異鼠李素對子宮腺肌病小鼠子宮的作用

唐 靜 ,侯俊芳 ,郭 艷 ,李永海

1.開封市人民醫院婦科,開封 475002;2.開封市人民醫院檢驗科,開封 475002;3.新鄉醫學院干細胞與轉化醫學研究中心,新鄉 453000

子宮腺肌病(adenomyosis,AM)好發于30～50歲的經產婦,且發病率呈逐年上升趨勢,臨床表現為痛經、月經量過大、子宮不規則出血及不孕等[1]。研究表明,AM 的發生與子宮內膜的腺體、基質具有侵襲性密切相關[2],上皮間質轉化及細胞凋亡學說備受關注。異鼠李素(isorhamnetin,Iso)屬黃酮類化合物,提取自沙棘、銀杏等的葉、花、果實,具有降血脂、降血壓、抗炎、抗病毒及抗癌等作用,有研究發現其可通過抑制腫瘤細胞上皮間質轉化過程,誘導腫瘤細胞凋亡[3]。本研究通過構建AM 小鼠模型,觀察Iso對其子宮異位內膜侵襲性與子宮內膜細胞凋亡的影響,并探討可能的機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HM325型輪轉式石蠟切片機(德國美康公司);CX23型光學顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);Glite UV 凝膠成像系統(江蘇偉禾生物科技有限公司)。

1.2 試藥

異鼠李素(上海西格生物科技有限公司);干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)ELISA 試劑盒均購自上海廣銳生物科技有限公司;Tunel細胞凋亡原位檢測試劑盒(美國Abcam 公司);兔抗小鼠P53-273H、上皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)、p-EGFR、轉錄信號轉導子與轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、p-STAT3 一 抗,均購自美國Assay Designs公司。

1.3 動物

SPF級未孕ICR 雌鼠60 只,8 周齡,體質量為(32±3) g,ICR雄鼠25只,8周齡,體質量為(40±4) g。均購自上海砥石生物科技有限公司,生產許可證號SCXK(滬)2021-0003。

2 方法

2.1 構建AM 模型

用異體垂體移植術構建AM 模型[4]。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉雌鼠,分離腹部皮膚層與皮下肌層,游離子宮,確認膀胱下子宮分叉位置。處死同周齡ICR雄鼠,開顱,取出垂體組織,分成2份,分別與少量生理鹽水混合后,經套管針將垂體懸濁液0.5 mL推注至雌鼠右側宮腔,同時退出內芯與針頭,將子宮放回腹腔中,常規預防感染,關腹。

2.2 分組及干預

從60只雌性未孕ICR 小鼠中隨機抽取10只作為對照組,其余50 只構建AM 模型。構建模型后3個月從建模小鼠中隨機抽取10只分離異位組織,經HE染色觀察證實造模成功,其余40只隨機分為AM組,Iso低、中和高劑量組,每組10只。Iso低、中和高劑量組用質量濃度5 g·L-1Iso+羧甲基纖維素鈉混懸液1 mL灌胃,劑量分別為25、50、100 mg·kg-1[5],對照組、AM 組用等體積質量濃度5 g·L-1羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。每日1次,連續干預2個月。

2.3 檢測血清IFN-γ、IL-4水平

末次干預后次日,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠,心臟采血0.8 mL,室溫靜置后以3 000 r·min-1離心分離血清。用ELISA 檢測血清IFN-γ、IL-4水平,按照試劑盒說明書中的步驟操作,測定490 nm處的吸光度,根據標準曲線計算血清IFN-γ、IL-4水平。

2.4 組織取材

血液采集完成后,頸椎脫臼處死小鼠,開腹剖取子宮,取子宮在位內膜置于質量濃度40 g·L-1的多聚甲醛中固定48 h,用自來水將固定液沖洗干凈,用酒精梯度脫水,依次用二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明、浸蠟包埋,用切片機切成厚4 μm 的切片用于Tunel染色;取子宮異位內膜分為2份,一份同法切片用于HE 染色,一份保存于液氮中用于蛋白表達水平的檢測。

2.5 Tunel染色法檢測子宮內膜細胞凋亡率

取子宮在位內膜切片,脫蠟水洗,加Tunel反應混合液,37 ℃濕盒孵育1 h,用PBS沖洗,加堿性磷酸酶抗體,37 ℃孵育0.5 h,用PBS沖洗,加2滴堿性磷酸酯酶底物BCIP/NBT,室溫孵育20 min,用PBS沖洗,用蘇木素復染,脫水干燥,封片。陽性標準為顯微鏡下觀察到細胞核被染成棕色或棕黑色。每張切片任選5個不相鄰視野,以平均每1 000 個細胞中Tunel陽性細胞所占百分比為凋亡率,求均值。凋亡率=(陽性細胞數÷細胞總數)×100%。

2.6 HE染色法觀察子宮異位內膜侵襲性

取異位內膜切片,常規脫蠟,用自來水沖洗,用蘇木精染液染色,用自來水沖洗,用鹽酸酒精沖洗3 s,再用自來水沖洗,用Scott藍化液反藍,用自來水沖洗,用伊紅染液染色,經常規脫水、透明,用中性樹膠封片,于光鏡下觀察子宮異位內膜侵襲性。根據AM 5級標準分級方式觀察子宮內膜侵襲性:正常子宮為0分;內膜間質向肌肉內層侵入為1分;內膜間質及腺體向肌肉內層侵入為2分;內膜組織向內外肌層交界位置侵入為3分;內膜腺體囊性增生,并可觀察到漿膜下結節為4分。

2.7 免疫印跡法檢測子宮內膜組織相關蛋白表達量

取保存于液氮中的子宮異位內膜組織,加入PBS勻漿,用RIPA 細胞裂解液裂解,提取總蛋白,離心取上清,用BCA 試劑盒進行定量檢測。取50 μg待測蛋白,混合5倍體積上樣緩沖液,沸水浴10 min,離心、電泳、轉至PVDF 膜,加入質量濃度50 g·L-1脫脂奶粉,置于搖床中(室溫)封閉2 h,洗滌后加入兔抗小鼠 P53-273H、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3一抗(1∶500),4 ℃孵育過夜,加入山羊抗兔IgG 二抗(1∶2 000),常溫孵育2 h,洗滌后加入ELC發光液,暗室曝光,用凝膠成像系統掃描并進行分析。蛋白的相對表達量=待測蛋白條帶的灰度值÷GADPH 條帶的灰度值。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 血清IFN-γ、IL-4水平比較

與對照組比較,AM 組血清IFN-γ水平降低,IL-4水平升高(P＜0.05);與AM 組比較,Iso低劑量組血清IFN-γ水平升高,IL-4水平降低(P＜0.05);與Iso低劑量組比較,Iso中劑量組血清IFN-γ水平升高,IL-4水平降低(P＜0.05);與Iso中劑量組比較,Iso高劑量組血清IFN-γ水平升高,IL-4水平降低(P＜0.05)。結果見表1。

表1 各組血清IFN-γ、IL-4水平比較 (n=10,)Tab.1 Comparison of serum IFN-γ and IL-4 levels in each group (n=10,)

表1 各組血清IFN-γ、IL-4水平比較 (n=10,)Tab.1 Comparison of serum IFN-γ and IL-4 levels in each group (n=10,)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與AM 組比較,bP＜0.05;與Iso低劑量組比較,cP＜0.05;與Iso中劑量組比較,dP＜0.05。

3.2 子宮內膜細胞凋亡率比較

與對照組比較,AM 組子宮內膜細胞凋亡率降低(P＜0.05);與AM 組比較,Iso低劑量組子宮內膜細胞凋亡率升高(P＜0.05);與Iso低劑量組比較,Iso中劑量組子宮內膜細胞凋亡率升高(P＜0.05);與Iso中劑量組比較,Iso高劑量組子宮內膜細胞凋亡率升高(P＜0.05)。結果見表2、圖1。

表2 各組子宮內膜細胞凋亡率比較 (n=10,)Tab.2 Comparison of apoptosis rate of endometrial cells in each group (n=10,)

表2 各組子宮內膜細胞凋亡率比較 (n=10,)Tab.2 Comparison of apoptosis rate of endometrial cells in each group (n=10,)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與AM 組比較,bP＜0.05;與Iso低劑量組比較,cP＜0.05;與Iso中劑量組比較,dP＜0.05。

圖1 Tunel染色檢測子宮內膜細胞凋亡情況 (×400)Fig.1 Endometrial cell apoptosis detected by Tunel staining (×400)

3.3 子宮異位內膜侵襲性比較

與AM 組比較,Iso低劑量組子宮異位內膜侵襲性評分降低(P＜0.05)。

與Iso低劑量組比較,Iso中劑量組子宮異位內膜侵襲性評分降低(P＜0.05)。

與Iso中劑量組比較,Iso高劑量組子宮異位內膜侵襲性評分降低(P＜0.05)。

結果見表3、圖2。

圖2 HE染色檢測子宮異位內膜侵襲性 (×200)Fig.2 HE staining to detect the invasiveness of ectopic endometrium (×200)

表3 各組異位內膜侵襲性比較 (n=10,)Tab.3 Comparison of ectopic endometrium invasiveness in each group (n=10,)

表3 各組異位內膜侵襲性比較 (n=10,)Tab.3 Comparison of ectopic endometrium invasiveness in each group (n=10,)

注:與AM 組比較,aP＜0.05;與Iso低劑量組比較,bP＜0.05;與Iso中劑量組比較,cP＜0.05。

3.4 子宮內膜組織中P53-273H 蛋白表達量,p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3的比較

與對照組比較,AM 組P53-273H 蛋白的表達量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3升高(P＜0.05);與AM 組比較,Iso低劑量組P53-273H 蛋白的表達量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3降低(P＜0.05);與Iso低劑量組比較,Iso中劑量組P53-273H 蛋白表達量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3降低(P＜0.05);與Iso中劑量組比較,Iso高劑量組P53-273H 蛋白的表達量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3 降低(P＜0.05)。結果見表4、圖3。

圖3 免疫印跡法檢測子宮內膜組織中P53-273H、p-EGFR、EGFR、p-STAT3、STAT3蛋白的表達量Fig.3 Expression of P53-273H,p-EGFR,EGFR,p-STAT3,STAT3in endometrial tissue by Western blot

表4 大鼠子宮內膜組織中P53-273H 蛋白表達量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3的比較 (n=10,)Tab.4 Comparison of P53-273H protein expression,p-EGFR/EGFR and p-STAT3/STAT3 in rat endometrium(n=10,)

表4 大鼠子宮內膜組織中P53-273H 蛋白表達量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3的比較 (n=10,)Tab.4 Comparison of P53-273H protein expression,p-EGFR/EGFR and p-STAT3/STAT3 in rat endometrium(n=10,)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與AM 組比較,bP＜0.05;與Iso低劑量組比較,cP＜0.05;與Iso中劑量組比較,dP＜0.05。

4 討論

AM 是一種常見的婦科良性疾病,通常認為其病因與子宮內膜黏膜下層缺失、基底層在刺激下向深層及平滑肌束間侵襲、影響間質細胞與上皮細胞功能有關,伴有浸潤、血管增殖、種植及黏連周圍組織等腫瘤特性[6-7]。目前AM 保守治療藥物易引起雌激素水平降低,用藥時間及范圍限制較大,且停藥后容易復發[8]。因此,探究AM 異位內膜侵襲性及子宮內膜細胞凋亡的可能機制,研究相對安全的中藥單體對該病的治療十分必要。

IFN-γ是輔助T1樣細胞、自然殺傷細胞被激活后釋放的單糖蛋白,可間接活化巨噬細胞、中性粒細胞,增強其吞噬能力及抗病毒能力,是機體重要的免疫調控因子[9]。

IL-4是Th2細胞標志性細胞因子,研究表明其在AM 患者外周血及異位子宮內膜組織中的表達水平明顯升高,表明AM 伴有局部或全身的Th2型免疫應答系統活化[10]。子宮內膜組織維持正常結構與功能的關鍵在于內膜細胞發生自發性凋亡,AM 患者內膜細胞凋亡異常導致子宮基底層防御功能及內膜內環境被破壞,內膜組織穿透基底層侵入子宮肌層并發生失控性增長[11-12]。

Iso是一種廣泛存在于自然界中的天然甲基化黃酮類化合物,以往關于其的研究多集中在抗腫瘤、改善糖代謝等方面,而AM 以子宮內膜向肌層浸潤性生長為主要病理表現,增殖特性與惡性腫瘤具有相似性[13-15]。本研究結果顯示,Iso可提高AM 小鼠血清IFN-γ水平、子宮內膜細胞凋亡率,降低IL-4水平、異位內膜侵襲性評分,提示Iso可改善AM 免疫功能,促進子宮內膜細胞凋亡,并降低異位內膜侵襲性。

p53是機體中重要的凋亡調節因子,突變型p53(P53-273H)在細胞周期中的作用與野生型p53 相反,其對細胞生長的抑制作用減弱,且對細胞過度增殖具有促進作用[16-17]。EGFR 主要分布于上皮來源細胞的細胞膜表面,其高表達可降低細胞間的黏附性,促進其移向細胞質中,從而促進上皮間質轉化,引發侵襲、遷移等生物學行為。AM 子宮內膜組織的上皮及腺體中均有EGFR 的表達,且其表達量顯著高于在正常及子宮在位內膜中的表達量[18]。AM 中突變型p53(P53-273H)的表達水平明顯升高,并通過上調EGFR促進STAT3磷酸化,導致病灶細胞異常生長,形成異位內膜[19]。本研究結果發現,AM 組P53-273H 蛋白表達量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3均高于對照組,經Iso干預后有所降低,且表現為劑量依賴性,提示Iso對AM 的治療作用可能通過抑制p53/EGFR/STAT3信號通路來實現[20]。

綜上所述,Iso可降低AM 小鼠子宮異位內膜侵襲性,促進子宮內膜細胞發生凋亡,推測其作用機制與抑制p53/EGFR/STAT3信號通路有關。