山東省側柏枝枯病病原菌鑒定及其致病性測定

劉在哲，亓玉昆，呂 娟，張玉嬌，張 偉，劉 云，付翠翠，劉 慇，劉保友，王清海＊

（1.濟南市林場，山東 濟南 250014；2.山東省林業科學研究院，山東 濟南 250014；3.濟南市園林和林業科學研究院，山東 濟南 250103；4.山東省煙臺市農業科學研究院，山東 煙臺 265500）

側柏（Platycladus orientalis （L.） Franco），屬柏科（Cupressaceae）側柏屬（Platycladus）常綠喬木，耐干旱貧瘠，適應范圍廣，是我國荒山造林的先鋒樹種，也是重要的園林綠化樹種，除新疆、青海外，全國均有分布。側柏種植在防風固沙、調節生態氣候等方面具有重要意義。側柏是高齡樹種，一些歷史風景名勝地現存的古柏更是中華民族五千年歷史文明的見證及珍貴歷史文化遺存，具有極其重要的自然景觀價值和歷史價值。

側柏葉枯病是一種重要的側柏葉部病害，在我國江蘇、安徽、陜西等地大面積發生，在江蘇盱眙縣側柏被害率達100%，病情指數高達50.0以上，危害嚴重時，側柏干枯死亡，已成為我國側柏最重要的病害之一[1]。目前的研究表明，Alternaria pruni McAlpine[2]、A.alternata （Fr.） Keissler、Pestalotiopsis gracilis （Kleb.） Steyaert、Chloroscypha platycladus Y.S.Dai[3]、Monochaetia sp.[4]和Keithia thujina Durand[5]均可以引起側柏葉枯病。由于生長地理位置及生境差異，病原有所不同。2020年作者發現在濟南市林場、千佛山風景區等側柏林中，側柏鱗葉出現枯黃脫落現象，病株率達90%以上，危害嚴重的側柏整株枯死。濟南市側柏面積8.25萬hm2，側柏枝枯病主要發生于枝葉部，造成側柏樹勢衰弱，可能誘發雙條杉天牛、小蠹蟲等次期性害蟲的危害，造成側柏林成片干枯，影響綠化效果，造成嚴重的生態和經濟損失。為有效控制危害，明確病原種類是十分必要的。因此，本研究通過形態特征、多基因系統發育分析以及致病性測定，明確在濟南市引起側柏枝枯的致病因子，以期為該病害的發生、流行規律及其防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

感病的側柏枝條及鱗葉，從山東省濟南市佛慧山（36°37′37″ N,117°2′44″ E）、仰山（36°36′26″ N,117°1′43″ E）、螞蚱鞍子山（36°37′21″ N,117°44′46″ E）、廻龍山（36°37′25″ N,117°4′26″ E）側柏林采集。

1.2 方法

1.2.1 側柏病組織疑似病原菌分離及分離菌單孢培養 采用組織分離法。先用70%乙醇將樣品表面消毒，然后在側柏細枝、鱗葉病健交界處利用無菌解剖刀取5 mm2的組織塊，依次用3%次氯酸鈉浸泡1 min，無菌水沖洗3次。將處理好的組織塊置于PDA平板上，每個平皿放置5塊，25 ℃培養3 d。將生長的菌落純化轉接至新的PDA平板上，25 ℃下培養，采取孢子稀釋分離法獲取單菌落。分離獲得的菌株均保存于山東省林業科學研究院森林保護研究所。

1.2.2 分離菌致病性測定 分離菌株致病性測定采用室內離體接種法及室外活體接種法。室內離體接種法，選擇健康的側柏細枝條，自來水沖洗干凈，晾干后，用70%酒精表面消毒，備用。將分離獲得的菌株在PDA培養基上培養5 d，在菌落邊緣用打孔器制作菌餅（?=5 mm），轉移至低營養瓊脂培養基（SNA）平板上，菌餅菌絲貼在平板上，在菌餅周圍放置2根無菌松針，紫外燈照射條件下培養10 d誘導產孢。將孢子配置成106孢子·mL?1孢子懸浮液，備用。先用無菌的挑針（?=0.5 mm）輕微刺傷鱗葉，在傷口處滴200 μL孢子懸浮液，以無菌水為對照。將處理后的枝條置于含有少量無菌水的無菌燒杯中，用保鮮膜封閉，置于25 ℃恒溫培養箱中培養7 d，觀察。每組試驗各做5次平行處理，重復2次。

室外活體接種，選用健康無病生長一致的播種2年生盆栽側柏苗進行活體接種。鱗葉用挑針刺傷，干基部用無菌手術刀做“T”傷口，在傷口處滴200 μL 孢子懸浮液，并放上無菌水浸濕的脫脂棉，用剪好的封口膜包扎，以接種無菌水為對照。為了防止水分蒸發過快，每一株側柏用黑色塑料袋包裹，2 d后除去黑色塑料袋，每天進行觀察；每組試驗各做5次平行處理，重復2次。

1.2.3 病原鑒定

1.2.3.1 形態特征觀察 將分離獲得的單孢菌株在PDA培養基平板活化培養5 d，在菌落邊緣利用打孔器制作菌餅（?=5 mm），將菌餅置于PDA、MEA平板中央，每個平板置1塊菌餅，25 ℃、12 h照射/12 h黑暗交替培養，觀察記錄菌落特征。

1.2.3.2 分子生物學鑒定 DNA的提取采用改進的CTAB法。擴增的目的基因分別為核糖體轉錄間隔區序列（ITS）、翻譯延伸因子?1α（TEF1-α）、β-微管蛋白（TUB2）。引物序列及擴增反應條件參數見表1。擴增反應體系為25 μL，其中2 μL DNA 模板、8.5 μL ddH2O、12.5 μL Taq 酶 mix、各1 μL上下游引物。PCR擴增產物由上海派森諾生物科技有限公司進行雙向測序。

表1 PCR 擴增所用引物及反應程序Table 1 Primers used in this study,with sequence and PCR conditions

將獲得的ITS、TEF1-α和TUB2序列提交NCBI 數據庫，并利用Blast進行比對。選取38株Neofusicoccum sp.菌株作為參考菌株，以Botryosphaeria dothidea （CBS 115 476）、Dothiorella iberica （CBS 115 041） 和D.sarmentorum （IMI63581b） 作為外圍菌株（表2）。利用 Fasta alignment joiner 軟件（https://usersbirc.au.dk/～palle/php/fabox/alignment_joiner.php#）通過首尾相連的方法，將 ITS、TEF1-α和TUB2基因串聯。利用MEGA 7.0 軟件，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構建多基因系統發育樹，循環1 000次，并以自展支持率（Bootstrap）校對檢測。

表2 用于系統發育分析的參考菌株序列Table 2 Strains and sequences of the genus Neofusicoccum used in this study

2 結果與分析

2.1 側柏枝枯病癥狀

危害葉片，多由葉片前端或中部枯黃、變褐枯死。危害細枝，呈段斑狀變褐（圖1a,b）。在枯死的鱗葉和細枝上產生黑色的顆粒物（圖1d）。樹冠內部和下部發生嚴重。嚴重時，葉片大量脫落，枝條枯死，在主干或枝干上萌發出一叢叢的小枝葉，形成所謂“樹胡子”。連續數年受害，最終全株枯死（圖1c）。

圖1 側柏枝枯病癥狀（a）～（c）林間癥狀；（d）在側柏鱗葉和枝條上產生的子實體；（e）分生孢子器縱切面Fig.1 Shoot blight disease symptom on Platycladus orientalis; （a）～（c） symptom in the field; （d） fruiting bodies produced on leaves and shoots （e） longitudinal section of pycnidium Bars=20 μm

2.2 分離菌株致病性

從4個地點共采集樣品20份，分離獲得菌株87株。根據菌落形態特征分為3種類型，其中鏈格孢屬真菌27株（31.0%），細菌菌株4株（4.6%），其余為1種真菌共56株（64.4%），菌落形態特征一致，分生孢子形態與側柏鱗葉和枝條上子實體分生孢子形態相似（圖1e）。

選擇代表性菌株CBL-02、CBL-03和CBCB-02菌株室內離體接種7 d后，在鱗葉、枝條接種部位，均可以引起相同癥狀，致使側柏鱗葉變色，形成黑褐色病斑（圖2a），枝條接種點黑褐色（圖2d）。顯微觀察，在鱗葉、枝條接種部位均有黑色子實體產生（圖2b～d）。而空白對照未出現相應癥狀（圖2f）。室外活體接種30 d后，在接種部位側柏鱗葉變黃、枯死（圖2e）。接種60 d，枝條、鱗葉干枯脫落，側柏整株死亡（圖2g），與田間觀察癥狀一致。從接種發病部位重新分離，獲得的菌株與接種菌株形態特征一致。表明，分離菌株為側柏枝枯病的病原菌。

圖2 致病性試驗（a）～（c）側柏葉片接種CBCB-02菌株7 d后癥狀及子實體; （d）側柏枝條接種CBCB-02菌株7d后癥狀及子實體；（e）2年生側柏苗接種CBCB-02菌株30 d癥狀；（f）對照；（g）2年生側柏苗接種CBCB-02菌株60 d癥狀；左邊為對照，右邊為處理。Fig.2 Pathogenicity test; （a）～（c） symptoms on Platycladus orientalis leaves inoculated with isolate CBCB-02 for 7 d; （d） symptoms on inoculation sites of P.orientalis shoot; （e） symptoms on seedlings （2-years） inoculated with isolate CBCB-02 for 30 d; （f） inoculated with sterile distilled water; （g） symptoms on seedlings （2-years）inoculated with isolate CBCB-02 for 60 d,L:control,R:treated

2.3 側柏枝枯病病原菌鑒定

在PDA培養基上，初期白色，稀疏，向四周擴散，培養5 d后，菌落達到平板邊緣（?=70 mm），菌絲開始呈現白色絮狀，菌絲致密，中期顏色逐漸變成灰色（圖3a），后期呈現深灰綠色，背面黑褐色，邊緣完整（圖3b）。在MEA培養基上，初期白色，絮狀向四周擴散生長，后漸變為灰白色。培養3 d，菌落達到平板邊緣（?=70 mm），菌落邊緣完整（圖3d），后期灰色、灰褐色，背面深灰綠色（圖3e）。沒有觀察到有性特征。分生孢子器于7 d內產生于松針上，單生或聚生，外面包被白色菌絲，暗褐色至黑色（圖3c）。分生孢子單孢透明、梭形、橢圓形、卵球形，頂端鈍圓，基部平截，有時兩端變窄。無隔膜，表面光滑，大小為 20.6±2.4 μm×7.6±1.2 μm（L/W=2.7，n=50）（圖3f）。

圖3 側柏枝枯病菌形態特征 （a）～（b）菌落形態（PDA培養7 d，14 d）;（c）誘導培養基中著生在松針上的分生孢子座；（d）～（e）菌落形態（MEA 培養 3 d，7 d）；（f）分生孢子Fig.3 Neofusicoccum occulatum （a）～（b） cultural character （cultured on PDA for 7 d,14 d）,（c） conidiomata formed on pine needles in culture,（d）～（e） cultural character （cultured on MEA for 3 d,7 d）,（f） conidia,Bars=50 μm

2.4 側柏枝枯病病原菌多基因序列分析

CBL-02、CBL-03、CBCB-02菌株與38株Neofusicoccum spp.參考菌株進行比對，以Botryosphaeria dothidea CBS115476、Dothiorella iberica CBS115041、D.sarmentorum IMI63581B為外圍菌株，基于 ITS、TEF1-α、TUB2基因序列數據，運用最大似然法（Maximum Likelihood）構建進化樹。CBL-02，CBL-03和CBCB-02菌株與Neofusicoccum occulatum聚在一個進化分枝上，自展支持率為 89%（圖4）。結合分離菌株形態特征、培養性狀以及多基因系統發育分析，本試驗獲得的菌株為N.occulatum Sakalidis,M.L.,Burgess,T.I.。

圖4 利用最大似然法基于側柏葉枯病菌ITS、TEF-1α和TUB2的基因數據構建的系統發育樹。自展支持率標于節點處，以Botryosphaeria dothidea CBS115476、Dothiorella sarmentorum、D.iberica為外圍菌株，標尺指示 0.005 步變化。Fig.4 Phylogenetic tree of all isolates tested with allied taxa calculated with sequence data of concatenated ITS,TEF-1α and TUB2 using maximum likelihood method （1,000 bootstrap replicates; bootstrap values indicated at nodes.Botryosphaeria dothidea,Dothiorella sarmentorum and D.iberica represent the out group.The scale bar indicates the number of expected changes per site.

3 討論

N.occulatum是Sakalidis 2011年[6]首次在澳大利亞的桉樹（Eucalyptus spp.），瓦勒邁杉（Wollemia nobilis W.G.Jones,K.D.Hill & J.M.Allen）上分離獲得。已有研究表明，N.occulatum已在非洲（烏干達）、大洋洲（澳大利亞、美國夏威夷）、南美洲（烏拉圭）、亞洲（泰國）等5個國家有分布，可以危害南洋杉（Araucaria cunninghamii Sweet），鄧恩桉（Eucalyptus dunnii Maiden），大桉（E.grandis W.Mill ex Maiden），巨桉雜交種（E.grandis hybrid），粗皮桉（E.pellita F.V.Muell.），桉樹（Eucalyptus sp.），尾葉桉和赤桉雜交種（Eucalyptus urophylla S.T.Blake x E.camaldulensis Dehnh.），瓦勒邁杉（W.nobilis），銀樺（Grevillea sp.），Blepharocalyx salicifolius （Kunth） O.Berg，藍莓（Vaccinium spp.），葡萄（Vitis vinifera L.），束花石斛（Dendrobium chrysanthum Wall.ex Lindl.）等寄主植物[7-9]。本研究結果表明N.occulatum已在我國有分布，這是國內有關N.occulatum的首次報道。目前，對N.occulatum的研究僅局限分類研究，其生物學、生態學、流行學、種群遺傳結構和有效的防治措施尚需進一步系統研究。

據已有的文獻報道，新殼梭孢屬真菌（Neofusicoccum sp.）可以危害美國扁柏（Chamaecyparis lawsoniana （A.Murray bis）Parlatore）、日本扁柏（Ch.Obtuse （Siebold et Zuccarini） Enelicher）、日本花柏（Ch.pisifera（Siebold et Zuccarini） Enelicher）、 柏 木（Cupressus funebris Endl.）、地中海柏木（Cu.sempervirens L.）、歐洲刺柏（Juniperus communis L.）、北美香柏（Thuja occidentalis L.）、北美喬柏（T.plicata Donn ex D.Don）、羅漢柏（Thujopsis dolabrata （Thunberg ex L.f.）Sieb.et Zucc.）、 巨 杉 （Sequoiadendron giganteum （Lindl.） J.Buchholz）[10]，尚未見危害側柏的報道，是側柏上發生的一種新病害。

4 結論

本研究通過組織分離、單孢純化，致病性測定，表明獲得的單孢菌株CBL-02，CBL-03和CBCB-02均可以引起側柏枝枯病。通過形態學以及多基因系統發育分析，證實分離獲得菌株為N.occulatum。