小檗堿對侵襲性肺曲霉病大鼠肺損傷的保護作用

韓俊壘,邊紅芝,胡建平

河南省胸科醫院呼吸與危重癥一病區,鄭州 450000

侵襲性真菌感染是指由各種真菌誘發的侵襲性感染。侵襲性真菌感染以侵襲性肺部真菌感染為主,以曲霉菌感染最常見,可引起氣道黏膜及肺部的炎癥等[1]。曲霉菌廣泛存在于自然環境中,屬于條件致病菌,常寄生于宿主呼吸道,在其免疫力低下時致病,是免疫缺陷、危重癥等高危人群死亡的主要原因[2]。小檗堿是從傳統中藥黃連中提取的異喹啉類生物堿。LIANG Y 等[3]的研究表明,小檗堿可改善脂多糖誘導的急性肺損傷,KALMARZI R N 等[4]證明小檗堿具有抗炎、調節免疫等作用。侵襲性肺曲霉病的主要病理表現為肺部炎癥,且患者往往免疫力低下,故本研究通過動物實驗分析小檗堿治療侵襲性肺曲霉病的作用及機制,為研發治療侵襲性肺曲霉病的新藥奠定實驗基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FlexiVent動物肺功能儀(加拿大SCIREQ 公司);164-5050型電泳儀(美國Biorad公司)。

1.2 試藥

注射用環磷酰胺(規格:0.2 g,國藥準字H20023036,江蘇恒瑞醫藥股份有限公司);小檗堿(質量分數為98%,武漢卡諾斯科技有限公司);兩性霉素B(規格:25 mg·支-1,國藥準字H13020284,華北制藥股份有限公司);大鼠干擾素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)、白細胞介素-4(interleukin 4,IL-4)、酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒均購自上海素爾生物科技有限公司;兔抗大鼠T 細胞轉錄因子(T-box expressed in T-cells,T-bet),GATA 結合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA-3),GAPDH 一抗,均購自美國Abcam 公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3 菌株

煙曲霉菌株購自寧波明舟生物科技有限公司。

1.4 動物

SPF級雄性SD大鼠60只,7周齡,體質量為260～270 g,購自北京斯貝福生物技術有限公司,生產許可證號SCXK(京)2019-0010。實驗開展前適應性飼養1周,單籠飼養,室溫為24 ℃～26 ℃,相對濕度為40%～60%,自然光照,自由攝食、飲水。本實驗操作符合一般動物倫理學實驗原則。

2 方法

2.1 煙曲霉菌孢子懸液的制備

煙曲霉菌孢子接種在PDA 培養基中,37 ℃培養5 d,清洗培養基后,收集菌液過濾,在血細胞計數板上計數,調整孢子懸液密度為1×108個·mL-1,保存于4 ℃,備用。

2.2 造模、分組和干預

50只大鼠建立侵襲性肺曲霉病大鼠模型[5]:腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,將其固定在操作臺上,頭部抬高45°,經氣管插管注入煙曲霉菌孢子懸液100 μL,保持大鼠直立3 min;接種煙曲霉菌孢子前5、1 d及接種后3、7 d,每日腹腔注射1次注射用環磷酰胺,劑量依次為75、60、50、40 mg·kg-1,誘導形成免疫抑制狀態。剩余10只大鼠設為健康組,用等體積生理鹽水代替煙曲霉菌孢子懸液與環磷酰胺,其余操作同上。接種煙曲霉菌3 d后取血,用ELISA 檢測血清半乳甘露聚糖(galactomannan,GM),GM≥0.8表示造模成功。排除實驗過程中死亡、GM 未達標的大鼠,共有40只大鼠造模成功,隨機分為模型對照組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組和陽性對照組。接種后3 d給藥干預:小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組分別灌胃100、200 mg·kg-1·d-1小檗堿,陽性對照組腹腔注射1.575 mg·kg-1·d-1兩性霉素B,模型對照組與健康組用等體積生理鹽水灌胃,連續干預5 d。干預期間死亡大鼠按數量另選補齊。

2.3 檢測大鼠肺功能參數

用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,于頸部正中取切口,暴露氣管,取倒“T”切口插管,用手術線系緊插管。將大鼠放入體描箱,連接呼吸機,用Anires2005軟件導出大鼠肺容積變換、靜息通氣量。

2.4 ELISA檢測大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4含量

大鼠完成肺功能檢查后,氣管插管結扎左肺,用生理鹽水經氣管套管灌注右肺組織,回抽3次獲得肺泡灌洗液,在4 ℃以1 000 r·min-1離心10 min,離心半徑為10 cm,取上清。按照IFN-γ、IL-4 ELISA 試劑盒說明書操作,用酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度,計算大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4的含量。

2.5 HE染色觀察大鼠肺功能病理學

用頸椎脫臼法處死大鼠,沿血管與氣管走向切取10 mm 厚的小塊,取病灶明顯組織分為2份,一份先置于液氮中冷凍,再置于-80 ℃中保存,待測;一份用質量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定,常規脫水、透明、包埋后,制成5 μm 厚的切片,進行HE 染色,常規脫蠟至水,吹干,用蘇木素染色7 min,用鹽酸酒精分色,反藍30 s,用伊紅染色3 min,常規脫水、透明、封片。于顯微鏡下觀察各組大鼠肺部病理學。

2.6 胸腺指數及脾臟指數檢測

處死大鼠后,立即解剖取胸腺、脾臟,用生理鹽水洗凈,用濾紙吸干水分,稱質量,計算胸腺、脾臟指數。胸腺指數(mg·g-1)=胸腺質量(mg)÷大鼠體質量(g)。脾臟指數(mg·g-1)=脾臟質量(mg)÷大鼠體質量(g)。

2.7 RT-PCR 檢測肺組織T-bet、GATA-3 mRNA的表達水平

取肺組織0.1 g,用Trizol試劑提取總RNA,用核酸定量儀定量后取RNA 逆轉錄合成cDAN 1 μg,進行RT-PCR 檢測,引物序列見表1。擴增程序:42 ℃ 5min,95 ℃ 10 s,95 ℃ 5 s,57 ℃ 31 s,40個循環。進行瓊脂糖電泳,用凝膠成像系統掃描,用Quantity One V4.4軟件進行定量分析,用2-△△Ct法計算大鼠肺組織中T-bet、GATA-3 mRNA 的相對表達量。

表1 RT-PCR 的引物序列Tab.1 The primer sequences of RT-PCR

2.8 Western blot檢測大鼠肺組織中T-bet、GATA-3蛋白的表達水平

取肺組織0.1 g,加蛋白裂解液,在4 ℃以10 000 r·min-1離心15 min,離心半徑為10 cm,取上清,提取總蛋白。用BCA 法測定蛋白濃度,加相應體積loading buffer緩沖液,沸水浴變性10 min,取總蛋白樣品100 μg進行SDS-PAGE 電泳分離,濕法轉膜,用質量濃度為0.05 g·mL-1的脫脂奶粉封閉。加兔抗大鼠T-bet、GATA-3、GAPDH 一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過夜,洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h,洗膜,加入ECL,顯色,用Gel-pro Application軟件分析目的條帶的灰度值。

2.9 統計學方法

用SPSS 26.0 軟件對數據進行分析,肺功能指標、IFN-γ、IL-4含量、胸腺指數、脾臟指數和T-bet、GATA-3 mRNA 與蛋白的表達水平等計量資料均符合正態分布,且方差齊,以()表示,進行單因素方差分析與LSD-t比較。檢驗標準α=0.05。

3 結果

3.1 大鼠肺功能指標

與健康組比較,模型對照組大鼠肺容積變換和靜息通氣量減小(P＜0.05);與模型對照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽性對照組肺容積變換和靜息通氣量增大(P＜0.05);與小檗堿低劑量組比較,小檗堿高劑量組、陽性對照組肺容積變換和靜息通氣量增大(P＜0.05);與小檗堿高劑量組比較,陽性對照組肺容積變換和靜息通氣量增大(P＜0.05)。結果見表2。

表2 各組大鼠肺功能指標比較 (n=10,)Tab.2 Comparison of rat lung function indexes (n=10,)

表2 各組大鼠肺功能指標比較 (n=10,)Tab.2 Comparison of rat lung function indexes (n=10,)

注:與健康組比較,*P＜0.05;與模型對照組比較,&P＜0.05;與小檗堿低劑量組比較,#P ＜0.05;與小檗堿高劑量組比較,△P＜0.05。

3.2 大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4的含量

與健康組比較,模型對照組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ的含量降低,IL-4的含量增多(P＜0.05);與模型對照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽性對照組IFN-γ的含量增多,IL-4 的含量降低(P＜0.05);與小檗堿低劑量組比較,小檗堿高劑量組、陽性對照組IFN-γ的含量增多,IL-4的含量降低(P＜0.05);與小檗堿高劑量組比較,陽性對照組IFN-γ的含量增多,IL-4的含量降低(P＜0.05)。結果見表3。

表3 大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4 含量的比較 (n=10,)Tab.3 Contents of IFN-γ and IL-4 in rat alveolar lavage fluid(n=10,)

表3 大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4 含量的比較 (n=10,)Tab.3 Contents of IFN-γ and IL-4 in rat alveolar lavage fluid(n=10,)

注:與健康組比較,*P＜0.05;與模型對照組比較,&P＜0.05;與小檗堿低劑量組比較,#P ＜0.05;與小檗堿高劑量組比較,△P＜0.05。

3.3 大鼠肺部病理學

健康組大鼠肺部病理正常。與健康組比較,模型對照組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽性對照組大鼠肺部病理均可見煙曲霉菌菌絲,呈絲狀分布,粗細均勻,有呈45°的分支,大部分菌絲有間隔,呈珊瑚狀排列。模型對照組煙曲霉菌感染彌漫全肺,菌絲分布密集,向四周擴散,血管出血嚴重,可見大量炎性細胞浸潤;與模型對照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽性對照組的感染灶局限于肺部邊緣,菌絲呈散在分布,感染部分有炎性細胞浸潤,出血量較少。結果見圖1。

圖1 各組大鼠肺部病理學 (HE染色,×400)Fig.1 Pathology of the lungs of rats in each group (HE staining,×400)

3.4 大鼠胸腺指數與脾臟指數

與健康組比較,模型對照組大鼠胸腺指數與脾臟指數降低(P＜0.05);與模型對照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽性對照組胸腺指數與脾臟指數升高(P＜0.05);與小檗堿低劑量組比較,小檗堿高劑量組、陽性對照組胸腺指數與脾臟指數升高(P＜0.05);與小檗堿高劑量組比較,陽性對照組胸腺指數與脾臟指數升高(P＜0.05)。結果見表4。

表4 各組大鼠胸腺指數與脾臟指數的比較 (n=10,)Tab.4 Rat thymus index and spleen index (n=10,)

表4 各組大鼠胸腺指數與脾臟指數的比較 (n=10,)Tab.4 Rat thymus index and spleen index (n=10,)

注:與健康組比較,*P＜0.05;與模型對照組比較,&P＜0.05;與小檗堿低劑量組比較,#P ＜0.05;與小檗堿高劑量組比較,△P＜0.05。

3.5 肺組織T-bet、GATA-3 mRNA 的表達水平

與健康組比較,模型對照組大鼠肺組織T-bet mRNA 的相對表達量降低,GATA-3 mRNA 的相對表達量升高(P＜0.05);與模型對照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽性對照組T-bet mRNA 的相對表達量升高,GATA-3 mRNA 的相對表達量降低(P＜0.05);與小檗堿低劑量組比較,小檗堿高劑量組、陽性對照組T-bet mRNA 的相對表達量升高,GATA-3 mRNA的相對表達量降低(P＜0.05);與小檗堿高劑量組比較,陽性對照組T-bet mRNA 的相對表達量升高,GATA-3 mRNA 的相對表達量降低(P＜0.05)。結果見表5。

表5 大鼠肺組織T-bet、GATA-3 mRNA 相對表達量的比較(n=10,)Tab.5 Comparison of relative expression of T-bet and GATA-3 mRNA in rat lung tissue (n=10,)

表5 大鼠肺組織T-bet、GATA-3 mRNA 相對表達量的比較(n=10,)Tab.5 Comparison of relative expression of T-bet and GATA-3 mRNA in rat lung tissue (n=10,)

注:與健康組比較,*P＜0.05;與模型對照組比較,&P＜0.05;與小檗堿低劑量組比較,#P＜0.05。

3.6 大鼠肺組織T-bet、GATA-3蛋白的表達水平

與健康組比較,模型對照組大鼠肺組織T-bet蛋白的相對表達量降低,GATA-3 蛋白的相對表達量升高(P＜0.05);與模型對照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽性對照組T-bet蛋白的相對表達量升高,GATA-3蛋白的相對表達量降低(P＜0.05);與小檗堿低劑量組比較,小檗堿高劑量組、陽性對照組T-bet蛋白的相對表達量升高,GATA-3蛋白的相對表達量降低(P＜0.05);與小檗堿高劑量組比較,陽性對照組T-bet蛋白的相對表達量升高,GATA-3蛋白的相對表達量降低(P＜0.05)。結果見表6、圖2。

圖2 Western blot檢測各組大鼠肺組織中T-bet、GATA-3的蛋白表達量Fig.2 Western blot detection of T-bet and GATA-3 protein expression in lung tissue of rats in each group

表6 大鼠肺組織T-bet、GATA-3 蛋白相對表達量的比較(n=10,)Tab.6 Comparison of relative expression of T-bet and GATA-3 protein in rat lung tissue (n=10,)

表6 大鼠肺組織T-bet、GATA-3 蛋白相對表達量的比較(n=10,)Tab.6 Comparison of relative expression of T-bet and GATA-3 protein in rat lung tissue (n=10,)

注:與健康組比較,*P＜0.05;與模型對照組比較,&P＜0.05;與小檗堿低劑量組比較,#P ＜0.05;與小檗堿高劑量組比較,△P＜0.05。

4 討論

曲霉菌屬作為侵襲性肺曲霉病的致病菌,在日常生活環境中比較常見,孢子易隨呼吸進入呼吸道,故深部煙曲霉菌感染主要發生于肺部,患者多病情危重,死亡率高[6]。小檗堿是重要生物堿,Tew X N 等[7]的研究表明,小檗堿可控制慢性呼吸道炎癥性疾病炎癥中的免疫軸。目前關于小檗堿在治療呼吸系統炎癥疾病潛力方面的研究尚不多見。

煙曲霉菌孢子釋放的特殊物質可損傷氣道上皮細胞,減弱纖毛運動,影響肺功能[8]。本研究中,與健康組比較,模型對照組大鼠肺容積變換和靜息通氣量減小,提示煙曲霉菌損傷了大鼠的肺功能。小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組的大鼠肺容積變換和靜息通氣量大于模型對照組,提示小檗堿可減輕大鼠肺功能損傷,初步驗證了小檗堿的作用。HE 染色結果顯示,造模大鼠肺部病理均可見煙曲霉菌菌絲,但與模型對照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組大鼠腹部的菌絲散在分布,炎性細胞浸潤與血管出血均減少,進一步表明小檗堿可減輕由煙曲霉菌造成的肺部損傷,改善肺部病理學,這可能與其抗炎、調節免疫的作用有關。Th1/Th2細胞失衡,即Th2型反應模式是侵襲性肺曲霉病發病的重要環節。IL-4 作為Th2細胞特征性細胞因子,可調節Th0細胞向Th2細胞分化,對誘導Th2細胞生成至關重要[9];TFN-γ由Th1細胞分泌,可抑制IL-4 誘導B 細胞IgG 和IgE的產生[10-11]。IL-4和TFN-γ的比例反映Th1/Th2細胞平衡,Th1細胞具有調節免疫抗感染功能,Th2具有調節變態反應功能,一般情況下二者互相消長、約束,一旦平衡失調則可致病[12]。本研究的結果顯示,與模型對照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組大鼠肺泡灌洗液IL-4水平降低、TFN-γ水平升高,表明小檗堿可解除Th2 細胞因子占優勢的Th1/Th2細胞失衡狀態,恢復Th1/Th2細胞誘導的免疫功能平衡。胸腺指數和脾臟指數為評估免疫功能的常用指標,本研究中,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組大鼠胸腺指數和脾臟指數高于模型對照組,再次驗證小檗堿具有調節免疫的作用。

Th1/Th2細胞分化受多因素影響,轉錄因子對其的調節作用至關重要[13]。T-bet、GATA-3分別為Th1和Th2細胞的特異性轉錄因子,可促進Th0細胞向Th1類或Th2類細胞分化[14-15]。T-bet是新發現的轉錄因子,在胸腺、脾臟、肺等少數組織中表達,可促進Th1細胞優勢應答,調節Th1細胞分泌多種抑炎因子,抑制肺部炎癥[16-17]。GATA-3 是鋅指蛋白GATA 家族成員,僅表達于Th2細胞,可促進分化中或已分化的Th0細胞合成Th2細胞因子,促進Th2優勢應答,從而調控釋放多種促炎因子,加重肺部炎癥[18-20]。本研究中,模型對照組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、健康組大鼠肺部T-bet mRNA與蛋白的表達水平依次升高,GATA-3 mRNA 與蛋白的表達水平依次下降,與大鼠肺泡灌洗液TFN-γ、IL-4水平變化的趨勢一致,表明小檗堿可能通過上調大鼠肺部T-bet蛋白、下調GATA-3 蛋白發揮治療作用。

綜上所述,小檗堿可能通過調節T-bet/GATA-3信號通路保護侵襲性肺曲霉病大鼠肺功能、恢復Th1/Th2細胞平衡。本研究為侵襲性肺曲霉病的治療提供了新選擇,但本研究仍有不足之處,如小檗堿可能存在其他作用途徑等,其保護肺功能更深層次的機制尚未可知,有待進一步研究。