽性對照組。

陰性對照組：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌5 種控制菌檢查均以TSB 代替供試液，其余操作同試驗組。

按照《中國藥典》2020 年版四部［1］規定將各組進一步選擇和分離培養。結果表明，按照常規培養基體積檢查時，陰性對照組均無菌落生長，陽性對照組除沙門菌外，大腸埃希菌等4 個陽性對照組均檢出試驗菌，提示西瓜霜潤喉片對沙門菌有抑菌活性，將稀釋液增加至200ml 時，陽性對照組菌落生長良好，表明稀釋法可以消除樣品對沙門菌的抑菌活性。結果詳見表3。

表3 控制菌方法適用性試驗結果

3 討論

3.1 樣品抑菌活性的去除方法

方法適用性試驗是微生物限度檢查結果準確可靠的基礎保證，其本質是建立對樣品影響小且操作效率高的方法［12］。去除樣品抑菌性是其中的重點和難點［13］，應遵循由簡到繁、由單一到聯合的原則。在非無菌制劑的微生物限度檢查中，平皿傾注法因操作簡捷、結果準確而最為常用，但西瓜霜潤喉片的抑菌作用較強，采用稀釋倍數1∶100 時枯草芽孢桿菌的回收比值仍小于0.5。常用的薄膜過濾法首先要求樣品可通過微孔濾膜，本研究在制備1∶10供試液時發現不溶性顆粒較多，不宜選用。適宜的中和劑能有效降低樣品抑菌活性，而且操作效率高，聚山梨酯80 是一種非離子表面活性劑，可增加藥品溶解，且對微生物有一定的保護作用［14-16］，因此本研究使用聚山梨酯 80 作為中和劑。在選擇去除樣品抑菌活性的方法時，建議根據樣品特性對擬采用方法進行評估，不要盲目按照藥典收錄的方法逐一嘗試，避免大量的重復性工作。

3.2 敏感菌株的確定

在檢驗工作以及查閱文獻資料［17-20］過程中發現，有抑菌活性的中藥制劑在需氧菌總數計數中大多對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抑菌作用。基于此，本研究選取金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌開展敏感菌株預試驗，結果與文獻報道一致。建議相關實驗室通過實踐工作或查閱資料后，選用1～2 種敏感菌株開展預試驗進行方法篩選，并根據預試驗結果進一步規范開展方法適用性試驗，減少菌種使用量和檢驗工作量，降低試驗過程中引入微生物污染的風險，提高檢驗準確性。

3.3 統一管理藥品方法適用性試驗資料

現階段藥品檢驗機構獲取方法適用性資料的主要方式是和生產企業溝通，其人力和時間成本較高。建議由省級藥品監督管理機構牽頭，利用信息化建設平臺，將本轄區內所生產的藥品方法適用性試驗資料統一網絡化管理，并將可公開的項目內容采取適宜的方式發布。

4 小結

本研究建立了西瓜霜潤喉片的微生物限度檢查方法：需氧菌總數計數采用中和法；霉菌和酵母菌總數計數采用平皿傾注法（1∶10）；大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌檢查采用常規培養基體積；沙門菌采用培養基稀釋法。該方法結果穩定，重現性好，可用于西瓜霜潤喉片的微生物限度檢查。