赤芍內酯苷對早孕流產大鼠子宮內膜的作用

李 瑩 ,陳建玲 ,吳佩蔚 ,黃亞哲 ,張 帥 ,張 丹

1.南陽市中心醫院生殖醫學科,南陽 473400;2.鄭州大學第二附屬醫院生殖醫學部,鄭州 450000

早孕期血栓前狀態是導致復發性流產的主要原因之一,中醫將早孕期血栓前狀態所致的流產稱為早孕期血瘀流產,目前臨床常用抗凝藥物,如阿司匹林、低分子肝素等進行治療,有一定療效,但長期使用這類藥物可能會引發過敏、血小板減少、出血等諸多不良反應[1-3]。研究顯示,成功妊娠需要受精卵在母體子宮內順利著床、分化及發育成熟,子宮內膜容受性指母體子宮內膜對胚胎的接受能力,與著床過程關系密切[4-5]。子宮動脈血流阻力升高與復發性流產的發生關系密切,若子宮動脈血流阻力增高,胎盤間血流灌注量減少,發生微循環障礙,將導致子宮內膜容受性降低,最終導致流產[6]。赤芍內酯苷是毛茛科植物芍藥或川赤芍的主要藥效成分,具有活血通脈、抗血小板凝集作用[7]。本研究探究赤芍內酯苷對早孕期血瘀流產大鼠子宮內膜血流狀態與容受性的影響,并分析機制,以期為臨床防治早孕期血瘀流產提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

小動物SHINOVA 型西門子彩色多普勒超聲診斷儀(上海麥本醫療科技有限公司);OptimaTMXPN型超速離心機(貝克曼庫爾特生物科技有限公司)。

1.2 試藥

赤芍內酯苷(質量分數≥98%,規格20 mg,上海韻泰信息科技有限公司);兔抗鼠白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF),同源框基因A10(homebox A10 gene,HOXA10),黏蛋白1(mucin 1,MUC1),血管生成素-1(human angiopoietin 1,Ang-1),內皮細胞TEK 酪氨酸激酶2(recombinant TEK Tyrosine kinase endothelial 2,Tie2),β-肌動蛋 白(β-actin)多克隆抗體,山羊抗兔HRP 二抗,均購自上海鈺博生物科技有限公司。

1.3 動物

150只健康成年SPF級大鼠(8周齡),體質量為180～240 g,平均(210±24) g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號[SCXK(京)2016-0008]。

2 方法

2.1 動物分組

100只健康成年SPF級雌性大鼠、50只雄性大鼠適應性飼養7 d后,按照雌雄2∶1合籠交配,次日用無菌棉簽給雌鼠做陰道涂片并進行鏡檢,發現有大量精子視為妊娠成功,為妊娠第1天,記錄體質量。選取符合要求的50只孕鼠隨機分為5組,即對照組、模型組及赤芍內酯苷低、中、高劑量組,每組10只。對照組不造模,其余4組均造模。

2.2 早孕期血瘀流產大鼠模型建立

從妊娠第1天起,大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素0.9 mg·kg-1,每日1次,至妊娠第11天(對照組同時間皮下注射等量生理鹽水),并于妊娠第8天早上9:00開始(著床時間5～6 d)灌胃給予大鼠米非司酮溶液3.75 mg·kg-1·d-1(對照組同時間灌胃給予等量生理鹽水),同時于陰道內置入棉球,次日取出棉球觀察棉球染血情況,若染血說明模型建立成功[8]。

2.3 給藥方式

赤芍內酯苷低、中、高劑量組從大鼠妊娠第1天起,按照人與大鼠體表面積換算法計算赤芍內酯苷臨床給藥劑量,按照臨床給藥劑量的2、4、8倍量,即50、100、200 mg·kg-1·d-1[9]給藥,下午5:00灌胃給藥,持續至妊娠第11天;模型組及對照組同時間給予等量生理鹽水灌胃,期間動物自由飲食、飲水,觀察大鼠一般情況。

2.4 子宮動脈血流參數測定

各組大鼠于灌胃結束后,禁食24 h,腹腔注射30 mg·kg-1戊巴比妥鈉將大鼠麻醉,仰臥位,腹部備皮,用小動物西門子彩色多普勒超聲診斷儀經腹檢測子宮內膜動脈血流,檢測并計算孕鼠子宮內膜動脈血流參數血管阻力指數(resistance index,RI)、搏動指數(pulsatility index,PI)。

2.5 標本采集及解剖學觀察

子宮內膜動脈血流參數檢測完成后,于解剖臺上剖開大鼠腹腔,取出完整子宮組織,快速剝離周邊脂肪組織,用生理鹽水清洗干凈后,肉眼觀察子宮外觀形態、胚胎大小、完整性等,記錄胚胎著床點數、正常胚胎數,計算流產數和流產率。將子宮組織保存于液氮中。流產數=著床點數-正常胚胎數。流產率=(流產數÷著床點數)×100%。

2.6 Western blot檢測蛋白表達水平

各組剝離胎盤后,取部分子宮組織,剪碎制備勻漿,加入RIPA 液置于冰上裂解,孵育20 min,以10 000 r·min-1離心10 min(離心半徑均為8 cm),取上清,測定蛋白總量并取20 μg與等量上樣緩沖液混勻,沸水浴變性,進行電泳、轉膜,以0.05 mg·mL-1脫脂奶粉封閉2 h,用TBST清洗,加入一抗LIF、Ang-1、Tie-2、β-actin,稀釋比均為1∶500,4 ℃孵育過夜,用TBST洗滌,加入山羊抗兔二抗(1∶1 000),37 ℃孵育1.5 h,顯影、定影,計算各蛋白的相對表達量。

2.7 統計學方法

用SPSS 22.0軟件處理數據,符合正態分布的計量資料均以()表示,多組間比較用單因素方差分析,進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況比較

對照組大鼠自妊娠第1天至第11天,精神狀態良好,皮毛光亮,體質量正常增長;模型組大鼠精神慵懶,體質量增長緩慢,于妊娠第8天給予米非司酮后部分大鼠體質量呈下降趨勢,陰道出血量較多,有妊娠物排出;赤芍內酯苷低、中、高劑量組大鼠精神狀態不佳,體質量增長緩慢,陰道出血量較少,未見妊娠物排出,且上述變化呈劑量依賴性。

3.2 各組大鼠流產率比較

與對照組比較,模型組大鼠流產率升高(P＜0.05);與模型組比較,赤芍內酯苷低、中、高劑量組大鼠流產率降低(P＜0.05),呈劑量依賴性。結果見表1。

表1 各組大鼠的流產率比較 (,n=10)Tab.1 Comparison of abortion rate of rats in each group (,n=10)

表1 各組大鼠的流產率比較 (,n=10)Tab.1 Comparison of abortion rate of rats in each group (,n=10)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與赤芍內酯苷低劑量組比較,cP＜0.05;與赤芍內酯苷中劑量組比較,dP＜0.05。

3.3 各組大鼠子宮內膜血流動力學參數比較

與對照組比較,模型組大鼠子宮內膜血流動力學參數RI、PI水平均升高(P＜0.05);與模型組比較,赤芍內酯苷低、中、高劑量組大鼠子宮內膜血流動力學參數RI、PI水平均降低(P＜0.05),呈劑量依賴性。結果見表2。

表2 各組大鼠子宮內膜血流動力學參數比較 (,n=10)Tab.2 Comparison of endometrial hemodynamic parameters of rats in each group (,n=10)

表2 各組大鼠子宮內膜血流動力學參數比較 (,n=10)Tab.2 Comparison of endometrial hemodynamic parameters of rats in each group (,n=10)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與赤芍內酯苷低劑量組比較,cP＜0.05;與赤芍內酯苷中劑量組比較,dP＜0.05。

3.4 子宮內膜組織LIF、HOXA10、MUC-1蛋白表達水平比較

與對照組比較,模型組大鼠子宮內膜LIF、HOXA10蛋白的表達水平降低,MUC-1蛋白的表達水平升高(P＜0.05);與模型組比較,赤芍內酯苷低、中、高劑量組大鼠子宮內膜LIF、HOXA10蛋白的表達水平升高,MUC-1蛋白的表達水平降低(P＜0.05),且呈劑量依賴性。結果見圖1、表3。

圖1 Western blot 檢測各組大鼠子宮內膜組織LIF、HOXA10、MUC-1蛋白的表達水平Fig.1 Western blot detection of protein expression of LIF,HOXA10 and MUC-1 in endometrial tissue of rats in each group

表3 各組大鼠子宮內膜組織LIF、HOXA10、MUC-1蛋白表達水平比較 (,n=10)Tab.3 Comparison of LIF,HOXA10 and MUC-1 protein expression in endometrium of rats in each group (,n=10)

表3 各組大鼠子宮內膜組織LIF、HOXA10、MUC-1蛋白表達水平比較 (,n=10)Tab.3 Comparison of LIF,HOXA10 and MUC-1 protein expression in endometrium of rats in each group (,n=10)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與赤芍內酯苷低劑量組比較,cP＜0.05;與赤芍內酯苷中劑量組比較,dP＜0.05。

3.5 各組大鼠子宮內膜組織Ang、Tie-2 蛋白表達水平比較

與對照組比較,模型組大鼠子宮內膜組織Ang、Tie-2蛋白的表達水平均降低(P＜0.05);與模型組比較,赤芍內酯苷低、中、高劑量組大鼠子宮內膜組織Ang、Tie-2蛋白的表達水平均升高(P＜0.05),且呈劑量依賴性。結果見圖2、表4。

表4 各組大鼠子宮內膜組織Ang-1、Tie-2 蛋白表達水平比較 (,n=10)Tab.4 Comparison of Ang-1 and Tie-2 protein expression in endometrium of rats in each group (,n=10)

表4 各組大鼠子宮內膜組織Ang-1、Tie-2 蛋白表達水平比較 (,n=10)Tab.4 Comparison of Ang-1 and Tie-2 protein expression in endometrium of rats in each group (,n=10)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與赤芍內酯苷低劑量組比較,cP＜0.05;與赤芍內酯苷中劑量組比較,dP＜0.05。

圖2 Western blot檢測各組大鼠子宮內膜組織Ang-1、Tie-2蛋白的表達水平Fig.2 Western blot detection of the expression of Ang-1 and Tie-2 proteins in the endometrial tissue of rats in each group

4 討論

流產是指妊娠≤28周、胎兒體質量＜1 kg而終止妊娠,其中自然流產是指自然狀態下發生的流產,復發性流產是指與同一性伴侶連續發生≥3次的自然流產,而中醫所說的早孕期血瘀流產是指早孕期血栓前狀態所致的復發性流產[10-11],給育齡期女性身心健康及家庭幸福帶來嚴重影響。

中醫學認為,血瘀癥與機體血液流變學改變及微循環障礙有關,其病因機制主要有寒邪、郁怒、氣虛及痰濕等[12]。赤芍內酯苷是毛茛科植物芍藥或川赤芍干燥根的單萜苷類成分,現代藥理研究結果表明,其具有抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化、抗氧化等藥理活性,具有散瘀止痛、抗血小板聚集的作用[13]。樂娜等[14]研究顯示,赤芍內酯苷具有改善急性血瘀癥大鼠血液流變學及保護血管內皮功能的作用。賈敏等[15]研究顯示,赤芍內酯苷對接受不同收縮刺激的大鼠腸系膜上動脈血管有較強的舒張作用。研究顯示,子宮動脈供血不足與自然流產關系密切,子宮螺旋動脈重鑄障礙、血流阻力增高使子宮和胎盤間血流灌注不足,最終導致流產[16]。血流動力學參數RI、PI反映血流行進時遇到的阻力大小,RI、PI值越高,說明血流阻力越大[17]。子宮內膜是胚胎種植、吸取營養進而繼續生長發育的關鍵組織,內膜容受性是指內膜胚胎順利著床的能力,對成功妊娠具有重要作用[18]。LIF是一種介導胚泡著床的主要細胞因子,與胚泡著床關系密切,是子宮內膜容受性的關鍵標志因子之一[19]。王原媛等[20]研究顯示,原發性不孕癥組患者子宮內膜組織中LIF 蛋白表達缺失可能是導致不孕癥發病的關鍵因素。HOXA10是同源框基因家族成員之一,是子宮內膜容受性標志性轉錄調控因子,能夠調控子宮內膜增殖、分化及容受性的建立等過程,對胚胎種植及發育發揮重要作用[21]。MUC-1是抗黏附因子家族成員之一,研究證實其對胚胎的植入有阻礙作用,在子宮容受性建立過程中其水平下調有助于胚胎順利著床[22]。劉凱麗等[23]研究顯示,提高子宮腔內HOXA10 的表達水平能夠增大子宮內膜容受性,對子宮內膜異位癥起到一定治療作用。目前有關赤芍內酯苷對早孕期血瘀流產大鼠子宮內膜血流狀態及子宮容受性影響的報道較少。本研究結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠精神慵懶,體質量增長緩慢,于妊娠第8天給予米非司酮后部分大鼠體質量呈下降趨勢,陰道出血量較多,有妊娠物排出;而赤芍內酯苷低、中、高劑量組大鼠精神狀態不佳,體質量增長緩慢,陰道出血量較少,未見妊娠物排出,且上述變化呈劑量依賴性。表明赤芍內酯苷可能對大鼠血瘀流產具有一定防治作用。與對照組比較,模型組大鼠子宮內膜血流動力學參數RI、PI及MUC-1 蛋白的表達水平均升高,子宮內膜LIF、HOXA10蛋白的表達水平均降低。用赤芍內酯苷干預后,大鼠子宮內膜血流動力學參數RI、PI及MUC-1 蛋白的表達水平均降低,子宮內膜LIF、HOXA10蛋白的表達水平均升高,且呈劑量依賴性,表明赤芍內酯苷可能增加早孕期血瘀流產大鼠子宮內膜血流灌注阻力,降低血管床灌注阻力,改善子宮內膜血流狀態及容受性。

Ang-1是一種由周皮細胞和星形膠質細胞分泌的促血管生成因子,能夠與其特異性受體Tie-2受體結合形成Ang-1/Tie-2軸,參與新生血管生成進而促進血管成熟[24]。梁杰等[25]研究顯示,提高血清中Ang-1的質量濃度及子宮組織中Tie-2 的表達水平能夠促進不完全流產早孕大鼠子宮血管新生。本研究結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠子宮內膜組織Ang-1、Tie-2蛋白的表達水平均降低。經赤芍內酯苷干預后,大鼠子宮內膜組織Ang-1、Tie-2蛋白的表達水平均呈劑量依賴性升高,表明赤芍內酯苷能增加早孕期血瘀流產大鼠子宮內膜血流灌注阻力,降低血管床灌注阻力,改善子宮內膜血流狀態及容受性,可能與上調Ang-1、Tie-2蛋白的表達水平并促進子宮內膜微血管形成有關。

綜上所述,赤芍內酯苷能夠改善早孕期血瘀流產大鼠子宮內膜血流狀態及容受性,該作用可能是通過調控Ang/Tie-2 軸實現的。但本研究未能明確Ang/Tie-2軸在早孕期血瘀流產大鼠子宮內膜血流灌注阻力減少及容受性降低中的具體調控機制,后期應深入研究。