草地早熟禾SnRK2.2基因克隆及非生物脅迫響應分析

金一鋒， 陳 陽*， 高巖松， 尤 學， 熊 毅， 趙清峰， 蘭紅宇

(1. 齊齊哈爾大學生命科學與農林學院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 3. 黑龍江省農業科學院齊齊哈爾分院， 黑龍江 齊齊哈爾161006)

蛋白激酶(Protein kinase)是植物逆境防御機制中的核心成分，可通過激活多種蛋白磷酸化途徑來調節與逆境反應相關下游基因的表達，其中蔗糖非發酵相關蛋白激酶(SNF1-RELATED PROTEIN KINASE，SnRK)是一種Ser/Thr蛋白激酶，在植物信號通路、代謝過程中起重要作用[1-2]。植物SnRK家族可分化為SnRK1,SnRK2和SnRK3三類，SnRK1在植物生長發育、感知糖信號和調節能量平衡中發揮一定作用[3]，SnRK2與多種非生物脅迫反應途徑相關，如干旱、鹽、ABA等脅迫處理[4]，SnRK3可在Ca2+信號作用下與CBL蛋白相互作用，對鹽脅迫反應較為敏感[5]。

研究表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)等SnRK2部分成員是ABA信號通路中關鍵的調節因子，在干旱脅迫期間對種子發育、休眠和萌發、以及幼苗生長和氣孔調節均有一定作用[8-9]。ABA可以激活AtSnRK2.2、AtSnRK2.3、AtSnRK2.6，擬南芥激酶相關蛋白磷酸酶KAPP可與蛋白激酶SnRK2.2/2.3/2.6相互作用，負向調節脫落酸信號過程[6-7]。研究發現擬南芥AtSnRK2.8、AtSnRK2.9、AtSnRK2.10，以及水稻SnRK2家族成員可以被高滲溶液和鹽脅迫激活[10-11]。水稻基因組中SnRK2含有10個成員，命名為SAPK (osmotic stress/ABA-activated protein kinase)，研究發現干旱脅迫下SAPK2可通過調節氮代謝過程促進水稻產量[12]。Lou研究發現蛋白激酶SAPK1和SAPK2可協同作用，提高水稻的耐鹽性[13]，OsSAPK2可提升水稻對干旱脅迫的脫落酸敏感性和耐性[14]。

目前，蛋白激酶SnRK基因家族在水稻、小麥(TriticumaestivumL.)、玉米(ZeamaysL.)、二穗短柄草(BrachypodiumdistachyonL.)、燕麥(AvenasativaL.)等禾本科植物中已得到研究，但有關SnRK2基因在禾本科草坪草中的功能及應用鮮有報道。城市建設中草坪建植與養護過程中經常面臨干旱、鹽分、氮肥不足等逆境脅迫，探究草坪草響應環境、抵抗外界脅迫信號的機制尤為重要[15-16]。草地早熟禾(PoapratensisL.)是禾本科(Poaceae)早熟禾屬(Poa.)冷季型草坪草，其憑借耐低溫、耐修剪等優點，可應用于寒冷地區的園林綠化[17]。本研究以草地早熟禾為材料，利用RT-PCR方法克隆得到草地早熟SnRK2.2基因，并進行生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR方法觀測SnRK2.2基因的組織表達特異性及非生物脅迫反應中該基因的表達模式，以期為揭示SnRK2.2基因應答逆境脅迫的分子機制奠定基礎，這將豐富草坪草SnRK2抗逆機制的相關研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

供試材料為草地早熟禾‘午夜Ⅱ號’品種，購于北京正道生態科技有限公司。將飽滿的種子置于營養土中，其中：壤土：沙子：蛭石=3∶1∶1，培養條件為：相對濕度為60%，25℃光照14 h，15℃暗培養10 h，光照強度500 μmol·m-2·s-1。待營養土中培養90 d后使用1/2 Hoagland營養液進行水培處理，待培養10 d后進行模擬干旱脅迫、鹽脅迫、氮脅迫、磷脅迫處理。

具體處理分組為：(1)干旱脅迫處理：1/2 Hoagland水培液中加入10% PEG6000(Polyethylene glycol)，干旱誘導時間分別為：0 h，2 h，16 h。(2)鹽脅迫處理：配置0 mM，30 mM，100 mM，300 mM NaCl的1/2 Hoagland營養液，每日更換一次營養液，處理5 d后取樣。(3)氮脅迫處理：NaNO3為氮源，配置0 mM，1.5 mM，15 mM NaNO3的1/2 Hoagland營養液，每日更換一次營養液，處理21 d后取樣。(4)磷脅迫處理：KH2PO4為磷源，配置0 mM，0.01 mM，1 mM濃度的KH2PO4的1/2 Hoagland營養液，每日更換一次營養液，處理21 d取樣。(5)ABA、BR處理：ABA濃度為5 mg·L-1,15 mg·L-1，每日噴施10 mL于葉部，于0 d,7 d,21 d取樣。BR濃度為0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1，每日噴施10 mL于葉部，于0 d,7 d,21 d取樣。以上逆境脅迫取樣部位均為葉部，各處理取樣均三次生物學重復，置于-80℃保存。

1.2 草地早熟禾SnRK2.2基因的克隆

利用天根植物總RNA提取試劑盒(TianGen，Beijing)，提取并檢測供試材料總RNA濃度、純度及完整性。以RNA為模板，采用PrimeScriptTMⅡ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，Japan) 進行cDNA第一鏈的合成，用于草地早熟禾SnRK2.2基因的克隆。根據前期轉錄組測序得到草地早熟禾SnRK2.2部分序列為基礎(RNA-Seq在NCBI登錄號為PRJNA517968)，結合Genebank公布的小麥SnRK2.2(XM_044466822)、節節麥SnRK2.2(XM_020335235.2)，設計特異性引物SnRK2.2-F,SnRK2.2-R引物序列見表1。以cDNA為模板，利用2xEs Taq MasterMix(CWBIO，CW0690)對草地早熟禾SnRK2.2基因編碼區進行擴增，擴增產物由生工生物工程股份有限公司(上海)完成測序。

1.3 草地早熟禾SnRK2.2基因生物信息學分析

利用NCBI ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測SnRK2.2開放性閱讀框；利用NCBI CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析SnRK2.2蛋白保守結構功能域；利用MEGA7.0,MEME,Tbtools構建系統進化樹；利用ClustalW (http://www.clustal.org/)進行多個禾本科植物SnRK2.2編碼氨基酸同源性分析；利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)基本理化性質，Netphos(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)預測磷酸化位點，Motifscan (https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan)分析目的蛋白生物活性位點；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在線預測SnRK2.2蛋白質二級、三級結構。

1.4 草地早熟禾SnRK2.2基因組織特異性及非生物脅迫表達模式分析

本研究提取草地早熟禾植株根部、莖部、葉部、穗的RNA；提取干旱、鹽、氮、磷脅迫后的草地早熟禾葉部RNA；提取ABA、BR誘導處理后草地早熟禾葉部RNA，以RNA模板反轉錄獲得第一條cDNA，作為qRT-PCR模板。采用qRT-PCR相對定量方法，總反應體系為50 μL，包含：4 μL cDNA，2 μL Q-SnRK2.2-F/R，17 μL ddH2O，25 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Takara)，采取兩步法進行擴增程序：95℃預變性30 s，95℃、5 s,60℃、30 s，共40個循環，選擇草地早熟禾UBQ為內參基因。該試驗生物學重復3次，試驗重復3次，利用2-ΔΔCt法處理數據。

表1 所需RT-PCR及qRT-PCR引物Table 1 The Primers used for RT-PCR and qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 草地早熟禾SnRK2.2基因編碼區克隆及生物信息學分析

草地早熟禾cDNA為模板，以SnRK2.2-F/R為引物，進行PCR擴增，得到約為1284 bp的條帶(圖1)，ORF預測其包含一個1026 bp開放閱讀框，共編碼341個氨基酸，預測其蛋白相對分子量為 38.70 kD，等電點為5.48。草地早熟禾SnRK2.2編碼氨基酸為SRK/SAPK family serine/threonine-protein kinase，保守域分析表明，其包含典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶催化結構域STKc_SnRK2，屬于PKc_like Superfamily (圖2)。利用MEGA和Tbtools軟件對草地早熟禾SnRK2.2與其他18個其他植物SnRK2.2的氨基酸序列進行同源比對(圖3)，結果顯示，草地早熟禾SnRK2.2與燕麥SnRK2.2(QIH55250.1)進化關系上較近、與小麥SnRK2.2(XP_037484113.1)、節節麥SnRK2.2(XP_020190824.1)、二穗短柄草SnRK2.2(NP_001304800.1)屬于同一個分支，同源性分別為96.19%,95.31%,95.31%,93.84%，可見，SnRK2.2氨基酸序列在禾本科植物中高度保守。草地早熟禾SnRK2.2與燕麥、小麥、節節麥、二穗短柄草SnRK2.2氨基酸序列進行多序列比較，發現其ATP binding site、Active site、Activation loop，及Polypeptide substrate binding site典型的多肽位結合位點等位置。草地早熟禾SnRK2.2氨基酸磷酸化位點含有16個絲氨酸、5個蘇氨酸和5個酪氨酸。蛋白生物活性位點預測結果，其包含5個酪蛋白激酶II磷酸化位點，氨基酸位置分別為96～99 aa，129～132 aa，172～175 aa，250～253 aa，287～290 aa，2個N-肉豆蔻酰化位點:110～115 aa，304～309 aa，3個蛋白激酶C磷酸化位點:54～56 aa，92～94 aa，172～174 aa，1個酪氨酸激酶磷酸化位點(140～146 aa)，1個蛋白激酶ATP結合區(10～33 aa)，1個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(119～131aa)(圖4)。草地早熟禾SnRK2.2與擬南芥、水稻、大麥SnRK2 s進行同源進化關系比對，發現草地早熟禾SnRK2.2與HvSnRK2.2,OsSnRK2.2,OsSnRK2.1,HvSnRK2.4,AtSnRK2.7這5個SnRK2成員屬于同一個分支，親緣關系較近(圖5)。

圖1 草地早熟禾SnRK2.2 基因PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoresis of SnRK2.2 gene of Poa pratensis

圖2 草地早熟禾SnRK2.2蛋白的保守結構域分析Fig.2 Conserved domain prediction of SnRK2.2 protein

圖3 草地早熟禾SnRK2.2與其他植物SnRK2.2的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Poa pratensis SnRK2.2 protein and SnRK2.2 in other species

圖4 草地早熟禾SnRK2.2與其他植物SnRK2.2同源蛋白的多序列比對Fig.4 Poa pratensis SnRK2.2 with other plants SnRK2.2 multiple sequence alignment of homologous proteins注：I代表蛋白激酶ATP結合信號區，Ⅱ代表N-肉豆蔻酰化位點，Ⅲ代表絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點Note:I represents ATP binding signal region of protein kinase,Ⅱ represents N-myristoylation site,and Ⅲ represents serine/threonine protein kinase active site

圖5 草地早熟禾SnRK2.2與擬南芥、水稻、大麥SnRK2家族成員同源進化關系比對Fig.5 Kentucky bluegrass SnRK2 Comparison of homologous evolutionary relationship between SnRK2 family members and Arabidopsis,Oryza sativa and Hordeum vulgare注：擬南芥，水稻，大麥SnRK2家族成員分別是：AtSnRK2.1-2.10，OsSnRK2.1-2.10，HvSnRK2.1-2.10Note:SnRK2 family in Arabidopsis (SnRK2.1-2.10)，Oryza sativa (OsSnRK2.1-2.10) and Hordeum vulgare (HvSnRK2.1-2.10)

利用Wolf-Psort亞細胞定位，結果顯示草地早熟禾SnRK2.2定位于細胞質基質中。利用SOPMA進行預測分析(圖6)，結果顯示草地早熟禾SnRK2.2蛋白質是一種混合型結構的蛋白質，其二級結構主要由不規則卷曲(42.23%)、α-螺旋(36.66%)、延伸鏈(14.96%)和β-轉角(6.16%)共同構成。利用SWISS-MODEL對其三級結構進行建模(圖7)，發現其與蛋白二級結構預測結果一致。

圖6 草地早熟禾SnRK2.2蛋白質二級結構Fig.6 Secondary structure of SnRK2.2 protein in Poa pratensis.注：圖中藍色表示α-螺旋、紅色表示延伸鏈、綠色表示β-轉角、紫色表示不規則卷曲Note:In the figure,blue represents α-helix,red represents extended chain,green represents β-turn,and purple represents irregular coil

圖7 草地早熟禾SnRK2.2蛋白質三級結構預測Fig.7 Tertiary structure of SnRK2.2 protein in Poa pratensis.

2.2 草地早熟禾SnRK2.2基因的組織特異性分析

實時熒光定量PCR結果顯示，草地早熟禾SnRK2.2基因相對表達量存在組織特異性(P<0.05)，由圖8-a可見，草地早熟禾穗中SnRK2.2相對表達量最高，其次是葉部、莖部，根部最低，成熟穗中相對表達量是根部的32.82倍。

圖8 草地早熟禾SnRK2.2基因表達水平的組織特異性分析Fig.8 Expression level analysis of SnRK2.2 gene in Kentucky Bluegrass under tissue注：不同小寫字母表示不同組織部位中SnRK2.2基因表達量差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant differences in SnRK2.2 gene expression in different tissue at the 0.05 level.

2.3 草地早熟禾SnRK2.2基因對干旱、鹽、氮、磷脅迫的響應

由圖9可以看到，草地早熟禾SnRK2.2積極響應PEG、鹽、氮、磷非生物脅迫。10% PEG6000模擬干旱脅迫顯著促進葉部SnRK2.2基因表達，2 h>16 h>0 h，其中，2 h的SnRK2.2相對表達量為峰值，是0 h的11.85倍，隨著干旱時間增加其相對表達量下降，但16 h仍為0 h的8.52倍(見圖9A)。由圖9B可知，不同梯度NaCl濃度處理顯著影響SnRK2.2基因的表達量(P<0.05)，25 mM NaCl>100 mM NaCl>300 mM NaCl>0 mM NaCl(CK組)。隨著鹽濃度的增加，其相對表達量呈現先升高后降低的趨勢，其中25 mM NaCl處理組的表達量CK組的6.75倍。由圖9C可知，不同梯度NaNO3氮素處理顯著影響草地早熟禾SnRK2.2基因的表達量(P<0.05)，1.5 mM NaNO3>0 mM NaNO3>15 mM NaNO3，與適氮組(15 mM NaNO3)相比，SnRK2.2積極響應低氮(1.5 mM NaNO3)及無氮(0 mM NaNO3)環境，其中1.5 mM NaNO3處理組的表達量是15 mM NaNO3的4.18倍。草地早熟禾SnRK2.2基因表達水平隨著KH2PO4濃度的增加呈現先升高后降低趨勢(P<0.05)，0.01 mM KH2PO4低磷處理組相對表達量分別是0 mM KH2PO4、1 mM KH2PO4的2.23倍、2.11倍(見圖9D)，低磷環境(0.01 mM KH2PO4)可促進該基因的表達。

2.4 外源ABA、BR對草地早熟禾SnRK2.2基因表達水平的影響

ABA和BR是調節植物生理過程和缺水條件下重要的應激激素，本研究利用實時熒光定量PCR方法觀察草地早熟禾SnRK2.2響應ABA，BR誘導的表達模式。本研究測定植物激素ABA、BR不同濃度及不同時間對草地早熟禾葉部SnRK2.2基因表達水平的影響(圖10A、10B)。將5 mg·L-1ABA噴施誘導7 d,21 d與0 d(CK組)進行對比，結果發現5 mg·L-1ABA誘導7 d時SnRK2.2基因相對表達量顯著高于21 d,0 d(P<0.01)。但當15 mg·L-1ABA誘導時，隨著誘導天數的增加，SnRK2.2基因相對表達量顯著提升，21 d>7 d>0 d。不同ABA濃度誘導7 d、21 d時SnRK2.2基因差異顯著，處理相同天數時15 mg·L-1ABA的相對表達量均高于5 mg·L-1ABA。可見外源ABA噴施濃度及誘導時間顯著影響SnRK2.2基因的表達水平。圖10B可知，BR誘導顯著促進草地早熟禾SnRK2.2基因的表達水平(P<0.01)，21 d>7 d>0 d。0.1 mg·L-1BR處理下，21 d的相對表達量是7 d、0 d的9.10,10.71倍，而1.0 mg·L-1BR處理下，21 d的相對表達量是7 d,0 d的2.68,5.84倍，可見，低濃度0.1 mg·L-1BR的促進效果更為顯著。

圖9 草地早熟禾SnRK2.2基因在非生物脅迫下的表達模式分析Fig.9 Expression pattern analysis of SnRK2.2 gene of Kentucky Bluegrass induced under various abiotic stress注：不同小寫字母表示干旱、鹽、氮、磷脅迫過程中該基因表達量在0.05水平上差異顯著。Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the P<0.05,under drought,salt,nitrogen and phosphorus stress.

圖10 草地早熟禾SnRK2.2基因在植物激素ABA、BR誘導下的表達模式分析Fig.10 Expression pattern analysis of SnRK2.2 gene of Kentucky Bluegrass by ABA and BR treatment注：**表示ABA、BR處理中該基因的表達量在0.01水平上差異顯著Note:** indicates significant difference at the 0.01 level，during ABA and BR treatment

3 討論

蛋白激酶SnRK2 s屬于多基因家族，在擬南芥中SnRK2家族包含10個成員，水稻、大麥、二穗短柄草基因組中也鑒定出了11,10,10個基因編碼SnRK2家族基因[18-19]。本研究克隆獲得一個草地早熟禾SnRK2蛋白激酶基因SnRK2.2，其開放閱讀框ORF序列與小麥、節節麥、二穗短柄草SnRK2.2高度同源。水稻OsSAPK2表達水平存在組織特異性，其相對表達量排序為葉>根>種子>幼苗>莖部[14]，這與本研究結果存在一定差異。草地早熟禾SnRK2.2的表達也存在組織特異性，但成熟穗中最高，其次是葉部、莖部、根部，地上部位的SnRK2.2相對表達量顯著高于地下根部。研究表明水稻SAPK2與水稻籽粒含量有關聯[12]，猜測草地早熟禾SnRK2.2組織表達模式與植株不同部位的蔗糖、淀粉代謝可能存在一定關聯。草地早熟禾SnRK2.2蛋白含有絲氨酸/蘇氨酸激酶的催化結構域STKc_SnRK2，也包含SnRK2典型的功能域，如蛋白激酶ATP結合信號區、N-肉豆蔻酰化位點、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點，這與燕麥、二穗短柄草等植物的研究結果一致，可見表明禾本科植物中SnRK2蛋白激酶成員結構較為保守[19-20]。N-肉豆蔻酰化作用位點是植物應答環境脅迫反應中調節膜靶向和信號轉導的關鍵區域[21]，SnRK2蛋白激酶家族包含的蛋白激酶ATP結合信號區、N-肉豆蔻酰化位點、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點等可能積極參與非生物脅迫信號傳遞。

研究表明擬南芥10個SnRK2中，SnRK2.2-2.3-2.6在應對ABA和干旱時起到調節作用，其中蛋白激酶SnRK2.2和SnRK2.3在水分虧缺條件下可調節種子休眠、萌發和幼苗生長[7]。聚乙二醇和鹽處理可顯著上調水稻SAPK2基因的表達水平[14]，這與本研究結果一致。研究表明水稻轉錄因子OsbZIP23是脫落酸依賴的抗旱耐鹽反應中重要調節因子，干旱脅迫下水稻SAPK2可以與OsbZIP23相互作用并使其磷酸化以進行轉錄激活[22]。干旱脅迫下質膜相關Ca2+結合蛋白PCaP2(plasma membrane-associated Ca2+-binding protein)可以激活SnRK2.2-2.3-2.6和ABFs等干旱響應基因的表達[23]。鹽脅迫處理可促進水稻SAPK1和SAPK2基因的表達[13]。Liu研究發現過表達煙草NtSnRK2.2可調節碳水化合物代謝和側根發育從而增強煙草耐鹽性[24]。本研究中，鹽脅迫處理組(25 mM-300 mM NaCl)中草地早熟禾SnRK2.2的表達均高于未處理組，低鹽處理(25 mM NaCl)更有利于該基因的表達。在缺氮、缺鉀環境中SAPK2能顯著影響水稻幼苗生長和根系發育，SAPK2通過調節硝酸鹽相關轉運體促進硝酸鹽的吸收和同化，進而調控碳氮代謝過程[12]。本研究中，草地早熟禾SnRK2.2基因積極響應低氮、低磷脅迫。許多研究表明，SnRK2和SnRK3主要參與對滲透脅迫和逆境信號分子ABA的應答。本研究將擬南芥、水稻、大麥SnRK2家族成員與草地早熟禾SnRK2.2進行親緣關系分析，由圖5可見，AtSnRK2.8與草地早熟禾SnRK2.2進化關系較近，AtSnRK2.8與草地早熟禾SnRK2.2結構特征相似，其功能可能也有一定相似性，研究發現AtSnRK2.8可以被ABA誘導激活，這與本研究結果一致草地早熟禾SnRK2.2也可被ABA激活，玉米ZmSnRK2.2，ZmSnRK2.4的研究也得到相似結果[25-26]。水楊酸SA誘導下，甘藍型油菜的蔗糖增加，而SnRK2.2和AREB2表達受到抑制[27]。本研究發現，外源ABA、BR噴施濃度及誘導時間可顯著影響SnRK2.2基因的表達水平，高濃度ABA(15 mg·L-1)、低濃度BR(0.1 mg·L-1)處理更有利于該基因的表達。以上結果說明，草地早熟禾SnRK2.2基因可能作為一個調節因子，調節干旱、鹽、低氮、低磷、植物激素等非生物脅迫所引發的信號傳導，SnRK2.2在植物的抗逆性改良中具有潛在的應用價值。

4 結論

本研究克隆得到草地早熟禾SnRK2.2基因，包含絲氨酸/蘇氨酸激酶催化結構域STKc_SnRK2，屬于SnRK2家族基因，禾本科植物中SnRK2.2具有較高的保守性。草地早熟禾SnRK2.2基因的表達存在組織特異性，穗中最高，根部最少。草地早熟禾SnRK2.2積極響應干旱、鹽、低氮、低磷脅迫及ABA、BR誘導處理。本研究系統分析草地早熟禾SnRK2.2基因特征，為進一步了解草地早熟禾SnRK2家族的特征，探究草坪草SnRK2家族基因在逆境脅迫下的分子調控機理奠定理論基礎。