小麥BES1轉(zhuǎn)錄因子基因 TaBEH3的克隆及表達(dá)分析

姜玉梅，張 京，李巧云，莊季昕，牛吉山

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450046；2.國家小麥工程技術(shù)研究中心/河南省小麥技術(shù)創(chuàng)新中心，河南鄭州450046)

BES1(brassinosteroid insensitive 1-EMS-suppressor 1)是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族。Yin等利用化學(xué)誘變劑甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)誘變擬南芥突變體，首次篩選到油菜素內(nèi)酯(BR)受體抑制因子BES1。基因在調(diào)節(jié)植物體內(nèi)BR信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)植物體內(nèi)BR信號(hào)被激活后，基因直接或間接地與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，如基因通過調(diào)節(jié)根尖分生組織發(fā)育基因的表達(dá)，控制根的發(fā)育;基因也可以通過植物莖尖分枝改變植株結(jié)構(gòu)，影響作物產(chǎn)量。除介導(dǎo)BR信號(hào)傳導(dǎo)外，基因還參與植物體內(nèi)脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)以及光等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如基因通過抑制基因的表達(dá)，使得ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，導(dǎo)致苗期發(fā)育緩慢;還可以通過調(diào)控miR396d的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，而基因參與GA合成以及信號(hào)傳導(dǎo)，控制植株的形態(tài)構(gòu)成。

基因自發(fā)現(xiàn)以來，其功能研究主要圍繞模式作物擬南芥進(jìn)行研究。近年來，家族基因在小麥、玉米等農(nóng)作物中陸續(xù)被克隆或鑒定。()作為基因家族中的重要成員，在植物正常生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。Chen等發(fā)現(xiàn)，基因突變可導(dǎo)致擬南芥花藥絨氈層細(xì)胞的異常發(fā)育。Tomoyuki等發(fā)現(xiàn)，BEH3作為一個(gè)潛在的干細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，對(duì)維管束細(xì)胞的穩(wěn)定發(fā)育具有重要意義。Nguyen等發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，可通過泛素化和BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在滲透應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期已對(duì)小麥基因家族成員進(jìn)行了鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)基因在小麥根和穗中均具有較高的表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上，本研究擬克隆基因，并對(duì)的3個(gè)同源基因的基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化以及時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期為進(jìn)一步解析基因在小麥生長發(fā)育過程中的重要作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種為中國春(Chinese Spring)，于2020-2021年度種植于河南省鄭州市滎陽市豫龍鎮(zhèn)后王村試驗(yàn)基地(34°25′N, 115°39′E)。種植間距和肥水管理按照常規(guī)田間管理。取處于雌雄蕊分化期的根、莖、葉、幼穗以及抽穗期的雌蕊和雄蕊，取樣后立即置于液氮中保存。

1.2 總RNA的提取以及cDNA的合成

1.3 小麥 TaBEH3基因的生物信息學(xué)分析

本課題組前期研究結(jié)果顯示，小麥基因家族中具有3個(gè)典型的組織特異性表達(dá)基因(轉(zhuǎn)錄本ID分別為TraesCS3A02G139000.1、TraesCS3B02G156600.1、TraesCS3D02G139300.1)，根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)的注釋信息和基因在染色體上的位置，對(duì)3個(gè)基因暫命名為、、，從Ensemble Plants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/)中獲取相應(yīng)的基因編碼區(qū)序列和蛋白序列，通過Pfam(http://pfam.xfam.org/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)共同預(yù)測并驗(yàn)證、和基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。用MEGA 7.0軟件對(duì)普通小麥(L.)以及親緣關(guān)系較近的10個(gè)物種的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，用鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，通過DNAMAN 6.0將序列比對(duì)結(jié)果可視化。

1.4 小麥 TaBEH3基因的克隆

1.5 小麥 TaBEH3基因的表達(dá)模式分析

1.5.1 不同組織的表達(dá)模式分析

表1 本研究使用的引物信息

1.5.2 ABA脅迫處理下基因的表達(dá)模式分析

選擇籽粒飽滿的中國春種子，經(jīng)75%乙醇以及0.2%的次氯酸鈉消毒后，將種子鋪在裝有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置參考文獻(xiàn)中的參數(shù)。待培養(yǎng)至兩葉一心期時(shí)，用100 μmol·L的ABA處理，分別在處理后0、4、8、12和24 h取中國春的葉片，提取各處理幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qRT-PCR，cDNA的合成同1.2，qRT-PCR所用引物以及擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序方法同1.5.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 TaBEH3基因的克隆結(jié)果及序列分析

以中國春幼穗組織的cDNA為模板，利用/B-F/R、-F/R兩對(duì)引物序列(表1)分別對(duì)、、基因進(jìn)行克隆，其中和所用的引物序列相同。PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖1)顯示，這3個(gè)基因均在1 000 bp處得到與預(yù)期大小一致的目標(biāo)條帶。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接至pESI-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)菌落PCR結(jié)果，挑選陽性單克隆進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)、、與TraesCS3A02G139000.1、TraesCS3B02G156600.1、TraesCS3D02G139300.1的編碼區(qū)序列完全一致。編碼區(qū)序列比對(duì)結(jié)果表明，、和均包含2個(gè)外顯子，和基因的序列相似性為94.68%，和基因的序列相似性為94.15%，和基因的序列相似性為95.73%。

M: DL2000; A: TaBEH3-A; B: TaBEH3-B; D: TaBEH3-D.

2.2 小麥 TaBEH3基因的結(jié)構(gòu)分析

對(duì)基因上游2 000 bp的序列進(jìn)行啟動(dòng)子序列分析，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，、和的啟動(dòng)子區(qū)域含有大量與植物生長發(fā)育、激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。其中，生長素響應(yīng)元件(AuxRR-core)僅存在于基因中，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif)僅存在于和基因中，水楊酸響應(yīng)元件(TCA-ele-ment)僅存在于和基因中。此外，分生組織表達(dá)元件(CAT-box)和脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)在3個(gè)基因的啟動(dòng)子序列中普遍存在。推測、和基因?qū)χ参锏慕M織分化具有重要作用，且對(duì)ABA的響應(yīng)機(jī)制具有極高的相似性。

圖2 小麥 TaBEH3基因啟動(dòng)子的順式作用元件分析

對(duì)、和基因編碼的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)(圖3)，、和基因分別編碼356、354和358個(gè)氨基酸，3條蛋白序列之間共存在4個(gè)氨基酸差異，且差異氨基酸都存在于C端，TaBEH3蛋白保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列并未發(fā)生任何改變，均含有完整的基因家族結(jié)構(gòu)域。綜上所述，基因在小麥進(jìn)化過程中十分保守。

紅色方框?yàn)門aBEH3蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

2.3 小麥TaBEH3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用小麥TaBEH3蛋白與其他物種BEH3蛋白的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果(圖4)表明，13條氨基酸序列聚類成兩個(gè)大類，其中擬南芥()、粳稻()、玉米()、高粱()和谷子()聚為一類，且TaBEH3蛋白與擬南芥和粳稻BEH3蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；普通小麥()、烏拉爾圖小麥()、二粒小麥()、粗山羊草()、大麥()和二穗短柄草()這幾個(gè)麥類作物聚為一類，表明TaBEH3蛋白在麥類作物中具有較高的保守性。

圖4 小麥TaBEH3蛋白與其同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 小麥 TaBEH3基因的表達(dá)模式分析

2.4.1 小麥基因在不同組織中的表達(dá)模式

對(duì)基因在小麥雌雄蕊分化期的根、莖、葉、幼穗以及抽穗期的雌蕊和雄蕊進(jìn)行表達(dá)模式分析，結(jié)果(圖5)表明，、和基因在不同組織中的表達(dá)模式具有極高的相似性，在各個(gè)組織中均有表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)量有差異。與、和基國在根中的表達(dá)量相比，、和基因在抽穗期的雌蕊和雄蕊中均具有較高的表達(dá)量，且差異達(dá)顯著或極顯著水平，表明基因在花器官的發(fā)育形成過程中具有重要作用；而、和基因在葉和穗中的表達(dá)量較低，與在根中的表達(dá)量之間差異達(dá)顯著或極顯著水平；、和基因在根和莖中的表達(dá)量均無顯著差異。

*和**分別表示 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D基因的表達(dá)量與根組織中的表達(dá)量差異達(dá)到顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。

2.4.2 小麥基因在ABA脅迫處理下的表達(dá)模式

對(duì)基因在ABA脅迫處理下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果(圖6)表明，ABA脅迫處理下，、和基因在ABA脅迫處理后的變化趨勢具有相似性，均表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢，在脅迫處理12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。基因在脅迫處理8、12和24 h時(shí)的表達(dá)量顯著高于脅迫處理0和4 h時(shí)的表達(dá)量，和在脅迫處理8和12 h時(shí)的表達(dá)量顯著高于脅迫處理0、4和24 h的表達(dá)量。

**表示 TaBEH3基因的表達(dá)量與ABA處理0 h相比差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

3 討 論

目前，已在149種植物中發(fā)現(xiàn)了BES1轉(zhuǎn)錄因子。普通小麥?zhǔn)堑湫偷木哂蠥ABBDD基因組的異源六倍體，其基因組在所有禾本科作物基因組中最為龐大。本課題組前期對(duì)小麥基因家族進(jìn)行鑒定和分析，發(fā)掘出3個(gè)在小麥生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的基因。本研究根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中這3個(gè)基因的注釋信息和在染色體上的位置暫命名為、和。對(duì)、和進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)基因的序列具有高度相似性，且其表達(dá)模式也表現(xiàn)出相似性，這與Pfeifer等的研究結(jié)果一致。

ABA是植物體內(nèi)一種重要的內(nèi)源激素，在植物生長發(fā)育和抗逆過程中發(fā)揮著重要作用。Jiang等研究發(fā)現(xiàn)，基因?qū)R激素信號(hào)調(diào)控具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，、和基因響應(yīng)ABA激素脅迫，且其響應(yīng)ABA脅迫的表達(dá)模式也高度相似，推測是由于3個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域普遍存在ABA響應(yīng)元件(ABRE)而導(dǎo)致感知信號(hào)能力相似。Zhang等發(fā)現(xiàn)，外源ABA與BR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有相互作用，BR響應(yīng)基因/的表達(dá)受ABA調(diào)控。通過對(duì)基因啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子區(qū)域含有大量與植物生長發(fā)育、激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。推測基因直接或間接地參與其他激素在植物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程，如生長素和BR在光形態(tài)建成過程中共同控制植物生長，而植物生長素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子ARF5和基因共同調(diào)控與植物生長發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物生長。此外，基因通過和GA信號(hào)負(fù)調(diào)控因子DELLA蛋白的結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控細(xì)胞伸長的目的。

基因作為基因家族的重要成員之一，目前已被證實(shí)其在保證植物正常生長發(fā)育和維持植物形態(tài)構(gòu)成過程中發(fā)揮著重要作用，但基因在小麥中的研究報(bào)道還相對(duì)較少，有必要進(jìn)一步研究基因在小麥生長發(fā)育中的作用機(jī)理。