牡丹種間遠(yuǎn)緣雜交不親和的細(xì)胞學(xué)與生理機(jī)制研究

張翔宇，賈文慶，何松林，邱永杰，王喬健，胡 緩，史來琨，劉會超

（河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

遠(yuǎn)緣雜交是新優(yōu)種質(zhì)培育的主要途徑，野生種質(zhì)與栽培種進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交在改良栽培品種以及培育新異種質(zhì)中起著重要作用[1-3]，如我國小麥育種專家李振聲團(tuán)隊利用小麥（Triticum aestivum L.）與長穗偃麥草（Elytrigia elongata （Host） Nevski）雜交培育出抗病性強(qiáng)的‘小偃6號’等系列遠(yuǎn)緣雜交小麥品種，成功解決抗“小麥癌癥”條銹病的世界育種難題[4]，Moshe Feldman和Emest R.Sears也曾提出“未來的谷物改良寄希望于野生基因資源的利用”[5]。牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）為世界著名花卉，也是中國的一張名片，在中國影響之深遠(yuǎn)是其他花卉所不可企及的；但牡丹現(xiàn)有栽培品種中純正花色少，黃色、橙色花缺乏，株型較低，大多對白粉病易感。長期以來，由于牡丹遠(yuǎn)緣雜交不親和或親和性差，牡丹育種多集中在品種群內(nèi)進(jìn)行常規(guī)雜交，遺傳基礎(chǔ)狹窄和多樣性親本資源的缺乏成為了限制牡丹育種取得突破的瓶頸。

栽培品種中，由楊山牡丹（P.ostii T.Hong et J.X.Zhang sp.nov.）演化出的‘鳳丹’（P.ostii‘Feng Dan’）植株高大、生長勢強(qiáng)、花量大，生態(tài)適應(yīng)性極廣泛，是雜交育種最常用的親本[6-7]；牡丹野生種保康牡丹（Paeonia baokangensis Z.L.Dai et T.Hong sp.Nov.）[8]，花桃紅，色澤純正、明亮，花期長，抗白粉病，是亟待開發(fā)的優(yōu)良野生資源之一。解析牡丹‘鳳丹’與保康牡丹遠(yuǎn)緣雜交的不親和性機(jī)制，對于克服受精障礙，完善牡丹遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)體系，培育花色純正、抗白粉病的牡丹新品種具有重要意義。

植物遠(yuǎn)緣雜交研究發(fā)現(xiàn)，花粉萌發(fā)及花粉管生長情況、內(nèi)源激素水平、保護(hù)酶活性及可溶性蛋白含量等是遠(yuǎn)緣雜交親和性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。郭朋輝等[9]在紫斑百合（Lilium nepalense D.Don）遠(yuǎn)緣雜交親和性研究中發(fā)現(xiàn)，紫斑百合遠(yuǎn)緣雜交過程中多出現(xiàn)受精前障礙，胼胝質(zhì)沉積，花粉管扭曲纏繞，阻礙伸長生長是其受精前障礙的主要表現(xiàn)；王保成等[10]在蕓芥（Eruca sativa Mill）親和性研究中發(fā)現(xiàn)，SOD、POD及CAT三種保護(hù)酶的活性變化與自交親和基因的調(diào)控相關(guān)；楊曉玲等[11]在百合（Lilium brownie F.）親和性研究中發(fā)現(xiàn)，高水平的IAA、GA3、ZR對花粉在柱頭的識別黏附及萌發(fā)有促進(jìn)作用；Kovaleva L等[12]表明，ABA含量較高是導(dǎo)致矮牽牛（Petunia hybrida L.）授粉不親和的原因；牡丹與芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）雜交后也顯示相關(guān)保護(hù)酶活性及內(nèi)源激素含量與授粉親和性相關(guān)[13]。目前，有關(guān)牡丹種間雜交不親和機(jī)制尚未見報道，基于此，本研究以牡丹‘鳳丹’為母本，以野生保康牡丹為父本進(jìn)行了種間雜交，探討花粉萌發(fā)、花粉管生長、雌蕊保護(hù)酶活性、可溶性物質(zhì)及內(nèi)源激素含量變化與遠(yuǎn)緣雜交不親和性的關(guān)系，以期為解析牡丹種間遠(yuǎn)緣雜交不親和性機(jī)制以及完善牡丹遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)體系提供理論及試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

母本‘鳳丹’種植于河南科技學(xué)院牡丹資源圃，父本保康牡丹采自洛陽國家牡丹園野生資源圃，二者植株健壯，均可正常開花結(jié)實。于露色期對母本材料進(jìn)行去雄，掛上標(biāo)簽并做隔離處理，4 d后用準(zhǔn)備好的花粉進(jìn)行人工授粉。

1.2 花粉萌發(fā)及花粉管生長熒光觀察

分別于授粉后1、3、6、8、12、24、36、48、72、96 h，取雌蕊10～15個（分別取自不同花朵）迅速放入卡諾固定液中，固定24 h以上轉(zhuǎn)入70%酒精于4 ℃ 冰箱存放，之后用8 mol·L?1NaOH 60 ℃條件下軟化4 h，漂洗后于0.5%苯胺藍(lán)染液避光染色6 h以上，壓片并于熒光顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照（圖1A～I(xiàn)及L×40倍；J及K×100倍）。

圖1 花粉萌發(fā)及花粉管生長熒光觀察Fig.1 Fluorescence observation of pollens germination and pollen tubes growth

1.3 生理指標(biāo)測定

取未授粉及授粉后1、3、6、8、12、24、36、48、72、96 h的雌蕊，每處理0.2 g，重復(fù)3次，液氮速凍后于?80 ℃冰箱中保存。分別采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量，考馬斯亮藍(lán)G-250法測定可溶性蛋白含量，苯酚法測定可溶性糖含量。

1.4 內(nèi)源激素測定

取樣同1.3節(jié)，每處理0.3 g。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），參照試劑盒附帶說明，分別測定吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、異戊烯基腺苷（IPA）、脫落酸（ABA）及茉莉酸（JA）含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉萌發(fā)及花粉管生長熒光顯微觀察

遠(yuǎn)緣雜交與自交授粉后不同時期雌蕊熒光顯微觀察如圖1，授粉后1 h，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊花粉粒黏附極少，未見萌發(fā)（圖1A）；自交授粉花粉粒黏附較多，花粉萌發(fā)花粉管生長正常（圖1B）。授粉6 h，遠(yuǎn)緣雜交花粉粒黏附增多，花粉粒萌發(fā)，花粉管有扭曲、分枝現(xiàn)象，伴有大量胼胝質(zhì)沉積（圖1C、D）；自交雌蕊花粉管生長迅速，有序向花柱生長（圖1E）。授粉后12 h，遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉管多扭曲，部分伸長到柱頭1/2到2/3部分（圖1F）；自交授粉花粉管生長正常，伸長到花柱部分（圖1G）。授粉36 h，遠(yuǎn)緣雜交授粉個別花粉管伸長到子房（圖1H）；自交授粉花粉管成束有序穿過花柱，伸長到子房（圖1I）。授粉72 h，遠(yuǎn)緣雜交授粉少量花粉管伸長到胚珠，伴有胼胝質(zhì)沉積（圖1J），柱頭上花粉粒大多開始干癟（圖1L）；自交授粉花粉管正常生長到胚珠（圖1K）。后期觀察發(fā)現(xiàn)，自交授粉能正常結(jié)實，結(jié)實率高，種莢飽滿（圖1M、N）；遠(yuǎn)緣雜交授粉結(jié)實率低，種莢大多干癟（圖1O、P）。整體表明，遠(yuǎn)緣雜交受精前障礙明顯，花粉粒萌發(fā)晚，花粉管內(nèi)胼胝質(zhì)沉積是其不親和原因。

2.2 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊SOD活性變化

授粉后不同時間，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊SOD活性變化（圖2）表明：授粉后1 h，自交雌蕊SOD活性急速上升，遠(yuǎn)緣雜交雌蕊活性稍有上升，此時自交雌蕊花粉萌發(fā)，花粉管生長迅速，遠(yuǎn)緣雜交雌蕊未見花粉萌發(fā)；1～3 h自交雌蕊SOD活性繼續(xù)急速顯著上升（P＜0.05），在3 h達(dá)到頂峰84.57 U·g?1，3 h之后活性稍有下降，此后保持在較高水平，并在72 h達(dá)到另一高峰75.05 U·g?1，此時花粉管伸入胚珠部分。遠(yuǎn)緣雜交雌蕊SOD活性1～3 h同樣急速上升，在3 h達(dá)到一個峰點(diǎn)74.78 U·g?1，此時遠(yuǎn)緣雜交雌蕊個別花粉萌發(fā)；3 h后稍有下降，在24 h達(dá)到另一峰值81.97 U·g?1，之后保持在較高水平。表明高活性SOD對花粉萌發(fā)及花粉管生長有促進(jìn)作用，尤其在授粉前期，高活性SOD有助于花粉-柱頭的識別作用，對自交授粉花粉粒在柱頭的黏附萌發(fā)促進(jìn)作用顯著。

圖2 授粉后雌蕊 SOD 活性及MDA 含量變化Fig.2 Changes of SOD activity and MDA content in pistils after pollination

2.3 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊MDA含量變化

授粉后，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊不同時間MDA含量變化（圖2）表明：授粉后1 h，自交雌蕊MDA含量顯著上升（P＜0.05），1 h達(dá)最大67.03 μmol·g?1，此時自交雌蕊花粉萌發(fā)，花粉管生長迅速；1 h之后MDA含量下降，并在8 h之后保持在較低水平，隨后波動不大，顯微特征表現(xiàn)為花粉管有序向花柱及子房生長，推測此時雌蕊內(nèi)部達(dá)到平衡狀態(tài)，雌蕊自身適應(yīng)花粉落在柱頭所帶來的刺激作用。遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊MDA含量在授粉后1～3 h急速下降，此時花粉未見萌發(fā)；6 h之后MDA含量開始急速顯著上升（P＜0.05），12 h含量達(dá)到最大 72.87 μmol·g?1，此階段花粉管出現(xiàn)扭曲，并伴有胼胝質(zhì)沉積，花粉管生長受阻，可能原因在于柱頭對外來花粉識別后排斥作用明顯，誘導(dǎo)MDA急速增加，進(jìn)而打破雌蕊內(nèi)部動態(tài)平衡，細(xì)胞功能受損；在授粉后24 h之后MDA快速下降，并在48 h之后保持穩(wěn)定，推測此時雌蕊應(yīng)激響應(yīng)達(dá)到平衡，整體處于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.4 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊可溶性蛋白、可溶性糖含量變化

授粉后不同時間，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊可溶性蛋白、可溶性糖含量變化（圖3）表明：自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉0～36 h，可溶性蛋白及可溶性糖含量均表現(xiàn)為波動上升趨勢，自交與遠(yuǎn)緣雜交的可溶性蛋白含量分別在24、36 h達(dá)最大，分別為52.90、50.48 mg·g?1，可溶性糖含量分別在 12、8 h 達(dá)到最大，分別為 30.17、31.64 mg·g?1；授粉36 h后，二者含量相對穩(wěn)定。由此說明，可溶性蛋白及可溶性糖在柱頭識別及應(yīng)對外來刺激作用中起著重要作用，其中，可溶性糖較可溶性蛋白含量變化小，表明在柱頭識別及應(yīng)對外來刺激作用中，可溶性蛋白起著主導(dǎo)作用。出現(xiàn)此現(xiàn)象可能的原因是，在柱頭識別階段，可溶性蛋白作為識別蛋白的重要組成，積極參與柱頭的識別作用。此外，授粉作為外來刺激，雌蕊內(nèi)部平衡破壞，加速雌蕊代謝，進(jìn)一步提高了可溶性蛋白及可溶性糖含量，而表現(xiàn)出升高的趨勢，隨著刺激減弱，二者含量也相對保持平穩(wěn)。

圖3 授粉后雌蕊可溶性蛋白含量及可溶性糖含量變化Fig.3 Changes of soluble protein content and soluble sugar content in pistils after pollination

2.5 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊IAA、GA3含量變化

圖4表明：自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊IAA、GA3含量變化整體表現(xiàn)為上升-下降-上升趨勢。整體上自交授粉雌蕊較遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊IAA含量高，尤其在授粉前期表現(xiàn)較顯著。自交授粉雌蕊IAA、GA3含量上升趨勢較遠(yuǎn)緣雜交早，授粉后3～6 h自交授粉雌蕊IAA含量便急速顯著上升（P＜0.05），并在 6 h 達(dá)最大 45.28 ng·g?1；自交授粉GA3含量在授粉后1～3 h快速上升，高于遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊，此階段自交授粉花粉萌發(fā)多，花粉管生長迅速。隨著遠(yuǎn)緣雜交授粉GA3含量的升高，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊花粉開始萌發(fā)，花粉管伸長生長。表明高水平IAA、GA3對花粉在柱頭的識別及花粉萌發(fā)、花粉管的生長起促進(jìn)作用，IAA、GA3作為中間物質(zhì)，起著傳遞生長信號的作用。

圖4 授粉后雌蕊 IAA 及GA3 含量變化Fig.4 Changes of IAA and GA3 content in pistils after pollination

2.6 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊IPA含量變化

圖5表明：自交與遠(yuǎn)緣雜交雌蕊授粉后IPA含量均表現(xiàn)出先升高后下降趨勢。授粉后1～36 h，自交授粉雌蕊IPA含量處于較高水平且保持相對穩(wěn)定，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊IPA含量呈波動上升，同樣保持在較高水平，其中，授粉后3～8 h，自交授粉雌蕊IPA含量高，顯微特征表現(xiàn)為花粉管迅速伸長生長，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊IPA含量較低，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)花粉管有胼胝質(zhì)沉積及扭曲纏繞現(xiàn)象，推測高水平IPA對花粉管的伸長生長有促進(jìn)作用；36 h之后均急速下降，之后保持相對穩(wěn)定，花粉管生長也趨于穩(wěn)定狀態(tài)，自交授粉含量依然高于遠(yuǎn)緣雜交授粉。

圖5 授粉后雌蕊 IPA 含量及（IAA+GA3）/ABA 變化Fig.5 Changes of IPA content and （IAA+GA3）/ABA in pistils after pollination

2.7 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊（IAA+GA3）/ABA變化

圖5表明：自交授粉雌蕊（IAA+GA3）/ABA顯著高于遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊。授粉0～36 h，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊（IAA+GA3）/ABA僅在授粉后6 h有上升趨勢，此時遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊處于花粉萌發(fā)、花粉管快速生長階段，此時ABA含量依然較高，花粉管扭曲嚴(yán)重；自交授粉雌蕊（IAA +GA3）/ABA僅在授粉后36～48 h較低，此時花粉管已伸入子房。

2.8 自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉后雌蕊ABA、JA含量變化

圖6表明：授粉0～24 h，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊ABA含量變化趨勢相反，自交授粉雌蕊ABA含量稍下降，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊則急速顯著上升（P＜0.05），并保持在較高水平，此階段自交授粉花粉萌發(fā)，花粉管生長迅速，遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉管扭曲嚴(yán)重，胼胝質(zhì)沉積較多；授粉0～3 h，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊JA含量均上升，遠(yuǎn)緣雜交授粉上升趨勢更顯著，此時自交授粉花粉少量萌發(fā)，遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉未見萌發(fā)；授粉3～12 h，JA含量均呈下降趨勢，此時花粉管處于快速生長階段；12 h之后，自交授粉雌蕊JA含量保持相對穩(wěn)定，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊JA含量再次上升，授粉72 h之后保持穩(wěn)定，此時花粉管已伸長到胚珠部分；24～36 h期間，自交與遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊ABA含量均有大幅度上升，48 h之后呈現(xiàn)輕微下降趨勢，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)花粉管伸長生長到子房部分。整個授粉受精期間，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊ABA含量遠(yuǎn)高于自交雌蕊，JA含量整體上也較自交授粉雌蕊高。推測在花粉-柱頭識別階段，JA含量的升高影響了花粉黏附及花粉的水合作用，進(jìn)而阻礙了遠(yuǎn)緣雜交雌蕊花粉的萌發(fā)；同時，伴隨著ABA含量的快速增加，高含量ABA致使遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉管胼胝質(zhì)沉積較多，阻礙花粉管進(jìn)一步伸長生長，表現(xiàn)出扭曲纏繞生長停滯。

圖6 授粉后雌蕊 ABA 及JA 含量變化Fig.6 Changes of ABA and JA content in pistils after pollination

3 討論

受精前障礙是多數(shù)植物遠(yuǎn)緣雜交天然生殖障礙的主要原因[14-15]，相關(guān)研究表明，胼胝質(zhì)大量積累是遠(yuǎn)緣雜交不親和受精前障礙的主要細(xì)胞學(xué)原因之一，絨氈層的花粉外壁蛋白與柱頭乳突細(xì)胞質(zhì)膜蛋白相互識別，親和性授粉，柱頭會分泌囊泡，提供花粉萌發(fā)所需的水合物質(zhì)；不親和授粉，胼胝質(zhì)產(chǎn)生積累在乳突細(xì)胞，擾亂花粉水合作用，進(jìn)而抑制花粉萌發(fā)[16]。李辛雷等[17]在菊屬（Chrysanthemum L.）植物遠(yuǎn)緣雜交研究中發(fā)現(xiàn)，不親和雜交組合柱頭上花粉粒黏附少，花粉萌發(fā)率低，花粉管生長異常，難以進(jìn)入花柱；高山杜鵑（Rhododendron lapponicum （L.） Wahl.）遠(yuǎn)緣雜交后，花粉管、花柱、胚珠等產(chǎn)生大量胼胝質(zhì)，導(dǎo)致受精障礙而無法結(jié)實是其不親和的主要原因[18]；牡丹芍藥遠(yuǎn)緣雜交也因花粉管扭曲、纏繞、分枝、胼胝質(zhì)沉積等表現(xiàn)為受精前障礙[19-21]。本試驗研究結(jié)果表明，‘鳳丹’與保康牡丹遠(yuǎn)緣雜交受精前障礙明顯，胼胝質(zhì)沉積在其中起著主導(dǎo)作用，原因可能是遠(yuǎn)緣雜交授粉引起的脅迫反應(yīng)，干擾了花粉管細(xì)胞發(fā)育過程中細(xì)胞壁內(nèi)層胼胝質(zhì)的正常合成，引起胼胝質(zhì)異常累積，從而造成花粉管生長紊亂，出現(xiàn)扭曲纏繞現(xiàn)象。

授粉作為一種外來刺激，會在柱頭及子房內(nèi)引起酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化。SOD作為植物防御系統(tǒng)里重要的抗氧化酶，通過清除過量的活性氧來保護(hù)植物免受外界刺激產(chǎn)生的傷害，高水平SOD有利于花粉-柱頭的識別、黏附及花粉在柱頭的萌發(fā)[13]。吳能表等[22]在對甘藍(lán)（Brassica oleracea var.capitata L.）雜交授粉研究中發(fā)現(xiàn)，授粉后雌蕊SOD活性會顯著上升，親和性授粉較不親和性授粉上升更顯著；在蕓芥（Eruca sativa Mill.）自花授粉研究中，自交親和授粉雌蕊SOD活性變化較自交不親和變化更顯著[10]。本研究結(jié)果表明，授粉親和雌蕊SOD活性升高明顯，特別在授粉前期花粉管迅速生長階段，SOD活性急速顯著升高（P＜0.05），推測此時雌蕊內(nèi)部清除活性氧系統(tǒng)迅速加強(qiáng)，外界刺激誘發(fā)的活性氧被迅速清除，為花粉管正常生長提供了便利環(huán)境。MDA作為膜脂過氧化最終產(chǎn)物，其含量高低可直接反映細(xì)胞受傷害程度[23]。張雪梅等[24]在蘋果（Malus pumila Mill.）自花授粉研究中發(fā)現(xiàn)，授粉前期自交親和雌蕊MDA含量較自交不親和高，48 h之后隨著自交親和雌蕊MDA含量下降，花粉管持續(xù)生長，自交不親和雌蕊MDA含量升高，花粉管在花柱內(nèi)停止生長；Ren等[25]對芍藥花粉冷凍保存研究發(fā)現(xiàn)，冷凍過程中細(xì)胞膜脂過氧化加劇促使MDA含量的增加，細(xì)胞功能受損，細(xì)胞凋亡率升高，花粉萌發(fā)率下降。本試驗結(jié)果顯示，花粉萌發(fā)、花粉管的生長誘導(dǎo)MDA含量快速升高，同時伴隨MDA含量的急速顯著升高（P＜0.05），遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉管扭曲纏繞并伴有大量胼胝質(zhì)沉積，推測出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是雌蕊細(xì)胞膜脂過氧化，導(dǎo)致柱頭及花柱細(xì)胞功能受阻，引導(dǎo)花粉管有序生長的信號物質(zhì)減少，致使花粉管無序生長，進(jìn)而出現(xiàn)扭曲纏繞，無法順利穿過花柱進(jìn)入子房完成受精。可溶性蛋白和可溶性糖既是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)又是柱頭識別物質(zhì)的主要成分，在植物授粉過程中有著重要作用。此外，蛋白質(zhì)代謝是連接植物體內(nèi)三大代謝的樞紐，在植物抗逆生理中具有重要作用[26]。吳能表等[22]在甘藍(lán)雜交研究中發(fā)現(xiàn)，自花或異花授粉，均能引起甘藍(lán)體內(nèi)生理生化反應(yīng)，伴隨花柱內(nèi)蛋白含量的升高，促進(jìn)甘藍(lán)體內(nèi)代謝改變。本研究結(jié)果表明，授粉后自交與遠(yuǎn)緣雜交雌蕊可溶性蛋白含量均表現(xiàn)為先升高后下降趨勢，可溶性糖含量在小范圍波動，整體遠(yuǎn)緣雜交雌蕊可溶性糖含量較自交雌蕊含量高，原因可能是遠(yuǎn)緣雜交花粉對柱頭刺激作用更加明顯，柱頭對花粉識別及排異作用加強(qiáng)，加速了雌蕊代謝作用，排異物質(zhì)增加，花粉管生長受阻，顯微特征表現(xiàn)為花粉管內(nèi)胼胝質(zhì)的沉積及花粉管扭曲纏繞。

GA3、IAA、ABA、JA等是植物花粉萌發(fā)及花粉管生長中的重要調(diào)控物質(zhì)[27-29]，張鵬等[30]在加楊（Populus×canadensis Moench）自交和與銀腺楊（P.alba×P.glandulosa）雜交授粉時發(fā)現(xiàn)，親和性授粉GA3、IAA、ZR含量較不親和授粉含量高，ABA含量較不親和授粉含量低；劉懿瑤[31]研究表明，茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了油茶（Camellia oleifera Abel.））的自交授粉過程，進(jìn)而參與植物防御過程，花柱中花粉管緩慢生長時，子房接收到JA信號，啟動抑制自交授粉親和的分子機(jī)制，花粉管生長受阻；低水平的IPA、ZR、GA3含量引起花粉管尖端膨大、扭曲折疊，是同源四倍體黑皮冬瓜（Benincasa hispida （Thunb.）Cogn.）自交低稔的原因之一[32]。本研究結(jié)果表明，在前期花粉-柱頭識別階段，自交授粉雌蕊IAA含量顯著高于遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊，隨IAA含量顯著升高（P＜0.05），花粉萌發(fā)、花粉管生長迅速，表明高水平IAA對親和性授粉過程中花粉萌發(fā)有促進(jìn)作用。授粉前期，自交授粉IPA、GA3含量較高，遠(yuǎn)緣雜交授粉花粉開始萌發(fā)時IPA、GA3含量升高，推測高水平IPA、GA3有利于花粉管生長，這與賀丹等[13]在芍藥牡丹遠(yuǎn)緣雜交研究結(jié)果相似。Kim等[33]研究表明，JA與ABA相互作用來調(diào)節(jié)植物反應(yīng)和對非生物脅迫的耐受性，同時JA激活A(yù)BA合成基因，促進(jìn)了ABA的生物合成。Rajesh 等[34]研究表明，ABA調(diào)控CALLOSE SYNTHASE 1（CALS1）基因表達(dá)上調(diào)，抑制分解胼胝質(zhì)的葡聚糖酶，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)胼胝質(zhì)堵塞，限制獲得促進(jìn)生長的信號達(dá)到對楊樹芽休眠的效果。本研究結(jié)果表明，在授粉過程中，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊JA含量高于自交授粉雌蕊，遠(yuǎn)緣雜交授粉雌蕊ABA含量遠(yuǎn)高于自交授粉雌蕊，特別在授粉后6 h，ABA含量急劇顯著升高（P＜0.05），此時遠(yuǎn)緣雜交雌蕊胼胝質(zhì)沉積較多，花粉管扭曲嚴(yán)重，推測ABA含量的升高是伴隨JA含量升高延遲發(fā)生的，二者共同作用，誘導(dǎo)花粉管細(xì)胞內(nèi)胼胝質(zhì)堵塞，對花粉管伸長生長起抑制作用。此外，低水平（IAA+GA3+ZR）/ABA是自交不親和的特征表現(xiàn)[35]，高水平（IAA+GA3）/ABA有利于授粉親和[12]，本研究也證實了這一點(diǎn)，親和性授粉（IAA+GA3）/ABA遠(yuǎn)高于不親和授粉，這說明在雜交不親和中起決定作用的是生長素和赤霉素與脫落酸的比值，而不是含量的絕對值。

4 結(jié)論

受精前障礙是‘鳳丹’與保康牡丹遠(yuǎn)緣雜交不親和的主要原因，具體體現(xiàn)在花粉-柱頭的識別作用及花粉管能否正常伸長生長。Fu等[14]通過鹽溶液處理柱頭以破壞柱頭識別作用，有效克服了亞洲百合（Lilium Asiatica Hybrida）與東方百合（（Lilium spp.） Oriental hybrids）受精前障礙；Chen等[15]對煙草（Nicotiana tabacum L.）進(jìn)行延遲授粉，避開柱頭識別功能強(qiáng)效階段，從而克服煙草雜交不親和受精前障礙；郝津藜等[36]通過對柱頭施加外源GA3，大幅提高牡丹遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實率，在一定程度上克服了牡丹遠(yuǎn)緣雜交受精前障礙。結(jié)合本試驗，推測通過施加外源IAA、GA3、IPA類植物激素及通過對柱頭識別功能的破壞，或可有效克服‘鳳丹’與保康牡丹受精前障礙，有效提高育種效率，但實際效果有待進(jìn)一步研究論證。