ICP-MS法用于不同產地大葉茜草中9種微量元素的含量測定及質量評價

李 建,黃宇思,賴 慧,陳 立,楊 雪,趙福蘭

西南醫科大學附屬中醫醫院藥劑科,瀘州 646000

大葉茜草為茜草科植物大葉茜草(RubiaschumannianaPritz.)的干燥根莖,春、秋采挖,除去泥沙,干燥,即得;具有涼血止血、化瘀止血、消炎解毒的作用;臨床主要用于治療血熱引起的各種崩漏出血、吐血、便血以及腫瘤、跌打損傷腫痛等[1-3]。鑒定大葉茜草的標準目前收錄于《四川省中藥材標準》2010年版,標準中只有大葉茜草的常規檢查項和對大葉茜草素的含量控制[4],無其他質控指標(如針對大葉茜草中蒽醌類、環肽類化學成分的檢測指標和其中多種微量元素的檢測指標)[5-7]。近年來由于人們對中草藥的深入研究,發現微量元素與人體的新陳代謝、生長發育和疾病的發生存在關聯,因此有必要對大葉茜草中的微量元素進行含量測定。目前關于大葉茜草的報道主要是針對大葉茜草的化學成分[8-9]、質量標準[10]、藥理作用的研究[11-12],以及微量元素含量測定的報道。目前用于中藥材中微量元素測定的方法主要有原子吸收光譜法[13-14]、原子熒光光譜法[15-16]、電感耦合等離子體發射光譜儀(inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy,ICP-OES[17])法、電感耦合等離子體質譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS[18])法等。原子吸收光譜法和原子熒光光譜法只能測定單一元素的含量,不能同時測定多種元素的含量,且靈敏度低、耗時較長。等離子體發射光譜和等離子質譜法在測定痕量元素中具有較大優勢,可以同時測定多種元素,測定速度快、靈敏度高,目前電感耦合等離子體質譜法是公認的可同時測定多種元素較常用的方法,因此廣泛用于食品、藥品、紡織、農產品等各個行業。因此,本文參考文獻方法[19-20]建立同時測定不同產地16批次大葉茜草中9 種微量元素含量的ICP-MS法,并用聚類分析(cluster analysis,CA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)對測定結果進行全面評價,篩選出大葉茜草的主要特征元素,并揭示不同產地大葉茜草之間的差異,從而客觀、全面地評價大葉茜草的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Nexlon 310X 型電感耦合等離子體質譜儀(美國PE公司);Muiti Wav PRO 41HVT56型微波消解儀(美國安東帕儀器公司);Sartorius BP210S型電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司);100、200 μL,1 mL移液槍均購自德國Eppendorf公司。

1.2 試藥

多元素對照品溶液[(鋁(Al)、砷(As)、硼(B)、鋇(Ba)、鈣(Ca)、鎘(Cd)、鈷(Co)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鐵(Fe)、鉀(K)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鉬(Mo)、鈉(Na)、鎳(Ni)、鉛(Pb)、銻(Sb)、硒(Se)、錫(Sn)、鍶(Sr)、鈦(Ti)、鉈(Tl)、釩(V)、鋅(Zn),批號GNM-M251678-2015,質量濃度為100 μg·mL-1],內標溶液鍺(Ge)、銦(In)(質量濃度均為1 000 μg·mL-1),均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心;KED調諧液(儀器自帶,美國珀金埃爾默公司);硝酸(質量分數65%,優級純,購自美國Merck公司);水為超純水,電阻率≥18.3 MΩ·cm,用Millipore超純水機制備。

16批大葉茜草于2019～2021年在各大藥材市場和超市購買,均經趙福蘭主任藥師鑒定為茜草科植物大葉茜草(RubiaschumannianaPritz.)的干燥根莖,為大葉茜草正品。藥材來源信息見表1。

表1 大葉茜草的來源信息Tab.1 Sources of Rubia schumanniana Pritz.

2 方法與結果

2.1 ICP-MS條件

ICP-MS儀器的工作參數:RF射頻功率為1 500 W,等離子體氣體流速為20 L·min-1,輔助氣體流速為1.6 L·min-1,霧化氣流速為0.85 L·min-1,采樣深度為7.0 mm,樣品提升速率為1.0 L·min-1,液氬壓力為0.7 MPa,脈沖電壓為850 V,樣品沖洗30 s,延遲20 s。數據采集重復測定3次,測定時將Ge和In作為內標物進行校正。

2.2 對照品溶液的配制

分別精密吸取上述多元素的對照品溶液,用超純水稀釋制成每1 mL 中分別含下列元素的系列對照溶液:K 250、500、1 250、2 500、5 000 ng,Ca 250、500、1 250、2 500、5 000 ng,Na 25、50、125、250、500 ng,Mg 25、50、125、250、500,Al 100、200、500、1 000、2 000 ng,Zn 25、50、125、250、500 ng,Fe 100、200、500、1 000、2 000 ng,Mn 250、500、1 250、2 500、5 000 ng,Se 5、10、25、50、100 ng。分別精密吸取內標元素Ge和In對照品溶液(質量濃度均為1 000 μg·mL-1)100 μL,置于100 mL量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,作為Ge和In對照品儲備溶液I(質量濃度均為1 μg·mL-1)。另精密吸取Ge和In對照品儲備溶液I 1 mL,置于10 mL量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,作為Ge和In對照品溶液(質量濃度均為100 ng·mL-1)。

2.3 供試品溶液的配制

取樣品S1(批號191201)進行粉碎,過2號篩,混勻備用,精密稱取上述粉末0.5 g,置于微波消解罐中,精密加入硝酸8 mL,混勻,然后旋緊外裝置,置于微波消解儀內,微波消解程序見表2。消解完成后進行趕酸,調節溫度至120 ℃將硝酸揮發至1～2 mL時,用超純水將消解罐中的液體轉移至50 mL 聚四氟乙烯材料的量瓶中,加水稀釋至刻度,同時配制樣品空白溶液。

表2 微波消解儀工作條件Tab.2 Working conditions of microwave digestion

2.4 線性關系考察

取2.2項下的9種元素混合系列對照品溶液,按照2.1項下的儀器工作條件進行測定,內標進樣管插入質量濃度為100 ng·mL-1的內標溶液中,同時將進樣管按照質量濃度從小到大的順序插入各個混合系列對照品溶液中,每個樣品測定3次,以3次信號值的平均值為縱坐標(y)、相對應的進樣質量濃度作為橫坐標(x),進行線性回歸。結果見表3。

表3 9種微量元素的線性方程、相關系數和線性范圍Tab.3 Linear equations,correlation coefficients and linearity

2.5 精密度實驗

取2.2項下的9種微量元素混合系列對照品溶液,分別取K(1 250 ng·mL-1)、Ca(1 250 ng·mL-1)、Na(125 ng· mL-1)、Mg(125 ng· mL-1)、Al(500 ng·mL-1)、Zn(125 ng·mL-1)、Fe(500 ng·mL-1)、Mn(1 250 ng·mL-1)和Se(25 ng·mL-1)元素的混合對照品溶液,按照2.1項下的儀器工作條件進行測定6次,測量記錄信號強度值。計算得K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn、Se 的RSD 值分別為1.36%、1.88%、2.15%、1.38%、2.21%、1.55%、2.82%、3.06%、1.93%,RSD 值均小于4%,表明儀器的精密度良好。

2.6 重復性實驗

取樣品S1,按照2.3項下的方法制備供試品溶液6份,按照2.1項下的儀器條件進行測定,每個樣品重復測定3次,分別計算9種微量元素的含量。計算得K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn、Se的平均含量分別 為21 260、250、930、2 260、50.18、49.65、63.56、55.50、0 mg·kg-1,RSD 值分別為1.22%、1.36%、0.98%、1.07%、2.34%、2.69%、3.11%、2.21%、0,表明該方法的重復性良好。

2.7 穩定性實驗

取樣品S1,按照2.3項下的方法制備供試品溶液,按2.1項下的儀器條件進行測定,分別于0、1、2、4、8、12、16、20、24 h進樣測定,記錄測定值。計算得K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn、Se的RSD 值分別為2.52%、2.19%、2.77%、1.98%、3.28%、3.05%、2.65%、3.22%、0,RSD 值均小于4%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取樣品S1粉末0.25 g,平行制備6份樣品,置于消解罐內,每份按照樣品含量加入相應的對照品溶液,按照2.3項下方法制備供試品溶液,同法制備空白溶液,按照2.1項下的儀器工作條件測定,分別計算9種微量元素的加樣回收率和RSD 值。結果見表4。

表4 9種微量元素的加樣回收率實驗結果 (n=6)Tab.4 Results of recovery tests of the 9 trace elements (n=6)

表4(續) 9種微量元素的加樣回收率實驗結果 (n=6)Tab.4(Continued) Results of recovery tests of the 9 trace elements (n=6)

2.9 檢出限

取2.3項下的空白溶液,按2.1項下的儀器工作條件測定,空白溶液平行測定11次,計算空白溶液中的K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn、Se 的標準偏差(s),k為各元素標準曲線的斜率,以3s/k作為各種被測元素的檢出限,以10s/k作為各種被測元素的定量限,計算各種元素的檢出限和定量限。計算得K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se的檢出限分別為6.352、2.618、3.125、0.556、2.715、0.811、7.128、0.067、0.412 ng·mL-1;定量限分別為21.171、8.726、10.416、1.853、9.049、2.703、23.758、0.223、1.373 ng·mL-1。

2.10 樣品測定

取2019～2021年在各大藥材市場和超市收集的16批大葉茜草,按照2.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下儀器工作條件進行測定,測量3次,取平均值,分別計算16批樣品中9種元素的含量。結果見表5。

表5 16批不同產地大葉茜草中9種微量元素的含量Tab.5 Results of 16 batches form different origins of the root of Rubia schumanniana Pritz.

2.11 相關性分析

本實驗通過對不同產地大葉茜草中9種微量元素含量之間的相關性進行分析,表明某些元素之間存在極顯著或顯著的相關性。相關性分析主要是對多個具備相關性的指標進行分析,從而衡量不同組分間的聯系。當P＜0.05時,表示在0.05水平上顯著性相關;當P＜0.01時,表示在0.01水平上極顯著性相關。本實驗的測定結果見表6。由表6可知,Ca與Na、Fe、Mn均呈極顯著性正相關,其相關系數分別為0.901(P＜0.01)、0.832(P＜0.01)和0.724(P＜0.01),表明在大葉茜草中Ca與Na、Fe、Mn具有一定的協同作用。

表6 大葉茜草中9種微量元素的Pearson相關性分析Tab.6 Pearson correlation analysis of the 9 trace elements in the root of Rubia schumanniana Pritz.

2.12 CA

用SPSS 20.0軟件對上述16個不同產地的大葉茜草中的9種微量元素含量測定結果進行CA,用組間聯接方法、平均Euclidean距離進行層次聚類。結果顯示,當平均Euclidean距離為5時,16批樣品共分為6類,結果見圖1。其中S6、S9、S5、S13、S4聚為第一類;S7、S8聚為第二類;S1、S2聚為第三類;S10、S15、S12聚為第四類;S3、S14聚為第五類;S11為第六類。由圖1可知,相同類之間微量元素含量的相似度較高,不同類之間的差異較大,因此不同產地大葉茜草中9種微量元素含量的差異明顯,需要綜合各方面因素客觀評價產地的藥材質量優劣。

圖1 16個不同產地大葉茜草中9種微量元素的系統聚類分析Fig.1 Cluster analysis of the 9 trace elements in the root of Rubia schumanniana Pritz.from different origins

2.13 PCA

為研究9種微量元素在不同產地大葉茜草微量元素變異中各自的貢獻率,用SPSS 20.0軟件對上述16個不同產地的大葉茜草中的9種微量元素測定結果進行PCA。PCA 是將多個變量通過線性變換以降維方式轉變為少數幾個變量,從而用少數變量去解釋樣品中大部分變異的新變量的方法。結果見表7。PCA 已經將原來的變量重新組合成一組新的變量信息,根據Kaiser準則(特征值大于1)及累計貢獻率達85%以上。由表7 可知,前3 個成分的特征值大于1,累計貢獻率達到88.9%,表明這3個成分可代表原始數據88.9%的變量信息,因此對這3個主成分進行因子分析,結果見表8。由表8可知,第一個主成分因子中Ca、Na、Fe的負荷量較大,第二個主成分因子中Mg的負荷量較大,第三個主成分因子中無負荷量較大的元素,因此可以確定Ca、Na、Fe和Mg為大葉茜草的主要特征性微量元素。

表7 主成分的初始特征值和方差貢獻率Tab.7 Initial eigenvalues and variance contribution rates of principal components

表8 3個主成分的因子載荷矩陣Tab.8 Factor loading matrix for 3 principal components

3 討論

3.1 微量元素的測定

各種微量元素不僅參與植物的生理代謝,也是植物次生代謝產物的構成因子,元素的種類和含量的高低對中藥的生長以及臨床藥效發揮一定的作用,且不同產地的藥材所含微量元素的差異較大,因此對中藥所含的微量元素進行檢測也是中藥質量評價的重要指標之一。目前對微量元素的測定主要采用原子吸收光譜法,但是用原子吸收光譜法測定時,每種元素需要特定發射波長的燈,分析速度慢。電感耦合等離子體方法在測定多種元素中具有較大的優勢,可同時測定多種元素且分析速度快、靈敏度和準確度高,因此適用于中藥材中多種微量元素的同時測定。

3.2 結果的判定

通過對16個不同產地的大葉茜草中9種微量元素進行含量測定,并用聚類分析和主成分分析進行綜合評價,結果顯示,不同產地的大葉茜草中微量元素含量的差異較大,相同產地微量元素含量的差異較小,產自貴州遵義的大葉茜草中K、Ca和Na的含量均高于其他產區,Se元素在大部分產地的大葉茜草中未檢出,K、Na和Mg 元素的含量遠高于其他元素,K 的最高含量達26 273 mg·kg-1,其次為Mg(3 872 mg·kg-1)和Na(2 897 mg·kg-1),不同產地大葉茜草中Na元素含量的差異最大,這與當地的土壤、氣候以及生態環境有關,因此需要對藥材質量進行綜合評價。

本實驗建立了同時測定不同產地16批大葉茜草中9種微量元素含量的ICP-MS方法,并對16批藥材中的9種微量元素進行分析,探究它們之間的相似性。PCA 結果顯示,Ca、Na、Fe和Mg為其主要特征性微量元素,可以反映大葉茜草中其他多種元素的信息,是大葉茜草生長發育過程中的重要參與者。從含量測定結果可以看出,不同產地的大葉茜草中K 含量最高,其次是Mg和Na元素,這可能是因為K 是植物生長的必需元素,K 可以維持細胞的正常含水量,提高植物的抗旱和抗寒能力,因此含量較高。此外,通關Pearson相關性分析發現不同元素之間具有顯著的相關性,表明植物的生長離不開多種微量元素的協同作用。本實驗的結果顯示,不同產地大葉茜草中微量元素含量的差異較大,相同產地的差異較小,因此評價大葉茜草的質量需要綜合各種因素進行全面評價,選擇質量較好的大葉茜草為臨床所用,從而保證臨床療效。