藤黃聯合卡培他濱治療腸癌肝轉移的活性研究

張 東，祖元剛，熊 彬，魏 亮，張思艷，姜守剛*

(1.東北林業大學，森林植物生態學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業大學化學化工與資源利用學院，黑龍江哈爾濱 150040)

腸癌(colorectal cancer，CRC)是目前發病率較高的惡性腫瘤之一，由于早期癥狀不明顯，大多數患者確診后多已處于晚期。腸癌患者術后易發生腫瘤轉移，且主要轉移部位為肝臟，在后續的治療過程中，化療成為主要手段。目前以卡培他濱為基礎的三聯藥物(卡培他濱+奧沙利鉑+亞葉酸)是腸癌肝轉移疾病治療時的一線藥物，但其毒副作用大，且易耐藥，一旦耐藥，患者預后極差，因此，急需發展新的高效低毒且不易耐藥的藥物組合。

藤黃是藤黃科植物藤黃[Hook.f.(clusi-aceae)]樹干分泌出的干燥樹脂，其主要成分是以藤黃酸為代表的呫噸酮類化合物，為治療腫毒的臨床用藥。有研究表明，藤黃作為一種中藥可能通過促使腸癌細胞發生G2/M、S期阻滯，調節BAX、Bcl-2和p53蛋白的表達，來達到抗腸癌效果。目前，隨著中醫藥的發展，我國多采用中西醫藥聯合的方法治療結直腸癌。基于藤黃治療腸癌具有高效低毒的優勢，該試驗探討了藤黃與卡培他濱聯合用藥對腸癌肝轉移的抑制作用。

1 材料與方法

儀器。FA1204B分析天平(濟南愛來寶儀器設備有限公司)；ST40R型離心機(上海實維實驗儀器技術有限公司)；CX43生物顯微鏡(南京瞭望光電技術有限公司)；QP-80型二氧化碳細胞培養箱(濟南好寶來醫療器材有限公司)；SW-CJ-3F型生物工作臺(上海滬凈醫療器械有限公司)；Zf11-01型動物飼養柜(東北林業大學植物藥工程研究中心設計監制)。

試材。藤黃(亳州仁益中藥材銷售有限公司)；卡培他濱(CAS號154361-50-9)、AAF固定液(50%)、烏來糖(CAS號 51-79-6)，上海源葉生物科技公司)；RPMI 1640培養基、青霉素-鏈霉素溶液、胰酶，HyClone公司； DMSO(碧云天生物技術公司)；優級胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；結腸癌CT26.WT細胞(北京協和醫院細胞中心)；清潔級BALB/c小鼠(哈爾濱醫科大學附屬二院動物中心)。

腸癌肝轉移模型的建立。將造模所用的BALB/c小鼠隨機分組，稱重并記錄。配制20%烏來糖溶液，以5 mL/kg的麻醉劑量麻醉小鼠。待小鼠進入麻醉狀態后，手術部位剃毛，將其放在超凈臺上。取對數生長期的CT26.WT細胞進行消化、離心，加入適量生理鹽水制備成單細胞懸液，用細胞計數板計數細胞，調整細胞濃度為1×10個/mL。采用脾臟種植法向小鼠脾臟內緩慢注入CT26.WT細胞懸液0.l mL，查看無出血后將小鼠脾臟納回，用可吸收縫合針線全層縫合、包扎，待小鼠經過麻醉時間并恢復意識后，常規飼養。

分組及給藥。將4～6周齡、體重20 g左右的雄性BALB/c小鼠隨機分為對照組(生理鹽水)、藤黃組、卡培他濱組、藤黃聯合卡培他濱組，每組6只。造模后第2天開始，對照組和給藥組全部采用灌胃的方式連續給藥7 d，藤黃組給藥劑量為20 mg/kg，卡培他濱組給藥劑量為60 mg/kg，聯用組藥物分別按上述劑量同時給藥。

健康狀況觀察。觀察造模前后小鼠的體重變化和生存情況，每3 d稱重一次，分析不同藥物對小鼠體重的影響，記錄小鼠的死亡時間，計算平均生存期，繪制生存曲線。

協同作用測定。待各組小鼠自然死亡后，解剖觀察肝臟表面及切面的轉移灶及腫瘤結節。由于轉移性腫瘤不易從肝臟剝離，稱重肝臟也可以間接反映腫瘤的重量，計算腫瘤抑制率，公式如下：抑瘤率=(對照組肝重-給藥組肝重)/(對照組肝重-正常組肝重)×100%。

金氏公式是被用來評價聯合用藥作用強度的公式，公式如下：

在該試驗中，、和分別表示藤黃組、卡培他濱組和藤黃聯合卡培他濱組對模型小鼠的腫瘤抑制率。當>1.15時，說明藤黃和卡培他濱聯用會產生協同作用，當0.85≤≤115時，說明藤黃和卡培他濱分別產生作用，當<0.85時，說明藤黃和卡培他濱聯用會產生拮抗作用。

病理學檢測 。給藥10 d后，每組隨機處死1只小鼠，解剖出完整肝臟并用生理鹽水清洗，觀察各組小鼠肝臟表面結腸癌轉移情況并拍照。用4%的多聚甲醛溶液固定取出的小鼠肝臟12 ～14 h，經過脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色、封片等一系列操作后，在顯微鏡下進行病理觀察和分析，判斷不同藥物對腸癌肝轉移的抑制情況。

2 結果與分析

造模后第1天，小鼠進食、進水量明顯減少，活動量也減小。術后第3天，小鼠的精神狀態開始逐漸恢復。待術后10 d左右小鼠又出現了攝食量減少的現象，并且小鼠腹部開始隆起。術后第15天左右，小鼠開始出現萎靡不振的精神狀態，行動緩慢且反應性降低，腹部隆起明顯。

建模后，每隔3 d測定并記錄小鼠的體重，結果如圖1所示。從圖1可以看出，各組小鼠的體重在造模后前3 d均出現了減輕的情況，其中藤黃組體重減輕最少。第3天起各組小鼠體重開始逐漸增加，但是給藥組小鼠體重的增長速度比對照組緩慢。卡培他濱組小鼠造模前后體重有所降低，而藤黃聯合卡培他濱組在造模期間體重變化不顯著，表明藤黃聯合卡培他濱組的毒副作用明顯比卡培他濱組的低。在術后第7天至術后第15天，各組小鼠的平均體重表現出一定的增長，這是因為造模小鼠腹部開始出現血性腹水、體重增加。

圖1 模型小鼠的體重變化Fig.1 Weight change in model mice

各組小鼠均采用SPSS 17.0軟件中Kaplan-Meier法進行生存期分析，結果如圖2所示。結果顯示，對照組、藤黃組、卡培他濱組、藤黃聯合卡培他濱組的平均生存期分別為(18.00±1.41)、(23.33±3.08)、(27.17±3.66)、(30.83±3.06) d。藤黃聯合卡培他濱組與其他各組平均生存期均有顯著差異(<0.05)。這表明藤黃聯合卡培他濱可以有效延長小鼠的生存期，有較好的抗結腸癌肝轉移作用。

圖2 模型小鼠的生存期曲線Fig.2 Survival curve of model mice

待模型小鼠自然死亡后解剖，取出完整肝臟，計算各組小鼠的平均肝重，得到給藥組的抑瘤率，結果如表1所示。藤黃聯合卡培他濱組的平均肝重較藤黃組和卡培他濱組小(< 0.01)。藤黃組、卡培他濱組、藤黃聯合卡培他濱組的腫瘤抑制率分別為31.03%、40.52%、63.79%，經過金氏公示測定，得到協同作用結果=1.08，說明藤黃與卡培他濱聯合用藥沒有產生明顯的協同作用，但與單一用藥相比抑制腸癌肝轉移的效果比較顯著。

表1 各組小鼠肝臟重量、抑瘤率Table 1 Liver weight and tumor inhibition rate of mice in each group

各組小鼠解剖后的肝臟標本結果如圖3所示，與正常小鼠對比，可以觀察到模型小鼠的肝臟中都分布了大小不等的灰白色腫瘤結節。對照組肝臟大部分被癌灶所浸潤，藤黃組、卡培他濱組的肝臟的腫瘤結節數量遠少于對照組，藤黃聯合卡培他濱組的肝臟表面僅存在離散的轉移結節，并且轉移結節數目相對來說較少于其他各組，這表明藤黃與卡培他濱聯用具有良好的抗腸癌肝轉移作用。

將各組模型小鼠解剖后，對其肝臟進行病理切片分析，結果如圖4所示。對照組癌細胞成團且數量較多，說明腫瘤細胞DNA復制劇烈，給藥組肝組織中癌細胞團數量呈現不同程度的減少且大小明顯減小，癌細胞較疏松，說明藥物在一定程度上抑制了腫瘤細胞的轉移，其中藤黃聯合卡培他濱組肝組織中腫瘤細胞的細胞核與正常肝細胞的細胞核大小相似，抑制腫瘤細胞DNA復制效果最好，即藤黃聯合卡培他濱組抗結腸癌肝轉移作用最明顯。

注：A.對照組；B.藤黃組；C.卡培他濱組；D.藤黃聯合卡培他濱組 Note:A.Control group;B.Gambogic group;C.Capecitabine group;D.Gamboge combined with Capecitabine group 圖3 模型小鼠肝臟標本Fig.3 Liver samples from model mice

該試驗通過BALB/c小鼠脾臟種植CT26.WT細胞建立結腸癌肝轉移模型，研究藤黃與卡培他濱聯用時對小鼠腸癌肝轉移的抑制作用。通過比較對照組和給藥組模型小鼠的體重變化、平均生存期、HE染色肝臟病理切片，發現藤黃與卡培他濱聯合使用時可以更好地抑制腫瘤細胞的生長和轉移，延長生存期。因此，當腸癌肝轉移患者使用卡培他濱幾個療程產生耐藥后，可以考慮將藤黃與卡培他濱聯用，這為治療腸癌肝轉移提供了新的聯合給藥方法，有望明顯延長腸癌肝轉移患者的生存期。

注：A.對照組；B.藤黃組；C.卡培他濱組；D.藤黃聯合卡培他濱組。圖中標有a區域的部分屬于正常肝細胞，標有b區域的部分屬于腫瘤細胞 Note:A.Control group;B.Gambogic group;C.Capecitabine group;D.Gamboge combined with Capecitabine group圖 4 模型小鼠HE染色肝臟病理切片Fig.4 HE-stained liver pathological sections of model mice