卡維地洛納米結構脂質載體的制備與大鼠腸道吸收研究

王希文,汪 洋

武漢市紅十字會醫院藥劑科,武漢 430015

卡維地洛(carvedilol,CAR)為α1受體和β受體雙重阻滯劑,通過擴張血管、減少外周阻力發揮降低血壓的作用,臨床用于高血壓、充血性心力衰竭和心絞痛的治療[1]。CAR 屬于生物制藥分類系統Ⅱ類藥物[2],其較差的溶解度限制了機體對藥物的吸收、利用,其口服生物利用度僅為20%～25%[3]。納米結構脂質載體(nanostructured lipid carriers,NLCs)具有有效控制藥物釋放、避免儲存過程中藥物泄漏、提高難溶性藥物的口服生物利用度[4]、適合大規模工業化生產等優勢[5]。本研究采用高壓均質法制備CAR-loaded-NLCs,并通過大鼠原位灌注模型考察其在大鼠腸道中的吸收特征[6],為CAR 的二次開發、利用提供新的研究思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

FSH-2A 型可調高速勻漿機(常州市金壇友聯儀器研究所);APV-1000實驗型高壓均質機(上海順儀實驗設備有限公司);DF-101Q 型系列集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司);JEM-F200型場發射透射電子顯微鏡(日本電子株式會社);Malvern Zetasizer Nano ZS90型納米粒徑電位分析儀(英國Malvern公司)。

1.2 試藥

卡維地洛(浙江華海藥業股份有限公司);雙硬脂酸甘油酯(precirol ATO 5)、單硬脂酸甘油酯(glycerin monostearate,GMS)、山崳酸甘油酯(compritol 888 ATO)、丙二醇二癸酸酯(labrafac PG)、肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate,IPM)和12-羥基硬脂酸聚氧乙烯酯(solutol HS-15)均由嘉法獅上海貿易有限公司惠贈;中鏈三酰甘油(medium chain triglycerides,MCT)、油酸乙酯(ethyl oleate,EO)、油酸(oelic acid,OA)均由國藥集團化學試劑有限公司惠贈;泊洛沙姆188(poloxamer 188)和吐溫80(Tween 80)、D-α-維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate,TPGS)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL)和氫化聚氧乙烯蓖麻油(ethoxylated hydrogenated castor oil,RH 40)均由巴斯夫有限公司惠贈;其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 CAR-loaded-NLCs的制備工藝

用高壓均質法制備CAR-loaded-NLCs[7]。將處方量的固體脂質與液體脂質混合后在85 ℃下加熱熔化;再將處方量的CAR 溶解到5 mL 體積分數95%的乙醇中,攪拌至藥物完全溶解,并加入上述油相中,85 ℃下揮干乙醇,形成油溶液,備用;取處方量的表面活性劑加入一定量的熱水(85 ℃)中,攪拌至完全溶解,形成水溶液,備用;將水溶液加入油溶液中,并以20 000 r·min-1高速剪切10 min,得到乳白色渾濁液;再將上述溶液轉移到高壓均質機中,在壓力為800 MPa 的條件下均質5 次,得到CAR-loaded-NLCs,將樣品置于4 ℃儲存,備用。

2.2 粒徑分布和Zeta電位測定

用納米粒徑電位分析儀檢測CAR-loaded-NLCs的粒徑分布和Zeta電位,樣品用超純水稀釋50倍在25 ℃下測定,每組樣品測定3次,取平均值。

2.3 包封率測定

通過超濾離心法測定CAR-loaded-NLCs的包封率[8]。取CAR-loaded-NLCs 1 mL置于25 mL量瓶中,加入甲醇5 mL 并在水浴超聲中破乳,取上述溶液經0.22 μm 濾膜過濾,進樣檢測藥物含量(C總);量取CAR-loaded-NLCs加入超濾離心管中,以4 000 r·min-1離心20 min,取超濾液經0.22 μm 濾膜過濾,進樣檢測藥物含量(C游離),計算包封率。

包封率=[1-C游離/(C總×25)]×100%

2.4 處方工藝研究

2.4.1 固體脂質篩選 鑒于脂質的種類會對NLCs的穩定性、載藥能力、藥物釋放產生一定的影響[9],因此對脂質進行篩選。分別選擇precirol ATO 5、GMS和compritol 888 ATO 作為固體脂質制備CARloaded-NLCs,考察其對CAR-loaded-NLCs粒徑分布、PDI、Zeta電位和包封率的影響。結果見表1。由表1可見,用precirol ATO 5作為固體脂質制備的CARloaded-NLCs粒徑最小,包封率最高。因此,本研究選用Precirol ATO 5作為固體脂質。

表1 不同固體脂質對粒徑分布、PDI、Zeta電位和包封率的影響 (n=3,)Tab.1 Influence of different solid lipids on particle size,PDI,Zeta potential and EE (n=3,)

表1 不同固體脂質對粒徑分布、PDI、Zeta電位和包封率的影響 (n=3,)Tab.1 Influence of different solid lipids on particle size,PDI,Zeta potential and EE (n=3,)

2.4.2 液體脂質篩選 液體脂質對NLCs的載藥能力以及形成晶格缺陷結構發揮關鍵作用[10],需要考察CAR 在不同液體脂質中的表觀溶解度。將藥物分散到不同種類的液體脂質中,并在(37±0.5) ℃搖床中以200 r·min-1振搖48 h,以3 000 r·min-1離心30 min,并用0.22 μm 濾膜過濾上清液。取上清液經適當稀釋后進樣檢測藥物含量。結果見表2。由表2可見,CAR 在IPM 中的表觀溶解度為(34.5±1.4)mg·g-1,明顯高于OA 的(5.6±0.7) mg·g-1,EO的(12.6±0.5) mg·g-1,MCT的(22.9±1.1) mg·g-1,以及labrafac PG 的(26.2±1.3) mg·g-1。因此,本研究選擇將IPM 作為液體脂質。

表2 CAR 在不同液體脂質中的表觀溶解度 (n=3,)Tab.2 Apparent solubility of CAR in various liquid lipids(n=3,)

表2 CAR 在不同液體脂質中的表觀溶解度 (n=3,)Tab.2 Apparent solubility of CAR in various liquid lipids(n=3,)

2.4.3 表面活性劑種類篩選 合適的表面活性劑能夠有效減小NLCs的粒徑分布。表面活性劑覆蓋在疏水性納米粒表面,降低納米粒與水性介質之間的表面張力,防止顆粒聚集或生長,提高其物理穩定性[11]。分別選擇poloxamer 188、Tween 80、TPGS、solutol HS-15、ELP和RH 40 6種非離子表面活性劑,考察不同表面活性劑對CAR-loaded-NLCs粒徑分布和包封率的影響。結果見表3。由表3可見,用TPGS制備的CAR-loaded-NLCs為外觀呈半透明、泛淡藍色乳光的溶液,其粒徑最小,包封率較高。因此,本研究選擇將TPGS作為表面活性劑。

表3 不同表面活性劑對外觀、粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.3 Influence of different surfactants on appearance,particle size distribution and encapsulation efficiency (n=3,)

表3 不同表面活性劑對外觀、粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.3 Influence of different surfactants on appearance,particle size distribution and encapsulation efficiency (n=3,)

2.4.4 固體脂質與液體脂質比例篩選 選擇precirol ATO 5和IPM 的質量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1制備不同批次的CAR-loaded-NLCs,考察precirol ATO 5和IPM 的質量比對粒徑分布和包封率的影響。結果見表4。由表4可見,當precirolATO 5和IPM 的質量比為2∶1時,未觀察到脂質分層現象,以該比例制備的CAR-loaded-NLCs粒徑較小,包封率最高。因此,本研究選擇以precirol ATO 5和IPM的質量比為2∶1制備CAR-loaded-NLCs。

表4 固體脂質與液體脂質比對粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.4 Influence of different ratios of solid lipid and liquid lipid on the particle size and EE (n=3,)

表4 固體脂質與液體脂質比對粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.4 Influence of different ratios of solid lipid and liquid lipid on the particle size and EE (n=3,)

2.4.5 藥物與脂質質量比篩選 選擇藥物和脂質的質量比分別為0.01∶1、0.02∶1、0.03∶1、0.04∶1和0.05∶1制備不同批次的CAR-loaded-NLCs,考察其對粒徑分布和包封率的影響。結果見表5。由表5可見,藥物和脂質質量比對粒徑影響不明顯,但是會影響藥物的包封率,隨著藥物和脂質質量比的增大,包封率出現先上升后下降的趨勢,當藥物和脂質質量比為0.02∶1時,包封率最高。因此,本研究選擇藥物和脂質質量的最佳比例為0.02∶1。

表5 藥物和脂質質量比對粒徑分布和包封率的影響 (n=3,)Tab.5 Influence of various ratios of drug and lipid on the particle size and EE (n=3,)

表5 藥物和脂質質量比對粒徑分布和包封率的影響 (n=3,)Tab.5 Influence of various ratios of drug and lipid on the particle size and EE (n=3,)

2.4.6 表面活性劑質量濃度篩選 選擇TPGS質量濃度分別為10、20、30、40、50 mg·mL-1制備不同批次的CAR-loaded-NLCs,考察其對粒徑分布和包封率的影響。結果見表6。由表6可見,使用較低質量濃度表面活性劑制備的CAR-loaded-NLCs穩定性較差,放置后會出現脂質分層現象,隨著表面活性劑質量濃度的增加,CAR-loaded-NLCs的粒徑逐漸降低,包封率逐漸增大,但是當TPGS的質量濃度增大到50 mg·mL-1時,自身會形成膠束[12],不利于體系的穩定。因此,本研究選擇以質量濃度為40 mg·mL-1的TPGS制備CAR-loaded-NLCs。

表6 不同TPGS 質量濃度對粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.6 Influence of different TPGS concentrations on particle size and EE (n=3,)

表6 不同TPGS 質量濃度對粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.6 Influence of different TPGS concentrations on particle size and EE (n=3,)

2.5 CAR-loaded-NLCs質量評價

2.5.1 粒徑分布、Zeta電位測定 按照篩選確定的處方連續制備3 批CAR-loaded-NLCs,其外觀均為半透明、泛淡藍色乳光的溶液,未觀察到不溶物、團聚體或藥物沉淀;經測定平均粒徑為(91.4±3.6) nm,PDI為(0.167±0.004),表明小而均勻的粒徑分布可提高藥物的溶解度,并促進藥物吸收[13];測得Zeta電位為(-28.7±0.7) mV,表明粒子間具有足夠大的靜電斥力,可確保系統的穩定,避免聚集[14]。另外,3批CAR-loaded-NLCs包封率的平均值為(91.8%±1.7%),包封率較高。

2.5.2 微觀形態觀察 取經稀釋的少量CAR-loaded-NLCs均勻鋪展到formvar銅網上,用質量濃度為10 mg·mL-1的磷鎢酸負染色10 min,晾干后用TEM 在200 kV 的加速電壓下觀察CAR-loaded-NLCs的微觀形貌。結果見圖1。由圖1可見,CAR-loaded-NLCs呈球形,分布均勻,大部分CAR-loaded-NLCs的粒徑在60～120 nm 范圍內,與激光粒度儀測定的結果基本一致。

圖1 CAR-loaded-NLCs的透射電鏡照片Fig.1 Transmission electron micrograph of CAR-loaded-NLCs

2.5.3 體外釋放研究 為了評估CAR-loaded-NLCs在人體生理環境中的藥物釋放特性,選擇pH1.2鹽酸溶液、pH4.5醋酸鹽溶液和pH6.8磷酸鹽溶液作為釋放介質進行研究[15]。取CAR-loaded-NLCs 5 mL(CAR 含量為10 mg)加入處理好的透析袋(截留相對分子質量12 000～14 000)中,系緊兩端,浸入到釋放介質中,3種釋放介質溶液的體積均為245 mL,溫度為(37±0.5) ℃,磁力攪拌速度為100 r·min-1。在預定的時間間隔取5 mL 釋放介質,經過濾和稀釋,進樣檢測藥物含量。結果見表7。

表7 CAR-loaded-NLCs在不同介質中的體外藥物釋放度(n=3,)Tab.7 In vitro drug release of CAR-loaded-NLCs in different media (n=3,)

表7 CAR-loaded-NLCs在不同介質中的體外藥物釋放度(n=3,)Tab.7 In vitro drug release of CAR-loaded-NLCs in different media (n=3,)

結果顯示,CAR-loaded-NLCs在pH 1.2、pH4.5和pH6.8介質溶液中的藥物釋放度均表現為雙相釋放模式,在前2 h 藥物釋放為突釋(游離的和吸附在NLCs表面的藥物釋放);之后表現為緩釋(包裹在NLCs內部的藥物釋放)[16]。

2.6 大鼠腸道原位灌注研究

取SD 大鼠,腹腔注射水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉,固定在實驗臺上,沿大鼠腹部中線剪開腹腔(長3～4 cm),分離出小腸和結腸。在小腸前端和結腸末端各切一個小口,插入直徑為0.3 cm 的玻璃管后扎緊,將37 ℃生理鹽水推入腸段清洗腸內容物,再注入空氣排凈生理鹽水,將小腸前端和結腸末端的玻璃管連接到蠕動泵硅膠管的兩端,形成回路。移取CARloaded-NLCs加入到含有酚紅的Krebs-Ringer緩沖液(CAR 質量濃度為250 μg·mL-1,酚紅質量濃度為50 μg·mL-1)中,體積為100 mL,作為供試液;另稱取CAR 原料藥加入含有酚紅的Krebs-Ringer緩沖液(CAR 質量濃度為250 μg·mL-1,酚紅質量濃度為50 μg·mL-1)中,體積為100 mL,分散形成CAR混懸液,作為對照溶液。將連接在小腸和結腸兩端的硅膠管置入供試液中,開啟蠕動泵,灌注速度為1 mL·min-1,分別在0、0.5、1、1.5、2、3、4 h時間點取出5 mL 供試液(同時補加Krebs-Ringer緩沖液,其含有質量濃度為50 μg·mL-1的酚紅),經過濾、稀釋后檢測藥物含量(Ci),同時用紫外分光光度法測定550 nm 處的酚紅質量濃度,根據酚紅質量濃度計算供試液剩余體積(Vi)。灌注實驗結束后剪下腸段,測量其長度(L)和內徑(r),計算腸段內面積(S=πr2L)。根據每段時間間隔內CAR 質量濃度(Ci)與供試液體積(Vi)計算出供試液中CAR 剩余量(Qi),以lnQi對取樣時間t進行線性回歸,其斜率為CAR-loaded-NLCs的吸收速率常數(Ka),CAR-loaded-NLCs的表觀滲透系數(Papp)=Ka/S。同法進行對照溶液的灌注實驗,計算CAR 混懸液吸收速率常數(Ka)和表觀滲透系數(Papp)。結果見表8。

表8 CAR-loaded-NLCs和CAR 混懸液的吸收參數 (n=6,)Tab.8 Absorption parameters of CAR-loaded-NLCs and CAR suspensions (n=6,)

表8 CAR-loaded-NLCs和CAR 混懸液的吸收參數 (n=6,)Tab.8 Absorption parameters of CAR-loaded-NLCs and CAR suspensions (n=6,)

注:與CAR 混懸液比較,△P＜0.05。

與CAR 混懸液相比,CAR-loaded-NLCs在大鼠腸道中的Ka和Papp分別由(2.27±0.26)×10-3min-1和(4.16±0.31)×10-4cm·min-1增加到(6.84±0.67)×10-3min-1和(12.97±0.59)×10-4cm·min-1,均提高了近3倍。

3 討論

納米結構脂質載體的制備方法[17]包括乳化蒸發-低溫固化法、熱熔乳化-超聲法、溶劑擴散法、高壓均質法等,其中高壓均質法可減少有機溶劑的用量,制備的納米粒粒徑分布較均勻,已被公認可進行工業化生產放大[18],因此本研究用高壓均質法制備CARloaded-NLCs。

本研究比較了CAR-loaded-NLCs與CAR 混懸液在大鼠腸道的Ka和Papp,結果顯示,CAR-loaded-NLCs可顯著提高藥物的吸收速率和滲透性。這一方面是由于NLCs的粒徑極小,很容易吸附到腸道上皮細胞表面并通過靜態水層被小腸吸收;另一方面是由于NLCs的脂質成分與腸上皮細胞膜的組成具有一定的相似性,可增加與細胞膜的親和力,促進藥物的吸收或轉運[19]。