微小RNA-455-3p下調TRIM27對鼻咽癌細胞增殖、凋亡的影響

黃香春，譚雪萍，廖天志

作者單位：恩施土家族苗族自治州中心醫院，a耳鼻喉科，b中西醫結合腫瘤科，湖北 恩施 445000

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是發生在鼻咽黏膜上皮的一種惡性腫瘤，其發病率居耳鼻咽喉惡性腫瘤之首［1-3］。鼻咽癌容易發生轉移及復發，其預后較差。因此，早期診斷和治療具有重要意義。miRNA為長度在19～25個核苷酸的內源性穩定的短鏈非編碼RNA，其在人類多種疾病中均具有重要的調控作用，尤其是癌癥［4-5］。miR-455-3p 在多種癌癥的發生發展中均具有調控作用，但其在鼻咽癌中的作用研究甚少。含有三聯基序的27（tripartite motif 27，TRIM27）屬于三結構域（TRIM）蛋白家族，其含有由RING 指，B 盒鋅指和卷曲螺旋結構域組成的三聯基序［6-7］。它最初被鑒定為與轉染期間排列的RET（rearranged during transfection，RET）原癌基因融合伴侶，其在多種腫瘤中均出現表達異常升高［8-10］。據報道，TRIM27 在舌鱗癌中可被miR-299-3p 靶向負調控而參與癌細胞的增殖、遷移和侵襲［11］。但TRIM27 與miR-455-3p 在鼻咽癌中的作用及機制尚未有研究。本研究自2020 年1—7 月探討miR-455-3p對5-8F細胞增殖、凋亡的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細胞5-8F、CNE-1 和鼻咽上皮細胞NP69 均購自中國科學研究院細胞庫；胎牛血清購自鄭州九龍生物制品有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）購自上海威奧生物科技有限公司；LipofectamineTM2000 購自北京宜科思源科技有限公司；二辛可寧酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自北京艾然生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自Roche 公司；PVDF 膜購自日本中興化成；ECL 發光液購自上海信帆生物科研所；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京百奧萊博公司。兔抗TRIM27 抗體（ab137638）和羊抗兔HRP 標記的IgG（ab205718）購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 5-8F、CNE-1 和NP69 的培養：使用DMEM 培養基（15%胎牛血清）進行常規培養、傳代。

1.2.2 細胞轉染與分組 正常培養的人鼻咽癌細胞5-8F、CNE-1、鼻咽上皮細胞NP69 分別標記為NP69 組、5-8F 組、CNE-1 組。將miR-NC、miR-455-3p mimics、pcDNA3.1、pcDNA3.1- TRIM27、si-NC、si-TRIM27、miR-455-3p mimics + pcDNA3.1、miR-455-3p mimics+pcDNA3.1-TRIM27用3倍量的脂質體來轉染，將其轉染至5-8F，轉染6 h 后，棄去培養液，繼續培養48 h，用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）確認轉染的效率如何。轉染成功后分別標記為miR-NC 組、miR-455-3p 組、pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-TRIM27組、si-NC 組、si-TRIM27組、miR-455-3p + pcDNA3.1 組、miR-455-3p + pcDNA3.1-TRIM27組，用于后續試驗。

1.2.3 qRT-PCR 實驗檢測細胞中miR-455-3p、TRIM27 的mRNA 的表達 收集待檢測的細胞，用RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒提取總RNA并合成cDNA。最后用qRT-PCR 試劑盒檢測其中miR-455-3p、TRIM27 的表達。以U6、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，用2-ΔΔCt計算miR-455-3p、TRIM27的表達。引物信息（5'-3'）：miR-455-3p 正向引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG， 反 向 引 物GCAATTCAGTTGAGCGATGTAG；TRIM27 正向引物AGCCCATGATGCTCGACTG，反向引物GGGCACGACACGTTAGTCA；GAPDH：正向引物TCC CTC AAG ATT GCT AGC AA，反向引物AGATCCACAACGGATACATT；U6 正向引物CTCGCTTCGGCAGCACA，反向引物AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測細胞中TRIM27 的蛋白表達 收集待檢測的細胞，用蛋白裂解液在冰上充分裂解，提取總蛋白，用考馬斯亮藍對蛋白進行定量，然后在沸水中煮沸10 min，進行變性。取變性后的上清液進行蛋白的電泳上樣。然后按照蛋白質印跡的常規操作流程進行電泳、轉膜、一抗孵育、二抗孵育、顯影曝光。我們在進行曝光時選用的是ECL 發光試劑盒。對圖像的分析使用的是Quantity One 4.62 軟件。結果以TRIM27 條帶的灰度與GAPDH 條帶的灰度之比表示TRIM27的蛋白表達。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測細胞的增殖 收集待檢測的細胞，取100 μL 的5×105濃度的細胞在96 空板上，再加入適量MTT 溶液（10∶1 的比例），培養4 h，再加入等量DMSO，使其充分溶解，調整酶標儀吸光值至490 nm 波長，在此波長下檢測細胞的吸光度（A）。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI 流式細胞術檢測細胞的凋亡 收集待檢測的細胞，用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒要求處理細胞，依次加入Annexin V-/FITC、PI，反應結束后立即上流式細胞儀檢測分析凋亡情況。

1.2.7 生物信息學分析 采用在線靶基因預測庫target scan（http：//www.targetscan.org/）預測miR-455-3p的靶基因。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-455-3p 與TRIM27 的結合力 將野生型序列（TRIM27-WT）和突變型序列（TRIM27-MUT）克隆至PUC-T載體，并純化。同時將psiCHECK-2載體用同樣的方法進行處理，再用點擊法將TRIM27-WT、TRIM27-MUT 與psiCHECK-2 載體插入感受態細胞中，最后用LB培養基篩選優勢菌株，并擴大，提取質粒DNA，待用。將psiCHECK2-TRIM27-WT、psi-CHECK2-TRIM27-MUT 分別與miR-NC、miR-455-3p共同轉染到5-8F。按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明要求操作，將psiCHECK2-TRIM27-3'UTR WT 和psiCHECK2-TRIM27-3'UTR MUT 的表達作為對照，海腎熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值表示miR-455-3p 與TRIM27 在細胞中的結合能力。

1.3 統計學方法 實驗中所有數據均采用Graph-Pad Prism 7.0 分析處理。計量資料用±s 表示，多時間點觀測資料比較采用重復測量方差法分析，多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗，兩組比較用獨立樣本t 檢驗，P＜0.05 代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-455-3p 在NP69、5-8F、CNE-1 中的表達結果顯示，NP69 組、5-8F 組、CNE-1 組細胞中miR-455-3p mRNA 的表達分別為（1.37±0.06）、（0.42±0.02）、（0.96±0.05），F =314.35，P =0.001。與NP69組相比，5-8F組、CNE-1組細胞中miR-455-3p的表達均顯著降低（P＜0.05）。

2.2 miR-455-3p 過表達對5-8F、CNE-1 增殖和凋亡的影響 結果顯示，與miR-NC 組相比，miR-455-3p 組5-8F、CNE-1 中miR-455-3p 的表達均顯著升高［（1.58±0.11）和（0.53±0.04），（1.53±0.11）和（1.07±0.06）］，24、48、72 h時，5-8F、CNE-1細胞的活性均顯著降低［（0.41±0.02）和（0.76±0.03），（0.63±0.03）和（1.16±0.05），（1.25±0.05）和（1.86±0.11）；（0.51±0.02）和（0.74±0.03），（0.73±0.03）和（1.08±0.05），（1.25±0.05）和（1.53±0.11）］，細胞凋亡率均顯著升高［（19.06±1.26）和（7.33±0.51），（12.06±1.03）和（7.91±0.66），P＜0.05］。

2.3 miR-455-3p 靶向TRIM27 通過生物信息學分析預測顯示，miR-455-3p 與TRIM27 的3’UTR 端含7 個互補的核苷酸序列GUCAGGU（圖1）。與miR-NC 組相比，miR-455-3p 組WT-TRIM27 細胞熒光活性顯著降低（表1）；miR-NC、miR-455-3p、antimiR-NC、anti-miR-455-3p 組TRIM27 的蛋白表達量分別為（0.66±0.04）、（0.31±0.01）、（0.70±0.05）、（1.18±0.06），miR-455-3p 在細胞中的表達量與TRIM27 的表達量之間呈明顯的負調控關系（F=196.65，P=0.001）。見圖2。

圖1 TRIM27的3’UTR中含有miR-455-3p的互補核苷酸序列

表1 雙熒光素酶報告實驗/±s

表1 雙熒光素酶報告實驗/±s

組別miR-NC miR-455-3p t值P值重復次數33 WT-TRIM27 1.06±0.06 0.34±0.01 20.50 0.000 MUT-TRIM27 1.03±0.04 0.96±0.03 2.43 0.072

圖2 蛋白質印跡法檢測miR-455-3p對TRIM27表達的影響

2.4 抑制TRIM27 表達對鼻咽癌細胞系5-8F 增殖凋亡的影響 結果如圖3；表2，3 所示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-TRIM27 組5-8F 細胞中TRIM27的mRNA 和蛋白表達均顯著升高，與si-NC 組相比，si-TRIM27 組5-8F 細胞中TRIM27 的mRNA 和蛋白表達明顯下調，在24、48、72 h 時，細胞的活性明顯下調，凋亡率明顯上調［（20.88±1.32）%比（8.03±0.41）%，t=16.10，P=0.001］；不同組間、不同時間點間、組間×時間交互作用下的細胞活力（OD490 nm）均差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 蛋白質印跡法檢測TRIM27蛋白的表達

表2 TRIM27 mRNA和蛋白的表達比較/±s

表2 TRIM27 mRNA和蛋白的表達比較/±s

注：①與pcDNA3.1組比較，P＜0.05。②與si-NC組比較，P＜0.05。

組別pcDNA3.1 pcDNA3.1-TRIM27 si-NC si-TRIM27 F值P值PCNA蛋白0.72±0.03 1.31±0.06①0.75±0.03 0.11±0.01②524.42 0.001重復次數3333 PCNA mRNA 0.68±0.03 1.26±0.07①0.70±0.04 0.10±0.01②358.99 0.001

表3 抑制TRIM27對細胞5-8F增殖、凋亡的影響/±s

表3 抑制TRIM27對細胞5-8F增殖、凋亡的影響/±s

注：①與si-NC組比較，P＜0.05。

組別si-NC si-TRIM27組間比較，F，P值時間比較，F，P值交互比較，F，P值重復次數細胞活性（OD490 nm）24 h 0.55±0.03 0.34±0.02①1028.16，0.000 2394.83，0.000 624.29，0.000 33 48 h 0.86±0.03 0.45±0.03①72 h 1.44±0.10 0.62±0.03①

2.5 過表達TRIM27 部分逆轉了miR-455-3p 對5-8F 增殖和凋亡的影響 結果如表4 所示，不同組間、不同時間點間、組間×時間交互作用下的細胞活力（OD490 nm）均差異有統計學意義（P＜0.05）；與miR-NC 組相比，miR-455-3p 組5-8F 細胞在24、48、72 h 的細胞活性明顯降低，細胞凋亡率明顯升高［（19.06±1.26）%比（7.33±0.51）%］；與miR-455-3p +pcDNA3.1 組相比，miR-455-3p + pcDNA3.1-TRIM27組5-8F 細胞24、48、72 h 的活性顯著上調，凋亡率明顯降低［（11.13±1.01）%比（19.51±1.18）%，P＜0.05］。

表4 過表達TRIM27能夠逆轉miR-455-3p對細胞5-8F增殖的作用/±s

表4 過表達TRIM27能夠逆轉miR-455-3p對細胞5-8F增殖的作用/±s

注：①與miR-NC 組比較，P＜0.05。②與miR-455-3p+pcDNA3.1組比較，P＜0.05。

組別miR-NC miR-455-3p miR-455-3p+pcDNA3.1 miR-455-3p+pcDNA3.1-TRIM27組間比較，F，P值時間比較，F，P值交互比較，F，P值重復次數3333細胞活性（OD490 nm）24 h 0.76±0.03 0.41±0.02①48 h 1.16±0.05 0.63±0.03①72 h 1.86±0.11 1.25±0.05①0.43±0.02 0.66±0.04 1.28±0.06 0.62±0.03②0.91±0.06②1.55±0.12②2502.82，0.000 3437.33，0.000 15.84，0.000

3 討論

miRNA 在癌癥中的研究已成為研究的熱點，其通過對靶基因轉錄和翻譯的阻遏而發揮癌基因或抑癌基因的作用［12-14］。miRNA 對腫瘤的調控網絡十分復雜，其除了調控靶基因外，還可通過各種信號通路調控腫瘤的進展［15-16］。miR-455-3p 可通過靶向HOXB5 抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲［17］，還可通過Wnt/β-連環蛋白和TGF-β 信號通路減弱食管鱗癌的化療敏感性［18］，又可抑制胰腺癌細胞的增殖和耐藥能力［19］?；ㄓ篮绲龋?0］在鼻咽癌的研究中通過miRNA 基因芯片技術檢測發現，miR-455-3p 的表達水平顯著降低，令人遺憾的是，并未進行深入的對鼻咽癌細胞表型變化的研究。本研究通過qRT-PCR法檢測了人鼻咽癌細胞5-8F、CNE-1和鼻咽上皮細胞NP69中miR-455-3p的表達發現，miR-455-3p 在鼻咽癌細胞中的表達水平明顯降低，這是首次在鼻咽癌細胞中確定miR-455-3p 的低表達，與其在鼻咽癌組織中的低表達相呼應；進一步研究，發現過表達miR-455-3p 可抑制鼻咽癌細胞的增殖、促進凋亡，這是國內外首次發現miR-455-3p對鼻咽癌體外研究的細胞表型變化結果，為miR-455-3p 在鼻咽癌中的進一步研究提供依據，也為miR-455-3p 在鼻咽癌中的體外研究奠定理論基礎；深入研究，證實了miR-455-3p 可靶向負調控TRIM27 的表達，我們推測miR-455-3p 對鼻咽癌細胞的功能可能與TRIM27具有一定的相關性。

TRIM27 在各種腫瘤細胞中高表達，TRIM27 的過表達有助于各種腫瘤的發展進展及耐藥性［21-22］。Ma的研究報道TRIM27在卵巢漿液性癌細胞中高表達，并且TRIM27 表達的下調在體外和體內均抑制卵巢癌細胞的增殖［23］。最近，Jiang 等［24］在卵巢癌的研究中發現，TRIM27 在卵巢癌細胞和異種移植卵巢癌裸鼠中高表達，抑制TRIM27 可抑制癌細胞和裸鼠成瘤的進一步惡化，產生這種作用與TRIM27正向的miR-383-5p 的靶向調控相關。孟易禹等［25］在鼻咽癌的研究中報道，TRIM27 的表達水平明顯的升高，下調TRIM27 可抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲，提示TRIM27 在鼻咽癌中具有潛在的應用價值。本研究檢測了人鼻咽癌細胞5-8F、CNE-1和鼻咽上皮細胞NP69 中TRIM27 的表達發現，TRIM27 在鼻咽癌中的表達明顯升高，且敲減TRIM27 可抑制鼻咽癌細胞的增殖，這均與孟易禹的研究結果相一致，也再次驗證了TRIM27 在鼻咽癌中的體外調控功能；除此之外，還發現敲減TRIM27 可促進鼻咽癌細胞的凋亡，這是首次發現TRIM27 對鼻咽癌細胞的凋亡調控作用，為探索TRIM27 在鼻咽癌細胞中的功能提供充分的理論依據；深入研究發現，過表達TRIM27 可逆轉miR-455-3p對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的調控，說明不僅miR-455-3p可靶向調控TRIM27，相反，TRIM27也可逆向調控miR-455-3p 的表達和功能。這些結果為鼻咽癌的基因治療和靶向治療提供了更充分的實驗理論依據。

總之，miR-455-3p 抑制鼻咽癌細胞增殖并促進凋亡，其機制與靶向TRIM27 有關，為鼻咽癌的治療提供新靶點。