Claudin-7在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)和作用研究

王金鑫，伊 婕，丁宇潔，鐘 旖，孫志達(dá)

口腔癌在全球流行的癌癥中排名第六，其中超過(guò)90%是口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)[1]。OSCC最常發(fā)生的部位是舌和口底，占所有病例的50%以上，其次是牙齦、腭黏膜以及唇頰黏膜[2]。目前手術(shù)、放療和化療是OSCC重要的治療手段。盡管診斷技術(shù)和治療方式進(jìn)步，但OSCC患者的五年生存率并沒(méi)有改善。近年來(lái)靶向治療成為醫(yī)療領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，對(duì)腫瘤相關(guān)基因和信號(hào)通路的研究有助于靶向藥物的研發(fā)，提高OSCC患者生存率。

Claudin家族由27種基本的緊密連接的整合膜蛋白組成，分子量為20～34 ku,其在上皮細(xì)胞間緊密連接功能中起到重要作用[3-4]。緊密連接負(fù)責(zé)上皮細(xì)胞旁通透性屏障的形成和維持細(xì)胞極性[5]。Claudin-7是緊密連接蛋白家族的一部分。近年來(lái)研究表明Claudin-7在各種癌癥中異常表達(dá)，并且與癌癥的病因和進(jìn)展有關(guān)[6-13]。由于緊密連接被破壞，Claudin-7表達(dá)的喪失將促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[14]。研究顯示Claudin-7的低表達(dá)與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，如結(jié)直腸癌、食管鱗癌和乳腺癌等[6-10]。據(jù)報(bào)道Claudin-7的表達(dá)下調(diào)可能與OSCC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，并且Claudin-7的缺失是OSCC侵襲和轉(zhuǎn)移的負(fù)面預(yù)后因素[15-16]。然而，Claudin-7在OSCC中的具體作用機(jī)制仍有待闡明。本研究通過(guò)檢測(cè)OSCC組織中Claudin-7的表達(dá)情況，并且通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究Claudin-7表達(dá)對(duì)OSCC細(xì)胞系增殖、遷移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的作用，以期為 OSCC的診療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 患者的組織標(biāo)本信息 收集2019年6月—2020年6月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科就診行頜面部腫物擴(kuò)大切除術(shù)的50例OSCC患者的癌組織樣本和其中12例癌旁組織(距離腫瘤2 cm)正常標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①患者術(shù)前未行放化療；②患者行頭頸部腫物擴(kuò)大切除術(shù)+頸淋巴結(jié)清掃術(shù)；③患者有完整的臨床病理資料。本研究的開(kāi)展已取得患者或家屬知情同意，并且經(jīng)過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(南醫(yī)口院倫審-PJ2020-121-001)。

1.1.2 細(xì)胞系來(lái)源 本研究中所使用的口腔鱗癌細(xì)胞系是Cal27和HN6細(xì)胞系，均購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(中國(guó)上海)。

1.1.3 其他主要實(shí)驗(yàn)材料 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液(美國(guó)Gibco公司)；即用型青霉素-鏈霉素溶液(中國(guó)新賽美公司)；Claudin-7過(guò)表達(dá)慢病毒試劑盒(上海吉?jiǎng)P公司)；RT-qPCR試劑盒(日本Takara公司)；CCK-8試劑盒(日本DOJINDO公司)；Transwell小室(美國(guó)Corning公司)；RT-qPCR引物(上海生工生物工程有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒、即用型正常山羊血清BSA、快捷型酶標(biāo)羊抗兔抗兔IgG聚合物(福州邁新公司)；一抗Claudin-7抗體(美國(guó)Invitrogen公司)；E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白Vimentin抗體(美國(guó)CST公司)；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(中國(guó)Proteintech公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化 組織切片用二甲苯和乙醇進(jìn)行脫蠟和水化，抗原修復(fù)后用3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。接著即用型山羊血清BSA室溫封閉30 min，抑制非特異性染色，然后加入足量一抗 4 ℃下孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育30 min。最后加入適量DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡采集圖像。

1.2.2 免疫組化分析 切片染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲評(píng)價(jià)。按照免疫反應(yīng)評(píng)分(immunoreactive score，IRS)對(duì)Claudin-7染色結(jié)果分組。IRS分為染色強(qiáng)度(staining intensity，SI)和陽(yáng)性細(xì)胞百分率(percentage of positive cell，PP)兩部分，IRS=SI×PP。SI 0分代表無(wú)染色，1分代表弱染色，2分代表中等程度的染色，3分代表強(qiáng)染色。PP 0分代表0%，1分代表≤10%，2分代表11%～50%，3分代表51%～80%，4分代表>80%。以IRS 0～6分為Claudin-7低表達(dá)，6分以上為高表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染檢測(cè) Cal27和HN6細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在標(biāo)準(zhǔn)37 ℃、5%CO2和濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用過(guò)表達(dá)Claudin-7的特定shRNA慢病毒和亂序shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染Cal27和HN6細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)慢病毒的為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染亂序慢病毒的為陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后用2 μg/mL 嘌呤霉素選擇穩(wěn)定細(xì)胞。RT-qPCR用于評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 RT-qPCR分析 來(lái)自細(xì)胞的總RNA用Trizol試劑分離。測(cè)定RNA純度和濃度后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA。進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，以 GAPDH為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。Claudin-7的mRNA名稱為CLDN7,PCR引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 來(lái)自細(xì)胞和組織的總蛋白用混合蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取。將變性后的蛋白樣品在聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離后，轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。5%脫脂奶粉封膜1 h后，加入一抗4 ℃下孵育過(guò)夜，然后加入二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光劑顯影。用凝膠成像分析系統(tǒng)曝光和采集圖像，用Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 細(xì)胞活力測(cè)定 通過(guò)CCK-8試劑盒評(píng)估細(xì)胞增殖活力。按照20個(gè)細(xì)胞/μL將細(xì)胞接種至96孔板內(nèi)，每 24 h加入1次 CCK-8 試劑(10 μL/孔)并用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量在450 nm處的光密度(optical density，OD)值。

1.2.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞并用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸。在Transwell小室的上室中加入400個(gè)/μL的細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL完全培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后用多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,再用結(jié)晶紫染色20 min。清洗小室，用棉簽輕輕拭去上室殘留的細(xì)胞，吹干后，用正置熒光顯微鏡采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖。采用卡方檢驗(yàn)和Fisher確切概率法對(duì)計(jì)數(shù)資料組間進(jìn)行比較，采用列聯(lián)系數(shù)分析Claudin-7表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Claudin-7在 OSCC 組織中的表達(dá)水平

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：在50例 OSCC組織樣本中，有34例樣本為Claudin-7低表達(dá)，余16例樣本為高表達(dá)。而在12例癌旁組織樣本中Claudin-7均為陽(yáng)性表達(dá)，2例為低表達(dá)，余10例為高表達(dá)。因此Claudin-7在OSCC中較癌旁組織呈低表達(dá)(圖1，P<0.05)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：OSCC組織中Claudin-7蛋白表達(dá)量顯著低于癌旁組織，進(jìn)一步說(shuō)明Claudin-7在OSCC中較癌旁組織低表達(dá)(圖2)。

A:癌旁正常組織中Claudin-7高表達(dá); B: OSCC組織中Claudin-7高表達(dá); C: OSCC組織中Claudin-7低表達(dá)

N:癌旁組織; T: OSCC組織

2.2 Claudin-7在OSCC組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

通過(guò)分析50例OSCC患者組織中Claudin-7的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果(表2)顯示：Claudin-7表達(dá)水平與患者腫瘤大小、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)；Claudin-7表達(dá)水平與其他臨床病理特征無(wú)關(guān)(P>0.05)。

表2 Claudin-7表達(dá)與OSCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 Claudin-7表達(dá)對(duì)OSCC細(xì)胞增殖和遷移的影響

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示：與對(duì)照組比較，Cal27和HN6細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒后Claudin-7的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著升高(圖3，P<0.05)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較，Claudin-7過(guò)表達(dá)顯著抑制了Cal27和HN6細(xì)胞的增殖活力(圖4A、B，P<0.05);遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較，Claudin-7過(guò)表達(dá)后Cal27和HN6細(xì)胞的遷移能力顯著減弱(圖4C、D，P<0.05)。

A、B: 轉(zhuǎn)染后Cal27細(xì)胞Claudin-7的蛋白和mRNA表達(dá)水平;C、D: 轉(zhuǎn)染后HN6細(xì)胞Claudin-7的蛋白和mRNA表達(dá)水平；LV-NC代表陰性對(duì)照組,LV-CLDN7代表實(shí)驗(yàn)組, *：P<0.05,**：P<0.01

A、C: 轉(zhuǎn)染后Cal27細(xì)胞增殖活力遷移能力比較;B、D: 轉(zhuǎn)染后HN6細(xì)胞增殖活力和遷移能力比較；LV-NC代表陰性對(duì)照組，LV-CLDN7代表實(shí)驗(yàn)組；*：P<0.05，***：P<0.001

2.4 Claudin-7表達(dá)對(duì)OSCC細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，Claudin-7過(guò)表達(dá)后，Cal27和HN6細(xì)胞中EMT轉(zhuǎn)化的上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，間充質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白的蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖5，P<0.05)。

A、B: 轉(zhuǎn)染后Cal27細(xì)胞上皮間充質(zhì)相關(guān)指標(biāo)蛋白和mRNA的表達(dá)量;B、D: 轉(zhuǎn)染后HN6細(xì)胞上皮間充質(zhì)相關(guān)指標(biāo)蛋白和mRNA的表達(dá)量;LV-NC代表陰性對(duì)照組,LV-CLDN7代表實(shí)驗(yàn)組；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001

3 討 論

Claudins相關(guān)的細(xì)胞間黏附調(diào)控通透性屏障、細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移的重要因素[17]。研究表明緊密連接的變化是腫瘤發(fā)生的早期事件[14]。Claudin-7表達(dá)減少將導(dǎo)致細(xì)胞間黏附性破壞，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。相反，有證據(jù)表明在胃癌、胰腺癌和卵巢癌等一些腫瘤類型中Claudin-7表達(dá)增加[11-13,18]。Clauidn-7過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和侵襲性的機(jī)制尚不清楚，可能是Claudin-7的上調(diào)可調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。我們的研究表明Claudin-7在OSCC中低表達(dá)。值得注意的是，在OSCC組織中我們觀察到Claudin-7陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)棕色染色，而在癌旁組織中細(xì)胞質(zhì)未顯示Claudin-7染色。據(jù)報(bào)道在卵巢癌和唾液腺樣囊性癌中可以發(fā)現(xiàn)Claudin-7的點(diǎn)狀細(xì)胞質(zhì)染色[18-19]。正常機(jī)體中，Claudin-7表達(dá)在細(xì)胞膜，然而腫瘤中Claudin-7異位表達(dá)的機(jī)制仍不清楚。并且進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Claudin-7低表達(dá)與OSCC患者的腫瘤大小、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，Claudin-7 可能是有前景的OSCC預(yù)后生物標(biāo)志物。

OSCC特點(diǎn)是對(duì)局部組織的侵襲程度高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高。增殖和轉(zhuǎn)移都是 OSCC 惡性生物學(xué)行為的標(biāo)志[20]。EMT是指上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間相互作用但獲得間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和黏附標(biāo)記的過(guò)程，從而能夠從原始組織中分離，被認(rèn)為與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在腫瘤的侵襲和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[21]。EMT 伴隨著上皮標(biāo)記分子 E-鈣黏蛋白的下調(diào)、間充質(zhì)標(biāo)記分子 N-鈣黏蛋白和波形蛋白的上調(diào)，以及snail-1等轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)[21]。Ji等[19]研究發(fā)現(xiàn)Claudin-7沉默后能夠顯著增強(qiáng)唾液腺樣囊性癌的EMT。Wang等[22]研究顯示Claudin-7下調(diào)可能通過(guò)調(diào)節(jié)EMT來(lái)增強(qiáng)結(jié)直腸癌的遷移和侵襲能力。有研究表明OSCC中E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著降低[15]。然而，OSCC中Claudin-7和EMT 之間的關(guān)系卻鮮有研究。我們?cè)隗w外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Claudin-7過(guò)表達(dá)顯著抑制了OSCC細(xì)胞的增殖、遷移和EMT。因此，Claudin-7在OSCC中發(fā)揮抑癌的作用。

本研究表明Claudin-7在OSCC中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)體外上調(diào)Claudin-7表達(dá)可以抑制OSCC細(xì)胞的增殖、遷移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究為進(jìn)一步探討Claudin-7在OSCC 抑癌作用中的相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，并為OSCC治療策略的制定提供了新的思路。