幽門螺桿菌檢測技術的研究進展*

鄧小蝶，李強，陳曦，包郁

610054 成都, 電子科技大學 醫學院(鄧小蝶);610041 成都,四川省腫瘤醫院·研究所,四川省癌癥 防治中心,電子科技大學醫學院 胸外科(李強),內鏡診治部(陳曦、包郁)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,HP)在1994年被世界衛生組織定為I類致癌源。而2017年世界衛生組織公布了“12種最危險的耐藥細菌”，HP再次位列其中，這表明HP感染是世界范圍內的一個重要公共衛生問題。HP與胃黏膜萎縮、腸上皮化生、胃癌以及其他胃惡性腫瘤如胃MALT淋巴瘤息息相關[1]，感染HP是胃癌的最大危險因素，全球大約有75%的胃癌負擔和5.5%的惡性腫瘤可歸因于HP誘導的炎癥和損傷[2]。一項大規模的隊列研究顯示，根治HP可以有效地降低胃癌的發病率以及死亡率[3]。預計在未來的20～30年中,檢測和根除HP仍將是消化系統腫瘤防控的熱點，因此如何準確診斷HP感染是有效防控胃癌發生的前提。本文就HP感染診斷相關檢測技術的進展做一綜述。

1 侵入性檢查

1.1 內鏡檢查

根據《京都胃炎分類》，在普通白光內鏡下，感染HP后的胃黏膜主要表現為彌漫性發紅、黏膜腫脹、點狀發紅、皺襞腫大蛇形，而未感染HP的胃黏膜表現為存在清晰、分布規則排列的集合靜脈(regular arrangement of collecting venules,RAC)、胃底腺息肉、出血性糜爛、出血點等[4]，由此來判定是否感染HP。隨著內鏡技術迅速發展，放大內窺鏡、色素內鏡、內鏡窄帶成像(narrow band imaging，NBI)、激光共聚焦內窺鏡，智能分光比色內鏡等新型內鏡技術可以清晰觀察到胃表面的微細結構，如胃小凹、微血管和細胞形態，為確診HP感染提供了大量相關信息。

有學者納入1 897名患者，分別使用普通內窺鏡、放大白光內窺鏡、放大色素內窺鏡來對比三者在預測HP感染的診斷性能，結果顯示NBI模式的放大內窺鏡可以較為準確地預測HP的感染狀態[5]。而相較于傳統白光模式，藍色激光成像中的彩色聯動成像模式可以更好地識別彌漫性發紅、RAC消失和粘液附著，并據此來評價HP感染[6]。日本學者Nishikawa等[7]將藍色激光成像觀察到的萎縮性黏膜形態分為斑點狀、裂紋狀和斑駁狀，根據這三種模式來診斷是否有HP感染。而激光共聚焦內窺鏡能以1 000倍的放大倍數對胃黏膜進行亞表面分析，直接在內鏡下觀察到聚集生長的HP，成為診斷HP的直接征象[8]。但內鏡檢查的敏感性和特異性與常規診斷方法相比還有一定差距，而且對內鏡醫師經驗技術要求高，具有局限性，尚不能作為診斷依據；在臨床上更多用于為快速尿素酶測試和組織學取材，為行HP檢查做準備。

1.2 快速尿素酶試驗(rapid urease test,RUT)

RUT需在胃鏡檢查過程中進行，可通過HP可以產生脲酶這一特性，間接證明HP是否存在。其原理基礎是檢測胃黏膜內是否存在脲酶，將胃黏膜或者黏液樣本添加到試管、凝膠或者其他樣本與尿素接觸的設備之中，檢測尿素水解產物——氨或者二氧化碳。通過觀察pH變化來檢測HP，簡單又可靠，適應范圍廣。

RUT因試劑廉價、反應速度快、操作方便等優點廣泛應用于臨床，但其檢測結果受到各種因素影響，主要是HP密度的分布,而影響HP密度關鍵的因素是藥物，如質子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)、抗生素、鉍劑等藥物的使用會抑制HP的生長，在測試中引起假陰性反應[9]。PPI已被證實會造成HP感染假陰性的結果，有假設將其歸因于“特征的PPI效應”，即PPI促進局部擴張的含氧腺體，扁平或肥大的壁細胞突出到其管腔內，掩蓋了胃表面的微生物[10]。為了避免假陰性結果，建議在RUI檢查2周前停用PPI，4周前停用抗生素、鉍劑等影響HP生長的藥物。如上所述，若之前曾進行過根治HP，治療后HP密度降低，在胃內分布發生改變，易造成檢測結果假陰性，因此不推薦使用RUT試驗用于根除治療后HP狀態的評估。

1.3 細菌培養

作為檢測HP的金標準，細菌培養在我國各級醫院并未常規使用，因其培養條件要求高，培養過程繁瑣，培養時間長，鑒定手段少。陳彬等[11]總結出一套HP體外培養的最優方案：選用適宜培養基(布氏瓊脂、哥倫比亞瓊脂或腦心浸液瓊脂均可)，加熱溶解，在溫度下降至40℃～50℃時加入胎?；蜓蜓澹偌尤肱渲坪玫?%的抗生素混合液；調節pH為7.5，培養基凝固后，將活檢組織經非選擇性培養基培養而得到的HP菌液接種，置入含充足CO2的微需氧環境的培養罐或其它密閉裝置中，在溫度37℃，濕度90%～100%條件下培養72小時左右，即可出現HP菌落。取少量菌落于顯微鏡下觀察，或者行HP生化(脲酶試驗、氧化酶試驗)、抗原試驗鑒定是否培養成功。

繁瑣的培養步驟加上培養周期過長導致培養法難以滿足臨床需求，并且取材需要通過行電子胃鏡檢查，對于兒童、老年人也不適用。一般而言，細菌培養+藥敏試驗主要用于個體化治療。多項研究表明，基于藥敏試驗的HP根除率要遠遠高于經驗治療[12-13]。因此，細菌培養主要用于經驗治療失敗的難治性HP感染。除此之外，HP培養還可用于科研，如細菌分型和致病性研究、地區耐藥性的調查、新藥研發等。

1.4 組織學切片和組織化學染色鏡檢

胃黏膜標本還可以做組織學切片和組織化學染色來檢測HP。在顯微鏡下，HP呈典型的S狀或者海鷗狀彎曲，主要位于黏膜層表面或胃腺窩部。獲得的組織學切片通過染色，根據HP所在部位與染色后的典型形狀，據此將其與其他雜菌分開。另外，組織學檢查也被認為是直接診斷HP的金標準。

在組織學檢測中，染色方法尤為重要，HP常用的染色方法主要包括：HE染色、美藍染色、Giemsa染色、Warthin-Starry銀染色、免疫組化染色等。HE染色方便快捷、廉價，但HP是弱嗜蘇木素菌，所以菌體顏色較淡，當HP數量較少時易漏診。傳統Giemsa染色耗時長，有學者通過改良Giemsa染色縮短時間、減少有機化學品的接觸，獲得了較高的準確性[14]。在免疫組化染色中，HP呈深棕色，細胞核呈藍色，菌體與背景顏色對比鮮明，陽性極易觀察，大大節省了病理醫師的閱片時間。但在一般情況下，采用HE染色制劑，再通過仔細地顯微鏡觀察足以鑒定HP感染[15]，免疫組化染色并不推薦常規使用，因為會增加不必要的醫療支出。

2 非侵入性檢查

2.1 尿素呼氣試驗(urea breath test，UBT)

尿素呼氣試驗是最常用的非侵入性檢測HP方法，主要原理是HP可產生相對特異的尿素酶，尿素酶可分解尿素產生NH3和CO2。被檢者口服核素(13C或14C)標記的尿素后,若胃內存在HP，則其產生的尿素酶可分解尿素，從而產生核素標記的CO2,CO2彌散入血,經肺呼出。通過收集受試者服藥前后(13C-UBT)或僅服藥后(14C-UBT)呼出的氣體,使用相應儀器檢測呼氣中核素標記的CO2,就可判斷其是否有HP感染。若無HP感染,核素標記的尿素不被分解,則呼氣中不含核素標記的CO2。

UBT是臨床上最受推薦的非侵入性HP檢測方法，簡便、快捷、費用低、準確性相對較高。但UBT的準確性同時也受多種因素影響,首先是檢測試劑的質量、檢測儀器的類型、性能,這些是最為關鍵的因素；其次是規范的操作(嚴格的氣體收集時間、訓練受試者正確收集氣體)、儀器校準。UBT檢測所需的元素為13C或14C，13C-UBT需用氣相質譜儀進行測定，不具有放射性，可以進行定量檢測。但氣相質譜儀這種貴重、精密的儀器設備很難在基層醫院之間普及,佟思羽等[16]通過回顧性研究比較13C尿素呼氣試驗和14C尿素呼氣試驗檢測HP感染，結果提示兩者檢出陽性率無明顯差異。但13C尿素呼氣試驗在便捷性和體驗度方面優于14C尿素呼氣試驗，而14C尿素呼氣試驗成本效益優于13C尿素呼氣試驗。另外，有研究利用基于13C-UBT的新測試餐，其中含有蘋果酸、檸檬酸，這種高濃度的有機酸混合物可以通過降低pH值、延緩胃排空，提高HP的脲酶活性[17]，促進13C-尿素在胃內的彌散分布，增加其在胃內同HP接觸的面積和時間，從而提高檢測的陽性率。

2.2 基于量子級聯激光器(Quantum Cascade Laser，QCL)的呼氣檢測系統

基于量子級聯激光器的呼氣檢測系統原理與UBT的檢測原理相似，被檢者同樣是通過口服核素標記的尿素,檢測患者的呼出氣體來確定是否感染HP；目前市場上尿素呼氣試驗方法所采用的儀器多是紅外線能譜分析儀；而量子級聯激光器作為一種新型的半導體激光器，相較于紅外線能譜分析儀，其具有波長輸出范圍寬、功能消耗低等優點[18],并且QCL是僅有的可以在室溫產生中紅外輻射的半導體激光器，基于QCL激光器的系統可以在近室溫條件下工作，易于小型化[19]，大大提高了檢測HP的便捷性。

基于QCL的檢測系統可以通過監測呼出氣體來診斷HP。與UBT不同的是，QCL激光器不僅具有良好的靈敏度和選擇性，價格也相對低廉。有很多學者應用基于量子級聯激光器的儀器來進行氣體檢測，如二氧化碳[20]。另外，也有學者將量子級聯激光器應用于健康兒童、穩定期哮喘兒童、穩定期囊性纖維化患兒呼氣分析對比，結果顯示，該儀器可以很好地將三者區分[21]，這提示量子級聯激光光譜學在研究呼氣中揮發物的診斷具有極大潛力。目前基于量子級聯激光器的儀器在醫學診斷上的使用率正在逐步增加，因其無創、價格低廉，易于推廣，在將來的HP檢測乃至其他疾病檢測或診斷領域或可占有一席之地。

2.3 尿氮排出試驗

尿氮排出試驗的應用原理與尿素呼氣試驗相似，被檢者口服同位素15N標記的尿素，收集被檢者2小時的尿液，利用質譜法檢測尿中15N-氨的排出率，以此來判定是否感染HP。這一試驗具有無創、無放射性損傷、可做定量分析、反應整體感染情況和克服了活檢標本HP分布不均等問題[22]。需要注意一點的是，尿氮代謝物經肝腎代謝，因此，有嚴重肝腎功不全者慎用。

2.4 糞便抗原試驗(stool antigen test，SAT)

HP定植于胃黏膜上皮細胞，隨著黏膜上皮更新，含有HP抗原的代謝產物、死亡菌體崩解等作為特異性抗原隨著上皮細胞脫落，這些抗原可以抵御消化酶的降解，通過胃腸道隨糞便排出。Opekun等[23]進行了一項前瞻性研究來評估糞便抗原試驗的檢測性能，利用新型糞便抗原試劑盒LIAISON?MeridianH.pylori與傳統方法(組織學、培養或快速尿素酶檢測)相比較，該試劑盒具有良好的敏感性(95.5%)和特異性(97.6%)；但在Best等[24]的研究結果中，糞便抗原試驗的準確性和敏感性并不太樂觀，說明SAT的敏感性及特異性存在較大差異，可能是由于不同HP菌株抗原存在差異,因此SAT試劑的準確性在應用前需在當地進行驗證后，再推廣應用。

糞便抗原檢測也不可避免地會受到質子泵抑制劑、抗生素等藥物的影響，從而產生假陰性結果[25]。除此之外，糞便標本的質量、標本的運輸、糞便的保存條件、以及取樣本與處理的間隔時間也會對其結果產生影響[26]，糞便抗原試驗的優勢主要在于無需口服任何藥物，患者接受度高，適用人群范圍廣。

2.5 血清學檢測

血清學檢測主要是通過檢驗HP抗體來確定是否有HP感染,其中包括蛋白芯片法、免疫印跡法、快速膠體金法、酶聯免疫吸附試驗法和膠乳增強免疫比濁法等。血清學檢測不受藥物的影響，但血清抗體效價的產生要求抗原持續刺激，因此在早期檢測血清學可能會出現假陰性的結果。而根除HP長一段時間內，血清抗體都持續存在，無法區分現癥感染和既往感染，也無法評估根除HP后的療效。

單一血清學檢測因無法區分現癥感染和過去感染，通常不用于檢測HP，但其相較于UBT等檢查方法而言，不受藥物、潰瘍出血、胃萎縮等的影響，而且簡便、快速、廉價等優點被廣泛用于大范圍流行病學調查以及回顧性研究。Butt等[27]通過聯合檢測HP的VACA、GroEL、HCPC和HP1564四種蛋白，特異性高達90%，敏感性為100%；在HP根除成功的參與者中，6個月后評估VACA、HCPC和HP1564的抗體水平顯著降低，該結果提示多重血清學檢測對于判定HP活動性感染具有一定優勢。

3 分子生物學技術

3.1 聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction,PCR)

在1990年，Hoshina等[28]首先將PCR技術應用于HP的診斷。PCR技術可以直接測核酸，檢測出微量DNA模板，明顯提高了HP診斷的敏感性和特異性。除了檢測HP，PCR還能進行菌株亞型鑒定以及HP耐藥基因型檢測。另外，與傳統方法尿素呼氣試驗、快速尿素酶試驗相比，實時熒光定量PCR法在診斷HP準確性上并無差異[29]，還能提供抗HP相關抗生素的耐藥性等信息；Peng等[30]的研究表明基于檢測胃液的實時PCR在檢測HP對克拉霉素的耐藥性中，也具有較高的敏感性與特異性。微滴數字PCR法是一種基于油水乳滴生成的直接聚合酶鏈式反應，單個樣本的PCR反應被分成數千個液滴(10,000～100,000個不等)，樣本分子在每個單獨的液滴中被放大，然后使用熒光檢測器對陽性液滴進行檢測，提高了對微量標本檢測的敏感性；在常規方法診斷為陰性的患者中，微滴數字PCR檢測到低密度“隱匿性”HP感染的比例很高(可達36%)[31]。

PCR的檢測樣本包括活檢組織、唾液、糞便[32]，擴大了PCR檢測樣本的多樣性；其用途廣泛，包括HP感染的確診、抗生素耐藥性的檢測，菌株分型等等[33-34]。但高精密度的儀器、反應所需的試劑、人員的專業性等要求限制了其推廣使用。

3.2 環介導恒溫核酸擴增技術(loop-mediated isothermal nucleic acid amplification technology，LAMP)

LAMP是一種體外等溫核酸擴增技術，該技術具有靈敏度高，反應迅速、特異性強等優點。LAMP由2對引物和1種DNA聚合酶組成。在利用糞便樣本檢測HP感染中，相較于糞便抗原檢測、PCR技術，LAMP的診斷性能都要優于前兩者[35-36]。有研究者將LAMP的特異性、敏感性、陽性預測值和陰性預測值與常用檢測方法(細菌培養、快速尿素酶試驗和PCR綜合)相比，結果顯示，LAMP的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為100%、30.76%、87.67%和100%[37]。與其他分子生物學技術相比，LAMP不需要逆轉錄、模板變性、在擴增循環過程沒有溫度變化，基因的擴增和檢測可以一步完成，在2個小時之內就可獲得結果；而結果的讀取也十分便捷，擴增產物在紫外燈或日光下通過肉眼就可判定[38]。但LAMP中6個目標區域和2對引物需要完全覆蓋，這導致LAMP的引物設計非常繁瑣復雜，并且容易產生非特異性擴增，因此可以對其進行進一步優化引物設計過程，使其引物設計更加便捷精簡。

4 其他檢測方法

目前有很多新型檢測技術正在用于HP感染的檢查。有學者[39]就提出了一種使用谷氨酰轉肽酶(γ-Glamyl transspeptidase，GGT)激活熒光探針的新方法：γ-谷氨酰羥甲基羅丹明綠色探針與GGT反應，立即產生熒光，利用HP可以產生谷氨酰轉肽酶這一特點，使用熒光探針來檢測胃活檢組織中是否含有HP。它的主要優勢是結果快速獲得(15分鐘)，而靈敏度仍然有限(75%～82%)。因測序成本的降低，現在新一代測序(next-generation sequencing，NGS)可以添加到醫療設備中，以檢測HP及其抗生素耐藥性，已經有多個學者將NGS用于檢測HP感染，在給予根除HP的藥物之前，NGS可以快速并且準確地提供HP基因型[40-41]，從而指導臨床治療方案的選擇。除此之外，還有一種基于DNA酶的HP比色紙傳感器可以用來檢測糞便中的HP感染[42]。

5 總 結

診斷HP方法多種多樣，各有其優劣勢，對這些方法進行評價有助于指導臨床選擇。評價診斷方法的指標主要包括準確性、便捷性、費用。既往文獻報道的各種HP感染檢測方法的特點總結于表1[43-44]。

綜上所述，侵入性檢查以及非侵入性檢查都各有其優勢與劣勢，臨床醫生可結合患者和當地醫院的實際情況，根據不同方法的原理及各自優缺點，選擇適宜的檢查方法，及時準確地進行檢查和治療，最小程度上減輕患者的心理和經濟負擔。只有早發現、早治療，通過降低HP感染率，才能有效地降低胃癌及其他惡性腫瘤的發病率和死亡率。

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