二氫槲皮素對IgA腎病大鼠腎臟保護的機制

師旭輝 ,于建軍 ,秦 洋 ,曲礦云* ,劉風勛

1.黃河三門峽醫院腎臟內科,三門峽 472000;2.鄭州大學第一附屬醫院腎內科,鄭州 450000

IgA 腎病(IgA nephropathy,IgAN)是一種慢性進展性疾病,多數患者最終發展為腎功能衰竭[1]。目前對終末期腎病患者,除腎臟替代治療外,尚無特異性治療手段,因此,探尋延緩IgAN 進展、減輕腎臟病理變化的治療方法十分必要[2]。二氫槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)存在于花旗松、落葉松等植物中,屬于二氫黃酮類化合物,具有抗炎、抗氧化、調節免疫、抗腫瘤等生物效應[3]。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(protein kinase B,Akt)信號通路參與細胞分化、凋亡、增殖等生命活動[4-5],上調PI3K/Akt信號通路的表達,可加重腎小管上皮細胞炎性損傷[6],表明PI3K/Akt信號通路與腎臟疾病的發展密切相關。本研究通過建立IgAN 大鼠模型,分析DHQ 對IgAN 大鼠腎臟的保護作用及其對PI3K/Akt信號通路的作用機制,為臨床治療提供實驗與理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7600-020型全自動生化分析儀(日立公司);DYCZ-20G 型電泳儀(北京六一生物科技有限公司);1000-液晶型超聲細胞破碎儀(南京賽飛生物科技有限公司);TGL20M 型臺式超低溫離心機(河南信陵儀器設備有限公司)。

1.2 試藥

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,質量分數為97%)、Masson染色液均購自北京索萊寶科技有限公司;四氯化碳(CCl4)、HE 染色液均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蓖麻油(北京伊諾凱科技有限公司);脂多糖(大連美侖生物技術有限公司);二氫槲皮素(DHQ,質量分數≥98%)和740Y-P(質量分數＞96%),均購自上海麥克林生化科技有限公司);TLR4 熒光一抗以及Akt、p-Akt、PI3K 及p-PI3K 抗體均購自美國Abcam 公司

1.3 動物

SPF清潔級SD 雄性大鼠78只,8周齡,體質量為(175±25) g,購自北京唯尚立德生物科技有限公司,許可證號為SCXK(京)2016-0009,用普通飼料進行適應性喂養,自由進食、飲水,喂養1周,實施封閉管理。

2 方法

2.1 建立IgA 腎病大鼠模型

將78 只大鼠分為對照組(15 只)與干預組(63只),對照組不進行任何干預,干預組灌服BSA溶液(20 g BSA+500 mL 生理鹽水,制成質量濃度為40 mg·mL-1的BSA 溶液),隔日1 次,連續處理6周;每周予以0.1 mL CCl4+0.5 mL蓖麻油皮下注射,連續處理9周;并于第6周、第8周時,于大鼠尾靜脈注射0.05 mg脂多糖(將10 mg脂多糖充分溶解于1 mL生理鹽水中,再取脂多糖溶液500 μL+生理鹽水100 mL 混勻),直接免疫熒光染色顯示系膜區有大量IgA 沉積為造模成功[7]。

2.2 動物分組與干預

干預組納入造模成功的大鼠58只,隨機分為模型組(14只)、740Y-P組(14只)、DHQ組(15只)、740Y-P+DHQ 組(15 只)。DHQ 組每日用100 mg·kg-1的DHQ溶液(用體積分數0.4%羧甲基纖維素鈉配制)灌胃;740Y-P組腹腔注射740Y-P溶液0.02 mg·kg-1,每日1次;740Y-P+DHQ 組大鼠每日用100 mg·kg-1DHQ溶液灌胃,并腹腔注射740Y-P溶液0.02 mg·kg-1;對照組、模型組用等量生理鹽水灌胃及腹腔注射。上述5組均連續處理12周。

2.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠血清炎性因子水平

末次干預后2 h,將各組大鼠用戊巴比妥鈉腹腔麻醉,采集5 mL 腹主動脈血,以3 000 r·min-1離心20 min(離心半徑為10 cm),取血清,用ELISA 檢測大鼠血清炎性因子,按照說明書中的步驟稀釋后加樣。設置空白孔與樣本孔,樣本孔加酶標試劑,封板后于37 ℃溫育30 min,加洗滌液,靜置30 s后棄去,重復5次,拍干,加入顯色劑,37 ℃避光顯色10 min,加入終止液終止反應,檢測450 nm 處各孔的吸光度,計算大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平。

2.4 全自動生化分析儀測定大鼠腎功能

于末次給藥前24 h收集大鼠尿液,去沉渣,用雙縮脲法測定各組大鼠24 h尿蛋白定量(24 hours urinary protein quantitative,24 h pro);末次干預后取腹主動脈血標本,以3 000 r·min-1離心20 min(離心半徑為10 cm)后,用全自動生化分析儀測定血清肌酐(serum creatinine,Scr)及血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平。

2.5 HE染色檢測大鼠腎組織變化

采血完畢,處死大鼠,摘取兩側腎臟,用體積分數4%多聚甲醛固定(24 h)左腎組織,沖去腎組織表面的結晶,用體積分數70%、85%、95%、100%、100%乙醇脫水,每梯度30 min,二甲苯透明,浸蠟包埋,切成厚度3 μm 的病理切片;將切片依次放入二甲苯脫蠟15 min(3次),無水乙醇水化,滴加蘇木素染液染色8 min,用自來水沖洗,擦干多余水分,滴加分化液3～4 s,流水沖洗,滴加伊紅染料2 min,乙醇浸潤,切片組織稍干后用中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察腎組織變化。

2.6 Masson染色觀察大鼠腎纖維化

將4 μm石蠟切片放置于60 ℃烤箱,放置3～5 h,脫蠟水化,將Masson 復合染色液適量滴加在組織上,30 s后用蒸餾水沖洗,加入磷鉬酸鹽(5 min),甩干磷鉬酸鹽,滴加苯胺藍染色(5 min),用蒸餾水沖洗,滴加分化液2次,45 s后甩干;將組織玻片依次放入體積分數為95%的乙醇溶液(1次)、乙醇(2次)浸潤10 s,浸入二甲苯2 min(2次),玻片稍干后封片,置于顯微鏡下觀察染色情況。

2.7 直接免疫熒光染色檢測IgA 沉積

將6 μm 冰凍切片用體積分數4%甲醛固定(10 min),用PBS沖洗,插入玻片架,用檸檬酸鹽緩沖液浸潤,高壓抗原修復3 min,取出玻片,冷卻至室溫,用PBS沖洗3次,每次5 min,滴加TLR4熒光一抗(FITC標記),置于4 ℃冰箱中避光孵育;次日用PBS沖洗3次,每次5 min,稍干后滴加抗熒光淬滅劑(50～100 μL),封片,于-20 ℃保存。

2.8 Western blot測定大鼠Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 蛋白的表達水平

取保存于液氮中的右腎,加入蛋白裂解液1 mL,用超聲細胞破碎儀破碎細胞(3 min),以12 000 r·min-1離心10 min,提取總蛋白,用蛋白質定量法檢測各組大鼠右腎蛋白質量濃度,用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉膜,用Tween-20磷酸鹽緩沖液封閉(含質量濃度為5 g·L-1的脫脂奶粉)1 h,加入Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,次日用TBST洗膜,加入IgG 二抗(1∶5 000)孵育2 h,ECL曝光,置于凝膠成像分析系統,以β-actin為內參,分析目的蛋白的表達水平。

2.9 統計學方法

用Image-Pro plus 6.0軟件采集與分析圖像,用SPSS 22.0軟件分析數據,計量資料以()表示,多組間比較用單因素方差分析,進一步兩兩比較用LSD-t檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 DHQ 對IgA 腎病大鼠炎性因子含量的影響

與對照組比較,模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6 的含量升高(P＜0.05);與模型組比較,740Y-P組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6的含量升高,DHQ 組、DHQ+740Y-P 組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6 的含量降低(P＜0.05);與DHQ+740Y-P組比較,DHQ 組血清IL-1β、TNF-α和IL-6的含量降低(P＜0.05)。結果見表1。

表1 DHQ 對IgA腎病大鼠血清IL-1β、TNF-α 和IL-6水平的影響 ()Tab.1 Effect of dihydroquercetin on serum IL-1β,TNF-α and IL-6 levels in rats with IgA nephropathy ()

表1 DHQ 對IgA腎病大鼠血清IL-1β、TNF-α 和IL-6水平的影響 ()Tab.1 Effect of dihydroquercetin on serum IL-1β,TNF-α and IL-6 levels in rats with IgA nephropathy ()

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與740Y-P組比較,cP＜0.05;與DHQ 組比較,dP＜0.05。

3.2 DHQ 對IgA 腎病大鼠腎功能的影響

與對照組比較,模型組24 h pro、Scr和BUN 水平升高(P＜0.05);與模型組比較,740Y-P 組24 h pro、Scr和BUN 水平升高,DHQ 組、DHQ+740Y-P組24 h pro、Scr和BUN 水平降低(P＜0.05);與DHQ+740Y-P 組比較,DHQ 組24 h pro、Scr 和BUN 水平降低(P＜0.05)。結果見表2。

表2 DHQ 對IgA腎病大鼠24 h pro、Scr和BUN 水平的影響 ()Tab.2 Effect of dihydroquercetin on the levels of 24 h pro,Scr and BUN in rats with IgA nephropathy ()

表2 DHQ 對IgA腎病大鼠24 h pro、Scr和BUN 水平的影響 ()Tab.2 Effect of dihydroquercetin on the levels of 24 h pro,Scr and BUN in rats with IgA nephropathy ()

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與740Y-P組比較,cP＜0.05;與DHQ 組比較,dP＜0.05。

3.3 DHQ對IgA腎病大鼠腎臟HE染色結果的影響

對照組大鼠腎小球正常,腎間質未見炎性浸潤,幾乎無腎小球萎縮;模型組腎小球基底膜增厚,炎性細胞浸潤,腎小球萎縮;740Y-P組炎性細胞浸潤及腎小球明顯萎縮,小血管硬化,較模型組大鼠腎臟病理表現加重;DHQ 組病理損傷減輕,腎小球趨于正常,有少量炎性浸潤,較模型組及740Y-P 組改善明顯;DHQ+740Y-P組炎性浸潤、腎小球萎縮有所改善,但程度遠不及DHQ 組。結果見圖1。

圖1 大鼠腎組織HE染色結果Fig.1 HE staining results of rat kidney tissue

3.4 DHQ 對IgA 腎病大鼠腎纖維化的影響

由表3可知,Masson染色顯示對照組大鼠腎內未見明顯藍色膠原蛋白沉積,腎臟無纖維化;模型組、740Y-P組均沉積較多藍色膠原蛋白,纖維化程度加重,且740Y-P組更為明顯;DHQ 組藍色膠原蛋白沉積最少,腎纖維化程度減輕,而DHQ+740Y-P組藍色膠原蛋白沉積有所減輕,但纖維化程度高于DHQ 組。由圖2可見,與對照組比較,模型組陽性區占觀察視野面積比升高(P＜0.05);與模型組比較,740Y-P組面積比升高,DHQ 組、DHQ+740Y-P組面積比降低(P＜0.05);與DHQ+740YP組比較,DHQ 組面積比降低(P＜0.05)。結果見表3、圖2。

表3 DHQ 對IgA腎病大鼠膠原纖維陽性區占觀察視野面積比和IgA綜合密度的影響 ()Tab.3 Effect of dihydroquercetin on the ratio of collagen fiberpositive area to the observation field and the comprehensive density of IgA in rats with IgA nephropathy ()

表3 DHQ 對IgA腎病大鼠膠原纖維陽性區占觀察視野面積比和IgA綜合密度的影響 ()Tab.3 Effect of dihydroquercetin on the ratio of collagen fiberpositive area to the observation field and the comprehensive density of IgA in rats with IgA nephropathy ()

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與740Y-P組比較,cP＜0.05;與DHQ 組比較,dP＜0.05。

圖2 腎組織Masson染色結果Fig.2 Masson staining results of kidney tissue

3.5 DHQ 對IgA 腎病大鼠直接免疫熒光染色結果與IgA 沉積的影響

由圖3可知,對照組大鼠腎內無綠色熒光;模型組、740Y-P組可見大量IgA 綠色熒光沉積,且740Y-P組更甚;DHQ組僅有微量IgA綠色熒光沉積,而DHQ+740Y-P組IgA綠色熒光沉積程度高于DHQ組。由表3可知,與對照組比較,模型組IgA 密度值升高(P＜0.05);與模型組比較,740Y-P組IgA密度值高于模型組,DHQ 組、DHQ+740Y-P組IgA 密度值降低(P＜0.05);與DHQ+740Y-P組比較,DHQ組IgA 密度值降低(P＜0.05)。結果見表3、圖3。

圖3 腎組織直接免疫熒光染色Fig.3 Direct immunofluorescence staining of kidney tissue

3.6 DHQ 對IgA 腎病大鼠Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K 蛋白表達水平的影響

與對照組比較,模型組p-Akt、p-PI3K 蛋白的表達水平升高(P＜0.05);與模型組比較,740Y-P 組p-Akt和p-PI3K 蛋白的表達水平升高,DHQ 組、DHQ+740Y-P組p-Akt和p-PI3K 蛋白的表達水平降低(P＜0.05);與DHQ+740Y-P組比較,DHQ 組p-Akt和p-PI3K 蛋白的表達水平降低(P＜0.05)。結果見表4、圖4。

圖4 腎組織Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 蛋白的表達水平Fig.4 Akt,p-Akt,PI3K and p-PI3K protein expression in kidney tissue

表4 DHQ 對IgA腎病大鼠Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 蛋白表達的影響 ()Tab.4 Effect of dihydroquercetin on the protein expression of Akt,p-Akt,PI3K,and p-PI3K in rats with IgA nephropathy ()

表4 DHQ 對IgA腎病大鼠Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 蛋白表達的影響 ()Tab.4 Effect of dihydroquercetin on the protein expression of Akt,p-Akt,PI3K,and p-PI3K in rats with IgA nephropathy ()

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與740Y-P組比較,cP＜0.05;與DHQ 組比較,dP＜0.05。

4 討論

目前研究認為[8]IgAN 的發病與免疫炎癥學、遺傳學等機制相關,其發病伴隨著趨化因子、炎性因子、免疫誘導等的炎癥級聯反應,引起機體炎癥浸潤,細胞因子、活性氧等表達量增加,引起系膜區以IgA 為主的復合物沉積[9-10],病情進展下逐漸誘導腎小球硬化與腎間質纖維化,導致腎功能發生不可逆損傷。因此探尋有效藥物來阻斷、延緩IgAN 病情的進展,或可阻斷不可逆損傷的發生,從而改善患者的預后。

DHQ 又稱花旗松素,結構特殊,生物效用廣泛,抗氧化能力強于普通黃酮類化合物,研究表明,其具有抑制腫瘤、舒張血管、治療高血壓等作用[11-12],且DHQ 還具有抑制細胞增殖、降低炎癥水平與氧化應激的作用[13]。有學者將DHQ 應用于糖尿病腎病大鼠,結果顯示DHQ 可減輕大鼠模型癥狀,起到保護腎臟的作用[14]。IgAN是一種炎癥性腎臟疾病,機體多種細胞因子表達紊亂,如IL-1β、TNF-α及IL-6等炎性因子持續作用可激發內皮因子釋放,引起腎小球系膜增生,腎小球內皮細胞通透性增大,進而使大分子蛋白濾出腎小球,且炎性因子還可影響氮質代謝廢物排泄,導致腎功能發生進展性損傷[15],調節炎性因子水平可使腎臟病理損傷減輕[16]。本研究結果顯示,模型組血清IL-1β、TNF-α和IL-6 水平以及24 h pro、Scr和BUN 的水平高于對照組,提示IgAN 大鼠血清炎性因子過量表達,腎功能受損,而用DHQ處理后上述血清炎性因子與腎功能指標明顯下降,說明DHQ 在減輕IgAN 大鼠炎癥反應方面效果確切,可調節腎小球濾過作用,促進Scr、BUN 排出,改善大鼠腎功能。此外,觀察HE、Masson、直接免疫熒光染色結果發現,對照組腎小球正常,腎間質未見炎性浸潤,腎臟無纖維化,無IgA 綠色熒光沉積,而造模后大鼠腎小球萎縮,腎臟纖維化程度加強,腎內可見大量IgA 綠色熒光沉積,用DHQ 處理后造模大鼠病理情況均有明顯改善,說明DHQ 能減少IgA 沉積,減輕炎癥因子表達,緩解腎臟纖維化,以改善大鼠腎功能。

PI3K/Akt通路是細胞內重要的信號轉導系統,因其能調節細胞骨架、影響細胞遷移而受到重視,其中PI3K 由調節亞基p85與催化亞基p110組成,可接收G 蛋白連接受體傳遞的信號,Akt是PI3K 下游的直接靶蛋白,接收PI3K 觸發的表達信息,磷酸化下游諸多功能蛋白等效應因子,參與細胞凋亡、分化、存活等生理過程的調控,進而調控機體細胞的活性[17-18]。研究發現,PI3K/Akt通路與腎臟缺血再灌注損傷[19]及腎纖維化[20]有關。為明確DHQ 治療IgAN 大鼠的作用機制,本研究用Western blot檢測PI3K/Akt通路及其相關蛋白表達水平的變化,結果發現,模型組p-Akt、p-PI3K 蛋白的表達水平高于對照組,表明IgAN 大鼠機體PI3K/Akt通路異常活化,參與IgAN 病情進展;在造模基礎上使用激動劑740Y-P處理,結果顯示,740Y-P組p-Akt和p-PI3K蛋白的表達水平高于模型組,表明腎病理損傷越嚴重,p-Akt 和p-PI3K 蛋白的表達水平越高;而用DHQ 處理后,DHQ 組p-Akt和p-PI3K 蛋白的表達水平明顯低于740Y-P組、DHQ+740Y-P組,提示即使在740Y-P抵消DHQ 部分作用的情況下,DHQ 仍可下調p-Akt和p-PI3K 蛋白的表達水平,由此證實DHQ 可抑制PI3K/Akt信號通路相關分子的表達,調節IgAN 大鼠腎功能,改善預后。

綜上所述,DHQ 應用于IgAN 大鼠,可降低大鼠血清炎性因子表達水平,明顯減少膠原蛋白與IgA沉積,減輕病理損傷,改善大鼠腎功能,這可能與DHQ 抑制PI3K/Akt通路有關,可為后續實驗研究及臨床治療提供參考依據。