土壤有效養分和微生物特征對短期不同放牧強度的響應

高昌宇， 齊志遠， 鄭 慧， 陳璽洋， 秦加敏， 郝 杰，張乃莉， 王常慧,5*， 董寬虎*

(1. 山西農業大學草業學院， 山西 太谷 030801； 2. 山西右玉黃土高原草地生態系統定位觀測研究站， 山西 右玉 037200；3. 草地生態保護與鄉土草種質創新山西省重點實驗室， 山西 太谷 030801； 4. 北京林業大學森林培育與保護教育部重點實驗室， 北京 100083； 5. 中國科學院植物研究所植被與環境變化國家重點實驗室， 北京 100093)

放牧是天然草地的主要利用方式之一，不同的放牧強度通過家畜的采食和踐踏直接影響植被組成和土壤的養分狀況，適度放牧有利于草地的更新和健康，維持高的生物多樣性、微生物活性和地上生產力[1]。但是，大多數草地生態系統由于沒有實施科學的管理，處于過度放牧造成嚴重退化的狀態。過度放牧不僅改變草地土壤的物理結構，使得土壤容重升高，土壤通透性降低，更重要的是使得草地土壤有效養分流失，生物多樣性降低導致不同程度的退化或荒漠化等[2-4]。尤其在農牧交錯帶，受農業和牧業的雙重影響，草地屬于極度脆弱的生態系統。因此，研究不同放牧強度對農牧交錯帶草地生態系統結構與功能的影響，為該區域草地管理和可持續發展提供科學依據是非常必要的。

雖然大量的研究報道了放牧影響土壤有效養分，但是其中的機理并不清晰。土壤微生物參與土壤養分循環的各個過程，也是土壤可利用養分不可缺少的部分，微生物通過分解動植物殘體，參與生態系統的能量流動和物質循環[5-6]，對土壤養分循環產生直接的影響[7-8]。土壤微生物生物量表征土壤微生物的活性和土壤養分的有效性[9]，是表征土壤健康狀態的重要指標之一[10]。已有的研究也報道了放牧對草地土壤微生物的影響，鄔嘉華(2018)等[11]研究發現溫帶典型草原放牧對土壤真菌群落結構影響顯著，而且隨放牧強度的增加，真菌的豐度降低。Krone(2011)等[12]在半天然草原研究發現使用犁作為擾動源，翻土30 cm深會改變真菌群落組成。草地土壤有效養分庫容易受氣候變化和人為干擾的影響，因此存在顯著的季節動態變化。土壤可溶性有機碳、氮是維持微生物生命和活性的重要養分，是土壤可利用養分庫的重要組成部分[13-14]，土壤可溶性氮影響植被以及土壤氮儲量的變化[15-16]。放牧如何影響土壤有效養分庫以及影響的程度研究報道并不一致[17]，有促進[4,18]、抑制[19-20]和沒有[21]顯著影響。造成這些差異是因為草地類型、放牧家畜不同以及放牧強度和放牧持續時間不同。

目前，放牧對草地生態系統結構與功能影響的研究大部分集中于天然牧區草地。對于農牧交錯帶草地生態系統的放牧研究較少。本研究依托2016年在位于山西省右玉縣境內典型農牧交錯帶草地生態系統建立的放牧實驗平臺，研究放牧處理4年后整個生長季(5—9月)的草地土壤有效養分和微生物特征，包括土壤可溶性有機碳(Soil dissolved organic carbon,DOC)、土壤可溶性氮(Soil dissolved nitrogen,DN)、土壤微生物生物量碳(Soil microbial biomass carbon,MBC)、土壤微生物生物量氮(Soil microbial biomass nitrogen,MBN)和細菌、真菌豐度的季節變化規律，并且分析了它們之間的關系，揭示短期不同放牧強度處理對我國北方農牧交錯帶草地生態系統土壤有效養分和土壤微生物特征的影響，為我國農牧交錯區草地管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗樣地位于山西省朔州市右玉縣威遠鎮后所堡村(39°59′N，112°19′E)，海拔1 348 m。屬溫帶季風性氣候，四季分明，年均溫4.7℃，其中最低月(1月)均溫為-14.0℃，最高月(7月)均溫為20.5℃。無霜期為5月初至9月初，約120 d。全年太陽總輻射量約598 kJ·cm-2，年日照2 600～2 700 h；年平均降水量約435 mm，集中于6—9月[22-24]。土壤為栗鈣土，優勢種為賴草(Leymussecalinus(Georgi) Tzvel.)，其他伴生種有羊草(Leymuschinensis(Trin.) Tzvel.)、堿蒿(ArtemisiaanethifoliaWeb. ex Stechm.)、堿地風毛菊(Saussureajaponica(Thunb.) DC.)、蒲公英、(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)、鵝絨委陵菜(PotentillaanserinaL.)、車前(PlantagoasiaticaL.)等[22-23]。

2020年生長季(5—9月)總降水量為426.6 mm，主要集中在7月和8月，分別為226.2 mm和93.2 mm，生長季平均氣溫為16.4℃，7月最高，其均溫為19.2℃(圖1)。

圖1 2020年生長季(5—9月)日均溫和日降水量Fig.1 Average daily temperature and precipitation in the 2020 growing season (May-September)

1.2 試驗設計

放牧平臺建立于2016年，隸屬于山西右玉黃土高原草地生態系統國家定位觀測研究站，實驗采取隨機區組設計，設置不放牧(UG)、輕度放牧(LG，2.35羊單位·hm-2·生長季-1)、中度放牧(MG，4.80羊單位·hm-2·生長季-1)和重度放牧(HG，7.85羊單位·hm-2·生長季-1)4個放牧強度，每個放牧強度4個重復。試驗小區之間用鐵絲網圍欄分隔，小區面積0.2 hm2，每年的6月1日，按照不同放牧強度將體重和年齡一致的綿羊放置在處理小區，一直到9月30日生長季結束，放牧時間為4個月。

1.3 試驗測定指標及方法

在2020年5—10月的月初，使用直徑3 cm的土鉆取表層0～10 cm的土壤，每個放牧區用隨機取樣法取5個樣品，混合后過2 mm篩，除去粗根及石礫。空氣溫度和降雨量取自放牧小區附近的小型氣象站(HOBO U30-NRC，美國，Onset)。土壤溫度利用數字式地溫計(M-SP-E-17，北京)測定；土壤含水量利用TDR-300(Spectrum Technologies，Plainfield，USA)測定。采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法，測定DOC和DN，MBC和MBN，其中MBC和MBN分別為熏蒸浸提液與未熏蒸浸提液中碳氮含量的差值除以轉換系數0.45[25]、0.54[26]得到(總有機碳分析儀，Elementar vario，德國，TOC)。土壤DNA提取采用Fast DNA ? SPIN Kit for Soil(土壤基因組DNA提取試劑盒)，定量PCR儀器(博日LineGene9600plus型熒光定量PCR儀)測定細菌和真菌的豐富度。提取的DNA樣品保存在-80℃用于PCR擴增，其中PCR引物(PAGE純化)由生工生物工程有限公司提供，反應體系由5 μLEx Taq buffer,4 μLdNTP Mix,0.5 μLEx Taq,1 μLPrimer F,1 μLPrimer R,1 μLTemplate,12.5 μLddH2O組成，反應條件如表1所示。標準曲線通過10倍梯度稀釋構建好的各質粒獲得，16S基因的R2為0.9997，擴增效率為97.99%，ITS基因的R2為1.0000，擴增效率為100.99%。

表1 反應條件Table 1 Reaction conditions

1.4 數據分析

分別對DOC，DN，MBC，MBN和細菌、真菌的豐度進行單因素方差分析和多重比較(SPSS 22.0，LSD，P<0.05)。通過重復測量方差分析法，分析不同放牧強度下采樣時間對土壤TC，TN，DOC，DN，MBC，MBN,細菌和真菌豐度的影響，利用Origin 2021軟件作柱狀圖以及相關系數矩陣圖。

2 結果與分析

2.1 不同放牧強度對土壤溫度和土壤含水量的影響

土壤溫度和土壤濕度具有明顯的季節動態變化(圖2)，放牧提高了生長季的土壤溫度和土壤含水量。重度放牧的土壤溫度和含水量的生長季均值都顯著高于不放牧處理(圖2，P<0.05)。

圖2 2020年生長季(5—9月)放牧地土壤溫度和土壤濕度Fig.2 Soil temperature and soil moisture of grazing land during the 2020 growing season (May—September)注：UG為不放牧，LG為輕度放牧，MG為中度放牧，HG為重度放牧。不同小寫字母表示同一月份不同放牧強度之間差異顯著(P<0.05)Note:UG means no grazing,LG means light grazing,MG means moderate grazing,HG means heavy grazing. Different lowercase letters indicate the significant difference between different grazing intensities in the same month at the 0.05 level

2.2 不同放牧強度對土壤MBC，MBN含量及MBC∶MBN的影響

土壤MBC和MBN存在明顯的季節動態，并且變化趨勢一致(圖3)。在不放牧小區，土壤MBC在6月顯著高于7月(圖3，P<0.05)；MBN和MBC∶MBN在月份之間無顯著差異(圖3)。在輕度放牧處理下，土壤MBC∶MBN在6月顯著增加，在10月顯著降低(圖3，P<0.05)。在中度和重度放牧處理下，土壤MBC在6月顯著增加(圖3，P<0.05)；土壤MBN在7月顯著降低(圖3，P<0.05)。

同一月份土壤MBC，MBN和MBC∶MBN在不同放牧強度之間無顯著差異(圖3)，8月份土壤MBN在中度放牧處理顯著低于輕度和重度放牧處理(圖3，P<0.05)。

圖3 不同放牧強度下草地土壤MBC、MBN和MBC∶MBN含量Fig.3 Grassland soil MBC,MBN and MBC∶MBN content under different grazing intensities注：UG為不放牧，LG為輕度放牧，MG為中度放牧，HG為重度放牧。不同小寫字母表示同一月份不同放牧強度之間的差異顯著性；不同大寫字母表示同一放牧強度不同月份之間的差異顯著性。下同Note:UG means no grazing,LG means light grazing,MG means moderate grazing,HG means heavy grazing. Different lowercase letters indicate the significance of the difference between different grazing intensities in the same month;different capital letters indicate the significance of the difference between different months of the same grazing intensity. The same as below

2.3 不同放牧強度對土壤DOC，DN含量及DOC∶DN的影響

土壤DOC和DN存在明顯的季節動態(圖4)。在不放牧處理下，土壤DN含量在5月和6月顯著高于7月、9月和10月(圖4，P<0.05)；DOC∶DN在9月顯著高于5月和8月(圖4，P<0.05)。在輕度、中度和重度放牧處理下，土壤DOC和DN含量在9月均顯著低于其它月份(圖4，P<0.05)。

同一月份草地土壤DOC，DN含量和DOC∶DN在不同放牧強度之間差異不顯著(圖4)。與不放牧相比，土壤DOC含量在9月輕度放牧處理下顯著降低(圖4，P<0.05)；土壤DOC和DN含量在9月表現出較低值，DOC∶DN有升高的趨勢，但差異不顯著(圖4)。

圖4 不同放牧強度下草地土壤DOC、DN和DOC∶DN含量Fig.4 Grassland soil DOC,DN and DOC∶DN content under different grazing intensities

不同放牧強度處理下，土壤MBC∶DOC在不同的月份間沒有顯著差異(圖5)，但是7月表現出下降的趨勢(圖5)，且MBC∶DOC與土壤水分含量的變化趨勢相同(圖3)，土壤MBN∶DN在10月份最高。

圖5 不同放牧強度下草地土壤MBC∶DOC和MBN∶DN含量Fig.5 Grassland soil MBC∶DOC and MBN∶DN content under different grazing intensities

2.4 不同放牧強度對土壤細菌和真菌豐度的影響

土壤細菌和真菌的豐度存在顯著的季節動態變化(圖6)，均呈現出先上升再下降最后上升的趨勢(圖6)，而細菌與真菌的比值呈現先上升后下降的趨勢。在不放牧處理下，細菌和真菌豐度在9月均顯著高于5月和8月(圖6，P<0.05)；在輕度、中度放牧處理下，真菌豐度在9月顯著增加(圖6，P<0.05)。

與不放牧小區相比，2020年5—9月細菌與真菌豐度均值，輕度放牧處理均顯著降低(圖6，P<0.05)。

圖6 不同放牧強度下草地土壤細菌豐度、真菌豐度和細菌∶真菌Fig.6 Grassland soil bacterial abundance and fungal abundance and bacteria/fungi under different grazing intensities

2.5 不同放牧強度土壤養分及細菌和真菌豐度的關系

由表2可知，月份顯著影響土壤微生物特征(P<0.05)，放牧強度處理對土壤微生物特征沒有顯著影響，月份和放牧強度處理的交互作用對土壤養分及微生物特征影響不顯著。

表2 土壤微生物特征重復測量方差分析結果Table 2 Analysis of variance results of repeated measurement of soil microbial characteristics

2.6 土壤微生物特征與土壤理化性質的相關性分析

由圖7所示，真菌的豐度與土壤pH值呈顯著負相關(P<0.05)；細菌:真菌與土壤pH值呈顯著正相關(P<0.05)；土壤DOC含量與土壤溫度呈顯著正相關(P<0.05)；土壤MBN含量和細菌:真菌與土壤濕度呈顯著負相關(P<0.05)。

圖7 8月土壤微生物特征與土壤理化性質的相關性分析Fig.7 Correlation analysis of soil microbial characteristics and soil physical and chemical properties in August注：橢圓朝右上表示正相關，朝右下表示負相關；*在置信度(雙測)為0.05時，相關性是顯著的Note:the ellipse facing up to the right indicates a positive correlation,and facing down to the right indicates a negative correlation;*When the confidence (double test) is 0.05,the correlation is significant

3 討論

3.1 不同放牧強度對土壤可利用養分庫和微生物特征的影響

本研究表明，4年不同強度的放牧處理沒有顯著影響農牧交錯帶草地土壤可利用養分庫，但是存在顯著的季節動態，說明溫度和降水是影響土壤微生物活性的重要因素，從而影響可利用養分庫。放牧雖然提高了土壤溫度和土壤含水量，但是放牧引起土壤溫度和水分的增加遠遠小于溫度和降雨引起土壤水分變化的季節動態，因此，放牧對土壤可利用養分庫和微生物特征沒有通過提高土壤溫度和含水量產生影響。放牧通過影響草地植物的生長和凋落物組分，影響草地生態系統微生物參與的養分循環過程[27]，同時放牧動物通過采食、踐踏與糞尿歸還對草地土壤養分狀況產生影響[28]。我們發現，經過4年的放牧處理，生長季土壤DOC和DN含量有降低的趨勢，但是差異不顯著，這與阿穆拉(2011)等[29]在荒漠草原研究結果一致，隨著放牧強度的增加，動物的采食和踐踏行為加劇，使草地初級生產力以及凋落物累積量降低，減少進入土壤的有機物，從而影響土壤有機質含量[29]。我們還發現輕度和中度放牧使得土壤可利用養分有升高的趨勢，而重度放牧處理下呈現降低趨勢，已經初步證實了輕度和中度放牧有利于土壤養分的周轉和微生物活動，但是需要長期實驗結果進一步驗證。

土壤MBC，MBN存在明顯的季節變化，與高雪峰(2010)等[30]在內蒙古典型草原研究結果一致，土壤微生物生物量有較強的季節變化，且峰值出現在8月份，重度放牧降低土壤微生物生物量。華北地區四季分明，8月水熱同期有利于土壤微生物的生長和繁殖。土壤MBC，MBN隨放牧強度的增加有降低的趨勢。這與已有研究報道的重度放牧降低土壤微生物生物量結果一致[31]，而且在內蒙古典型羊草草原和大針茅草原的長期自由放牧地也發現MBC顯著下降[31]。由于我們的放牧處理只進行了4年，不同強度的放牧處理尚未對土壤可利用養分產生顯著影響，短期放牧不能改變土壤總碳氮庫，這可能是短期放牧處理沒有引起土壤微生物特征發生顯著變化的重要原因[32]。

已有研究表明，當土壤溫度和含水量升高的時候，凋落物分解速率最快且微生物活性最高，所以，在土壤溫度和水分含量較高的環境下，土壤微生物對營養物質的固持率也較高，5月和6月的MBC和DOC含量也呈現較高的趨勢(圖3，圖4)。土壤水分含量是影響土壤微生物活性的重要因子，因此土壤MBC與土壤含水量有較好的相關性[33-34]。另一方面，由于放牧家畜對草地植被進行長期啃食，導致草地生態系統地上、地下生物量分配發生變化，植被更多地向地上分配，從而降低了土壤微生物量[20,35]。

3.2 放牧強度對土壤養分和微生物關系的影響。

土壤有機質在微生物的生命活動過程中是不可或缺的，且微生物在有機質分解過程中會將土壤中的有機質轉化為CO2或是植物可以直接吸收利用的形態[36]，放牧直接或者間接的影響土壤微生物的數量以及微生物群落的結構組成，對土壤有機質產生影響。我們發現，與不放牧相比，放牧降低了細菌和真菌豐度，增加了細菌與真菌豐度的比值。與細菌相比，真菌的養分利用效率更高，土壤細菌與真菌的比值越小，說明有更大的固碳潛勢[37]。另外在不同放牧強度處理下，細菌豐度大于真菌豐度，這與曹淑寶(2012年)等[38]在呼倫貝爾草甸草原的研究結果一致。細菌與真菌的比值呈現先上升后下降的趨勢，這與李春莉(2009年)等[39]在內蒙古荒漠草原的研究結果一致。由于春夏交接之季降雨少，土壤表層的微生物在含水量較低的環境條件下活性較低，所在真菌和細菌的豐度較低(圖6)；由于細菌對水分變化的敏感性高于真菌，因此生長季細菌豐度高于真菌豐度[39]。

4 結論

綜上所述，短期不同放牧強度對晉北農牧交錯帶草地生態系統生長季土壤微生物特征(土壤微生物生物量碳、土壤微生物生物量氮、土壤微生物生物量碳氮比、細菌和真菌豐度)和土壤可利用養分庫(可溶性有機碳、可溶性有機氮、可溶性有機碳氮比)沒有顯著影響，土壤可利用碳氮庫及微生物群落呈現出一個較為穩定的水平，說明短期的放牧對該草地土壤養分循環過程及土壤微生物結構與功能沒有產生顯著影響。從短期放牧結果推斷，農牧交錯區草地生態系統土壤可利用養分和微生物結構與功能對放牧的響應會隨著處理時間的延長而增強，未來需要繼續在長時間尺度研究不同放牧強度對土壤養分及微生物的影響，從而進一步為農牧交錯區草地生態系統的科學利用和適應性管理提供科學依據。