不同激素濃度和培養(yǎng)條件對礬根組培快繁體系的影響

劉 丹，王 容，吳海峰，陳天烺，方 萍，赫文韜，陳 煒 (浙江海豐生物科技股份有限公司，浙江紹興 312000)

礬根()為虎耳草科礬根屬，又名珊瑚鈴，多年生耐寒宿根草本花卉。礬根原產(chǎn)地為美洲中部，在-15 ℃ 時(shí)，雖葉片受凍枯死，根部仍存活，一旦地溫回升，照常萌芽。葉色有紫色、綠色、花葉、紅色等，葉基生，闊心型，花期4—10月，粉色小花鐘狀，花徑0.6～1.2 cm，復(fù)總狀花序。因其葉色豐富美麗，成為一種新優(yōu)地被彩葉植物，逐漸應(yīng)用于花壇、花境和花帶景觀配置中，為城市綠化增添了生機(jī)盎然的色彩。礬根品種繁多，部分品種可以播種繁殖，但礬根種子細(xì)小，出芽率低，且種子發(fā)芽慢且不整齊，有些品種通過葉插、分株和組培方式進(jìn)行無性繁殖，葉插方式受季節(jié)限制，繁殖系數(shù)低；因礬根生長點(diǎn)低，不易分株，分株繁殖取材困難，繁殖速度慢，很難獲得大量種苗，造成市場上礬根品種短缺供不應(yīng)求。組織培養(yǎng)繁殖方式可以縮短礬根的生長周期，在短期內(nèi)能夠獲得大量無菌組培苗。隨著礬根在園林綠化上的廣泛應(yīng)用，越來越多的礬根種苗供應(yīng)商興起，有關(guān)礬根的研究，特別是礬根組培快繁體系的報(bào)道越來越多。但不同培養(yǎng)條件對礬根組培苗生長周期的影響研究尚未見報(bào)道。筆者以礬根盆栽苗為試驗(yàn)材料，研究了光照、溫度等對組培苗生長的影響，以期建立高效的快繁組培體系，為大規(guī)模工廠化生產(chǎn)礬根種苗提供技術(shù)。

1 材料與方法

礬根盆栽，2021年3月4日購自浙江森里園藝有限公司，試驗(yàn)于浙江省紹興市柯橋區(qū)平水鎮(zhèn)浙江海豐花卉有限公司實(shí)驗(yàn)室開展。

初代培養(yǎng)。首先用手術(shù)刀剝除多余的葉片，切除根部，保留長度為2 cm左右的帶腋芽莖段。①用自來水流水沖洗外植體上的泥土，然后用洗衣粉水浸泡20 min，取出用自來水流水沖洗5 min；②多菌靈1 000倍液浸泡1 h，取出用自來水流水沖洗5 min；③將初次處理過的外植體置于超凈工作臺，用濃度為75%的乙醇溶液浸泡20 s，無菌水沖洗4次，期間用玻璃棒攪拌；然后用有效氯為5%的次氯酸鈉溶液處理，處理時(shí)間分別設(shè)置為4、7、10、13、16 min，共5個梯度，無菌水分別沖洗6次，期間用玻璃棒攪拌。④切除外植體接觸藥品的部位，每個莖段為1 cm左右，接種于含有誘導(dǎo)腋芽培養(yǎng)基的組培瓶中，每個組培瓶接種1個外植體，共100瓶。于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)5 d后定期觀察外植體生長情況，15 d后開始統(tǒng)計(jì)出芽率和污染率。出芽率=出芽數(shù)/接種數(shù)×100%，污染率=污染數(shù)/接種數(shù)×100%。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度22～25 ℃，光照強(qiáng)度為1 500 lx，光照時(shí)間為12 h/d。

不同濃度的6-BA和NAA激素組合對礬根芽增殖的影響。采用雙因素完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別設(shè)置激素6-BA濃度為0、0.2、0.4、0.6 mg/L，NAA濃度分別為0.01、0.03 mg/L，組成8個試驗(yàn)處理，MS為基本培養(yǎng)基，選擇2 cm生長健壯的無菌苗，切成帶芽莖段分別接種于含有增殖幼芽培養(yǎng)基的組培瓶內(nèi)，每瓶接種5個，每個處理20瓶，共160瓶。蔗糖濃度20 g/L，瓊脂5 g/L，pH為5.8。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度22～25 ℃，光照強(qiáng)度為1 500 lx，光照時(shí)間為12 h/d。培養(yǎng)30 d后觀察生長情況并統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)。芽增殖系數(shù)=芽增殖數(shù)/接種數(shù)×100%。

礬根無菌幼苗的生根培養(yǎng)。將高約1.0 cm的無菌幼苗，分別接種在含有不同NAA濃度的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行生根培養(yǎng)，1/2 MS為基本培養(yǎng)基，NAA濃度分別為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/L，共6個處理，每個處理接種10瓶，每瓶接種3株，所有處理均添加瓊脂5 g/L，蔗糖20 g/L，活性炭0.5 g/L，pH 5.8。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度22～25 ℃，光照強(qiáng)度1 500 lx，光照時(shí)間12 h/d。培養(yǎng)7 d后開始觀察無菌苗的生根情況，40 d后統(tǒng)計(jì)生根率。生根率=生根數(shù)/接種數(shù)×100%。

培養(yǎng)溫度對無菌苗生長情況的影響。將高0.5 cm左右的帶腋芽莖段和高1.0 cm左右的幼苗分別接種至前期篩選出的增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中，置于不同溫度的光照培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為20、22、24、26、28 ℃，光照強(qiáng)1 500 lx，光照時(shí)間為12 h/d，培養(yǎng)7 d后觀察生長情況，統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)和生根情況。

暗培養(yǎng)對無菌苗生長情況的影響。將高0.5 cm左右的帶腋芽莖段和高度1 cm左右的幼苗分別接種至前期篩選出的增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中，置于暗室中培養(yǎng)，與光照培養(yǎng)(光照強(qiáng)度為1 500 lx，光照時(shí)間為12 h/d)作對照，培養(yǎng)溫度為23 ℃，培養(yǎng)7 d后觀察生長情況，統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)和生根情況。

2 結(jié)果與分析

從表1可以看出，以帶腋芽莖段作為試驗(yàn)材料誘導(dǎo)幼芽，采用次氯酸鈉溶液對外植體進(jìn)行不同時(shí)間的處理，污染率和出芽率差異顯著。當(dāng)處理時(shí)間為10 min時(shí)，外植體的污染率最低，僅為27.38%，出芽率最高達(dá)94.86%。隨著次氯酸鈉處理時(shí)間的延長，外植體的生長情況越來越差，時(shí)間越長對外植體的損害程度越大，褐化程度越嚴(yán)重，生長受到抑制。處理③外植體的生長情況最好，且出芽率高，污染率低，是最適合外植體的處理時(shí)間(圖1A)。

表1 次氯酸鈉不同消毒時(shí)間對出芽率和污染率的影響Table 1 Effects of different disinfection times of sodium hypochlorite on germination rate and pollution rate

從表2可以看出，以幼芽為材料，采用不同濃度的6-BA和NAA組合對芽增殖的影響效果差異顯著。當(dāng)NAA濃度為0.02 mg/L 時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，增殖倍數(shù)越來越大。當(dāng)6-BA濃度為0.4 和0.6 mg/L時(shí)，隨著NAA濃度的增加，增殖倍數(shù)反而越來越小，由此推斷過高的激素水平并不利于植物的增殖。處理③中6-BA和NAA濃度分別為0.6和0.02 mg/L時(shí)，礬根芽的增殖倍數(shù)極顯著高于其他處理，達(dá)9.53倍，芽大而綠，生長狀態(tài)優(yōu)良(圖1B)。因此，MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.02 mg/L是礬根芽最佳的增殖培養(yǎng)基。

從表3可以看出，以高約1 cm的幼苗為試驗(yàn)材料，1/2 MS為基本培養(yǎng)基，不同濃度的NAA對無菌苗生根的影響差異顯著。隨著NAA濃度的提高，無菌苗的生根率不斷增加。處理⑤的生根率極顯著高于處理①、②、③、④，與處理⑥差異不顯著，生根率最高達(dá)100%，植株健壯，根系發(fā)達(dá)粗壯。處理⑤中每株的平均根數(shù)和平均根長均極顯著高于其他處理，平均根數(shù)最高有8～9條，平均根長達(dá)12～13 cm(圖1C)。因此，1/2MS+NAA 0.20 mg/L是礬根最佳的生根培養(yǎng)基。

表2 不同濃度的6-BA和NAA組合對礬根芽增殖的影響Table 2 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA hormone combination on the proliferation of alum roots and buds

表3 不同濃度的NAA對生根的影響Table 3 Effects of different concentrations of NAA on rooting

注：A.初代培養(yǎng)的幼芽；B.增殖狀態(tài)；C.生根培養(yǎng)狀態(tài) Note: A. Primary cultured buds; B. Proliferative state; C. Rooting culture state圖1 不同培養(yǎng)階段下礬根組培苗的生長狀態(tài)Fig.1 Growth state of alum root tissue culture seedlings at different culture stages

從表4可以看出，通過使用前期篩選出來的培養(yǎng)基，設(shè)置不同溫度的培養(yǎng)無菌苗，得出的試驗(yàn)結(jié)果差異顯著。隨著培養(yǎng)溫度的升高，芽的增殖倍數(shù)不斷提高，26 ℃時(shí)達(dá)到最高為9.5倍；溫度為28 ℃時(shí)，增殖倍數(shù)開始降低。芽的生長速度也隨著溫度的升高不斷加快，24 ℃時(shí)芽的高度最高為1.28 cm，26 ℃時(shí)芽的生長速度開始減緩，芽高逐漸變低，28 ℃時(shí)生長受到抑制，葉片邊緣棕紅色，與溫度過高有很大關(guān)系。礬根生根培養(yǎng)與芽增殖相同，在溫度為24和26 ℃時(shí)生長狀態(tài)最好，生根率最高達(dá)100%，苗高為3 cm左右。因此，礬根增殖和生根階段最佳的培養(yǎng)溫度為24和26 ℃。

表4 不同培養(yǎng)溫度對芽增殖和生根的影響Table 4 Effects of different culture temperatures on bud proliferation and rooting

從表5可以看出，使用最佳的培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度均為24 ℃，進(jìn)行光暗培養(yǎng)無菌苗對芽增殖和生根的影響差異顯著。光照培養(yǎng)時(shí)芽的增殖倍數(shù)和生根率均比暗培養(yǎng)高，分別為8.4倍和100%，苗較健壯；暗培養(yǎng)時(shí)芽和苗的高度均比光照培養(yǎng)高，分別為2.50和4.09 cm，且生長速度均比光照培養(yǎng)快，苗稍細(xì)弱，移至光照下培養(yǎng)可以恢復(fù)健壯(圖2A和B)。因此，在無菌苗芽增殖和生根培養(yǎng)時(shí)可以先進(jìn)行光照培養(yǎng)15 d，使其獲得高倍的芽數(shù)和根數(shù)；然后進(jìn)行暗培養(yǎng)10 d，使其快速生長；最后進(jìn)行光照培養(yǎng)，使其恢復(fù)健壯，增殖率和生根率更高，光暗交替培養(yǎng)大大縮短了生長周期(圖2C)。

表5 不同培養(yǎng)方式對芽增殖和生根的影響Table 5 Effects of different culture methods on bud proliferation and rooting

注：A.暗培養(yǎng)增殖苗；B.暗培養(yǎng)生根苗；C.暗培養(yǎng)后光照培養(yǎng)下恢復(fù)正常的組培苗 Note:A.Dark culture proliferating seedling; B. Dark cultivation rooting seedling; C. Restored normal tissue culture seedlings under light culture after dark culture圖2 暗培養(yǎng)后各生長階段組培苗的狀態(tài)Fig.2 Status of tissue culture seedlings at each growth stage after dark culture

待礬根組培苗長至約4 cm時(shí)，平均根數(shù)約5條，平均根長3 cm左右時(shí)將其移至大棚煉苗。在大棚內(nèi)首先擰松組培瓶蓋適應(yīng)1 d后，次日掀開瓶蓋，適應(yīng)4 d后將生根苗取出洗凈培養(yǎng)基(圖3A)，1 000倍液多菌靈浸泡30 min，種植在36孔穴盤中(圖3B)，基質(zhì)為蛭石、泥炭和椰糠1∶2∶1混合，溫度在20 ℃以上、26 ℃以下，在營養(yǎng)生長期每30 d需施肥2次，定期澆水。30 d后移至12 cm的花盆中繼續(xù)生長，成活率100%(圖3C)。

注：A.洗凈培養(yǎng)基的組培苗；B.組培苗穴盤種植的狀態(tài)；C.12 cm花盆定植的狀態(tài) Note:A. Tissue culture seedlings without medium;B.Hole plate planting of tissue culture seedlings;C.Colonization status in 12 cm flowerpot圖3 礬根組培苗基地?zé)捗鐮顟B(tài)Fig.3 Seedling refining state in alum root tissue culture seedling base

該試驗(yàn)以礬根帶腋芽莖段為材料，研究次氯酸鈉的不同處理時(shí)間對外植體的影響，結(jié)果表明，5%的次氯酸鈉處理10 min污染率最低，僅為27.38%，出芽率最高達(dá)94.86%，這與鄒清成等礬根葉片離體快繁及工廠化生產(chǎn)技術(shù)研究中2%的次氯酸鈉溶液滅菌10 min，污染率16%，出芽率74.67%的結(jié)論不同，可能與礬根的品種和次氯酸鈉的濃度不同有關(guān)。

以無菌幼芽為材料，研究不同濃度的6-BA和NAA組合對礬根芽增殖的影響，結(jié)果表明，MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.02 mg/L是礬根芽最佳的增殖培養(yǎng)基，增殖倍數(shù)為9.53倍，而李小東等礬根組培快繁中MS+6-BA 0.25 mg/L+NAA 0.025 mg/L是最適宜芽叢增殖的培養(yǎng)基，增殖倍數(shù)為4～5倍，增殖苗生長正常，比該研究的增殖倍數(shù)低。生根培養(yǎng)試驗(yàn)中，1/2MS+NAA 0.2 mg/L+活性炭0.5 g/L是礬根最佳的生根培養(yǎng)基，生根率最高達(dá)100%，平均根數(shù)8～9條，平均根長達(dá)12～13 cm，與束曉春等的最佳生根培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L IBA不同,但生根率98.05%，根數(shù)6.3條，根長14.35 cm 與該研究的結(jié)論接近。高燕等的基礎(chǔ)生根培養(yǎng)基1/2 MS與該研究一致。

溫度對礬根組培苗的增殖和生根均有顯著影響，在20～26 ℃時(shí)，芽的增殖倍數(shù)和生根率均隨著溫度的升高而提高，以24～26 ℃最佳，組培苗生長狀態(tài)最好,分別與鄭洪立等和劉雪蘭等研究的香蕉組培苗以25～28 ℃最佳和鐵皮石斛組培苗以25 ℃最佳的結(jié)果相似。

光對植物細(xì)胞、組織、器官的生長和分化有極其重要的作用，但也有研究表明，適當(dāng)?shù)陌蹬囵B(yǎng)能夠促進(jìn)愈傷組織、莖芽和根的分化。葉雯等在火焰南天竹莖段離體培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化中分別對火焰南天竹芽誘導(dǎo)、芽增殖和生根培養(yǎng)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，暗培養(yǎng)5 d，誘導(dǎo)率、增殖率和生根率均有顯著提高。李素華等在石楠生根培養(yǎng)前期暗培養(yǎng)8 d，可顯著提高石楠組培苗的生根率和生根數(shù)。該試驗(yàn)分別對礬根芽增殖和生根培養(yǎng)進(jìn)行了暗培養(yǎng)，與光照培養(yǎng)對比，苗的生長速度顯著加快，再次移至光照下培養(yǎng)，增殖倍數(shù)和生根率均有所提高，與前人的研究結(jié)果一致。該試驗(yàn)結(jié)果將為礬根組培快繁體系的研究提供數(shù)據(jù)支持，為規(guī)模化生產(chǎn)礬根種苗提供技術(shù)。