外源H2O2引發對燕麥種胚細胞AsA-GSH循環的影響

李紅玉, 王雅聰, 曾 佳, 王聰聰, 董寬虎, 夏方山*

(1.山西農業大學科研管理部， 山西 太谷 030801； 2.山西農業大學草業學院， 山西 太谷 030801；3.中國農業大學草業科學與技術學院， 北京 100193)

種子是現代農牧業生產過程中最重要的基礎性資料，其質量好壞是決定農牧業發展質量高低的關鍵所在[1-2]。種子活力會在發育成熟后的貯藏過程中不斷喪失，而活性氧(Reactive oxygen species，ROS)過量累積被認為是種子活力喪失的主要原因[3]，H2O2是動植物體內調控ROS平衡的動態核心，其含量升高被認為是直接導致種子活力喪失的決定因素[4-5]。然而，H2O2又是一種參與植物調節生長發育的小分子信號物質，其具有維持植物細胞穩態的作用，能夠促進種子萌發及幼苗根系生長，并提高植物抗逆生長能力[6]。研究發現，H2O2的生理生化作用具有濃度效應，低濃度會發揮促進作用，而高濃度則會起抑制作用[7-9]，此外，外源H2O2處理對植物種子萌發及幼苗生長的影響與植物種類(品種)及引發時間關系密切，且其作用機理目前仍不明確[10]。研究燕麥(Avenasativa)種子老化發現，H2O2含量升高是導致其活力降低的主要原因，這主要是由種胚細胞及線粒體內抗壞血酸-谷胱甘肽(Ascorbic acid-glutathione，AsA-GSH)循環抗氧化能力降低而導致了脂質過氧化損傷加劇造成的[10-13]。高濃度外源H2O2長時間處理也會造成燕麥種子活力的喪失[9]，且外源H2O2處理對種子抗氧化酶的影響雖已在植物萌發及其幼苗抗鹽堿[6-7]及抗寒[8]等方面有了報道，但關于內外源H2O2影響種子胚細胞AsA-GSH循環的異同關系仍未見報道。因此，本試驗以燕麥種子為材料，探討外源H2O2對其ASA-GSH循環抗氧化酶活性的影響，以期驗證H2O2調節種子活力的抗氧化機理，從而為詳細闡明H2O2影響種子老化的內在機理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試種子為‘太陽神’燕麥，于2018年3月購買自北京正道農業股份有限公司，種子初始發芽率為98%左右，初始含水量為7.8%(鮮重基礎)左右，-20℃條件保存至2018年5月試驗進行。

1.2 H2O2引發處理

參照文獻[14]的方法將燕麥種子含水量調整至10%(鮮重基礎)左右，將每份約10 g左右燕麥種子在室溫黑暗條件下分別用200 mL不同濃度(0，0.96，1.92，3.84和7.68 mol·L-1)的H2O2浸泡0，6，12和18 h，再用蒸餾水沖洗3次并用濾紙吸干表面水分，最后置于黑暗室溫條件下干燥2 d，使其含水量降至約10%左右(鮮重基礎)，于4℃下密封保存備用，用于后續試驗。

1.3 指標測定

粗酶液的提取參考Kibinza等[15]的方法進行，在室溫條件下用蒸餾水吸脹4 h(胚根為突破種皮)后剝取100個種胚冰浴研磨，每個處理重復4次。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的活性測定參照Rao和Sresty[16]的方法，過氧化氫酶(Catalase，CAT)的活性測定參照Clairbone[17]的方法，谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)的活性測定參照Esterbauer和Grill[18]的方法，抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)和脫氫抗壞血酸還原酶(Dehydroascorbate reductase，DHAR)的活性測定參照Nakano和Asada[19]的方法，單脫氫抗壞血酸還原酶(Monodehydroasorbate reductase，MDHAR)的活性測定參照Arrigoni等[20]的方法，H2O2和可溶性蛋白含量測定均使用購買自南京建成生物工程研究所的試劑盒進行，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量測定則參照Bailly等[21]的方法。

1.4 數據分析

試驗數據采用Excel 2010和SPSS 21.0統計分析軟件進行數據整理和方差分析，之后用Duncans法(P<0.05)進行多重比較，結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 外源H2O2引發對燕麥種胚細胞SOD活性的影響

由圖1可知，引發6 h時，燕麥種胚細胞SOD活性隨H2O2濃度增加而升高，濃度0.96～ 7.68 mol·L-1間均差異顯著(P<0.05)；引發12和18 h時，其SOD活性隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢，且各濃度間均存在顯著差異(P<0.05)，分別在1.92和0.96 mol·L-1時達到最大值。濃度為0.96 mol·L-1時，其SOD活性隨引發時間延長呈顯著升高趨勢(P<0.05)；濃度為1.92～7.68 mol·L-1時，其SOD活性隨引發時間延長呈先升后降趨勢，各引發時間下均顯著高于CK(P<0.05)，濃度為1.92，3.84和7.68 mol·L-1時分別在引發12，6和6 h達到最大值。

圖1 外源H2O2引發下燕麥種胚細胞SOD活性變化Fig.1 Changes of SOD activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming注：不同大寫字母表示同一引發時間下不同濃度間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一濃度下不同引發時間間差異顯著(P<0.05)，下圖同Note:Means with different capital letters are significant differences between different concentrations under same priming time at the 0.05 level；means with different small letters are significant differences between different priming time under same concentrations at the 0.05 level, the same as below

2.2 外源H2O2引發對燕麥種胚細胞CAT活性的影響

由圖2可知，引發6～18 h時，燕麥種胚細胞CAT活性均隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢；引發6 h時其在1.92和3.84 mol·L-1顯著高于其他濃度(P<0.05)，而引發12和18 h時則均在0.96 mol·L-1顯著高于其他濃度(P<0.05)。濃度為0和0.96 mol·L-1時，燕麥種胚細胞CAT活性隨引發時間延長而顯著升高(P<0.05)；濃度為1.92～7.68 mol·L-1時，其CAT活性均隨引發時間延長呈先升后降趨勢，并在引發6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05)，且同一H2O2濃度下各引發時間存在顯著差異(P<0.05)，且均顯著高于CK(P<0.05)。

圖2 外源H2O2引發下燕麥種胚細胞CAT活性變化Fig.2 Changes of CAT activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

2.3 外源H2O2引發對燕麥種胚細胞APX活性的影響

由圖3所示，引發6～18 h時，燕麥種胚細胞APX活性均隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢，且均在0.96 mol·L-1時顯著高于其他濃度(P<0.05)；引發6 h時，其在7.68 mol·L-1時顯著低于0 mol·L-1時(P<0.05)；引發12 h時，其在3.84和7.68 mol·L-1時顯著低于0 mol·L-1時(P<0.05)；引發18 h時，其在1.92～7.68 mol·L-1時均顯著低于0 mol·L-1時(P<0.05)。濃度為0～3.84 mol·L-1時，燕麥種胚細胞APX活性隨引發時間延長呈先升后降趨勢；濃度為0.96 mol·L-1時其APX活性在各引發時間下均顯著高于CK(P<0.05)，并在引發6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05)；濃度為1.92 mol·L-1時其APX活性在引發6和12 h時顯著高于CK(P<0.05)；濃度為3.84 mol·L-1時其APX活性在引發6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05)，但在引發12和18 h時顯著低于CK(P<0.05)；濃度為7.68 mol·L-1時，其APX活性隨引發時間的延長而顯著下降(P<0.05)。

圖3 外源H2O2引發下燕麥種胚細胞APX活性變化Fig.3 Changes of APX activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

2.4 外源H2O2引發對燕麥種胚細胞MDHAR活性的影響

由圖4所示，引發6～18 h時，燕麥種胚細胞MDHAR活性均隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢，且各濃度間存在顯著差異(P<0.05)；引發6 h時，其MDHAR活性在0.96～3.84 mol·L-1時顯著高于0 mol·L-1時(P<0.05)，并在1.92 mol·L-1時達到最大值，而在7.68 mol·L-1時則顯著低于0 mol·L-1時(P<0.05)；引發12和18 h時其MDHAR活性在0.96和1.92 mol·L-1時顯著高于0 mol·L-1時(P<0.05)，并均在0.96 mol·L-1時達到最大值，而在3.84和7.68 mol·L-1時則顯著低于0 mol·L-1時(P<0.05)。除濃度為0 mol·L-1外，同一H2O2濃度下各引發時間下存在顯著差異(P<0.05)；0.96～3.84 mol·L-1時，其MDHAR活性隨引發時間延長呈先升后降趨勢；在0.96和1.92 mol·L-1時，各引發時間下均顯著高于CK(P<0.05)，并分別在引發12和6 h時達到最大值；在3.84 mol·L-1時，其MDHAR活性在引發6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05)，但在引發12和18 h時顯著低于CK(P<0.05)；在7.68 mol·L-1時，其MDHAR活性則隨引發時間延長而顯著下降(P<0.05)。

圖4 外源H2O2引發下燕麥種胚細胞MDHAR活性變化Fig.4 Changes of MDHAR activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

2.5 外源H2O2引發對燕麥種胚細胞DHAR活性的影響

由圖5可知，引發6～18 h時，燕麥種胚細胞DHAR活性均隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢；引發6和12 h時，其DHAR活性均在0.96和1.92 mol·L-1時顯著高于0 mol·L-1時(P<0.05)，而引發18 h時僅在0.96 mol·L-1時顯著高于其他濃度(P<0.05)；引發6 h時其DHAR活性僅在7.68 mol·L-1時顯著低于0 mol·L-1時(P<0.05)，而引發12和18 h時則在3.84和7.68 mol·L-1時均顯著低于0 mol·L-1時(P<0.05)。濃度為0.96～3.84 mol·L-1時，其DHAR活性隨引發時間延長呈先升后降趨勢；濃度為0.96 mol·L-1時，其DHAR活性在各引發時間均顯著高于CK(P<0.05)，并在引發12 h時達到最大值；濃度為1.92和3.84 mol·L-1時，其DHAR活性均在引發6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05)，但濃度為3.84 mol·L-1時則在引發12和18 h時顯著低于CK(P<0.05)；濃度為7.68 mol·L-1時，其DHAR活性隨引發時間延長而顯著下降(P<0.05)。

圖5 外源H2O2引發對燕麥種胚細胞DHAR活性變化Fig.5 Changes of DHAR activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

2.6 外源H2O2引發對燕麥種胚細胞GR活性的影響

由圖6所示，引發6～18 h時，燕麥種胚細胞GR活性均隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢，且0.96～7.68 mol·L-1時均顯著高于0 mol·L-1時(P<0.05)；引發6 h時，其GR活性在1.92和3.84 mol·L-1時顯著高于其他濃度(P<0.05)；引發12和18 h時，其GR活性各濃度間存在顯著差異(P<0.05)，分別在1.92和0.96 mol·L-1時達到最大值。濃度為0.96 mol·L-1時，其GR活性隨引發時間延長而顯著升高(P<0.05)；濃度為1.92～7.68 mol·L-1時，其GR活性隨引發時間延長呈先升后降趨勢，但在各引發時間下均顯著高于CK(P<0.05)。

圖6 外源H2O2引發下燕麥種胚細胞GR活性變化Fig.6 Changes of GR activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

2.7 外源H2O2引發對燕麥種胚細胞H2O2和MDA含量的影響

由圖7可知，引發6～18 h時，燕麥種胚細胞H2O2和MDA含量均隨H2O2濃度增加而升高，且均在7.68 mol·L-1時達到最大值，并顯著高于其他濃度(P<0.05)；除濃度為0和0.96 mol·L-1時，其MDA含量無顯著差異外，其H2O2和MDA含量在各濃度間均存在顯著差異(P<0.05)。燕麥種胚細胞H2O2和MDA含量在0.96～7.68 mol·L-1時均隨引發時間延長而升高，且均顯著高于CK(P<0.05)；濃度為1.92～7.68 mol·L-1時，其H2O2和MDA含量在同一濃度下的各引發時間間均存在顯著差異(P<0.05)。

圖7 外源H2O2引發下燕麥種胚細胞H2O2(A)和MDA(B)含量變化Fig.7 Changes of H2O2 (A) and MDA (B) contents in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

3 討論

植物體內ROS的產生與清除在正常條件下會處于一個維持正常生命活動的動態平衡，然而這種平衡一旦被破壞就會影響植物的正常代謝活動，從而破壞其正常的生長發育[22]。抗氧化酶是動植物細胞內調控ROS自由基平衡的主要清除劑，可緩解植物種子老化過程中過量積累的ROS對其細胞膜的攻擊作用，減弱其細胞膜的脂質過氧化，進而降低植物種子的老化速率[23]。然而，種子細胞在老化過程中會大量積累以H2O2為動態核心的ROS自由基，并造成其抗氧化酶活性的迅速下降，從而導致細胞程序性死亡，使種子活力逐漸喪失[24]。本試驗發現，外源H2O2引發濃度為0～0.96 mol·L-1時燕麥種胚細胞內H2O2含量增加相對緩慢，而其SOD，CAT，APX，MDHAR，DHAR及GR活性均保持較高水平，其MDA含量增加也就相對較少，這表明此時燕麥種胚細胞內AsA-GSH循環有能力清除過量增加的H2O2，從而減緩其造成的脂質過氧化損傷。因此，燕麥種子發芽率、發芽指數及幼苗活力指數在外源H2O2引發濃度為0～0.96 mol·L-1時也保持相對較高的水平，而其平均發芽時間的延長也相對較少[9]。這與外源H2O2促進鹽脅迫下黃瓜(Cucumissativus)[6]和小白菜(Brassicachinensis)[7]等植物種子萌發的研究結論相似。然而，高濃度(3.84～7.68 mol·L-1)外源H2O2引發時，燕麥種胚細胞內H2O2含量會顯著升高(P<0.05)，盡管其SOD，CAT和GR活性仍顯著高于CK(P<0.05)，但其APX，MDHAR和DHAR活性除引發6 h外均已顯著低于CK(P<0.05)，其MDA含量也顯著高于CK(P<0.05)，這表明燕麥種胚細胞內AsA-GSH循環抗氧化能力已經不足以維持其H2O2平衡，從而導致其脂質過氧化損傷急劇加重。因此，高濃度的外源H2O2引發處理顯著降低了燕麥種子的發芽率、發芽指數及幼苗活力指數(P<0.05)，并顯著提高了其平均發芽時間(P<0.05)[9]。本試驗中，高濃度(3.84～7.68 mol·L-1)外源H2O2引發下，燕麥種胚細胞內SOD，CAT和GR活性仍顯著高于CK(P<0.05)，而其APX，MDHAR和DHAR活性則除引發6 h外均已顯著低于CK(P<0.05)，這說明其APX，MDHAR和DHAR是調控其H2O2平衡的關鍵酶，這與燕麥種子老化研究的結論相似[4,14]。

外源H2O2對植物種子萌發的影響不僅與其濃度高低有關，還與其處理時間的長短有密切關系[9]。本試驗發現，除濃度為0和0.96 mol·L-1外，相同濃度外源H2O2引發下，燕麥種胚細胞內H2O2及MDA含量均隨引發時間的延長而顯著升高(P<0.05)，這表明引發時間越長，細胞內H2O2積累量就越多，其脂質過氧化損傷也就越嚴重。然而，低濃度(0.96 mol·L-1)外源H2O2引發下，燕麥種胚細胞內SOD，CAT和GR活性均隨著引發時間的延長而升高，APX，MDHAR和DHAR活性呈先升高后下降的趨勢，所以燕麥種胚細胞內H2O2及MDA含量在低濃度外源H2O2引發下隨引發時間的延長而增加的幅度相對較少，因而對其種子活力的影響也相對較小[9]。然而，高濃度(3.84～7.68 mol·L-1)外源H2O2引發下，燕麥種胚細胞內SOD，CAT，APX，MDHAR，DHAR和GR活性均隨引發時間由6 h延長到18 h而降低，這說明引發時間越長，其AsA-GSH循環抗氧化能力也就越低，因而燕麥種子活力也就喪失的越嚴重[9]。燕麥種胚細胞內SOD,CAT和GR活性在引發12和18 h時仍顯著高于CK(P<0.05)，而其APX，MDHAR和DHAR活性則顯著低于CK(P<0.05)，這說明燕麥種胚細胞AsA-GSH循環的抗氧化能力在外源H2O2引發條件下主要依賴APX，MDHAR和DHAR來發揮作用。研究燕麥種子老化也發現種胚細胞內APX和MDHAR活性下降是其H2O2的積累的主要原因[14]。

4 結論

外源H2O2引發對燕麥種胚細胞抗氧化能力的影響與其引發濃度和時間有關，低濃度(0.96 mol·L-1)或短時間(6 h)引發時能夠提高燕麥種胚細胞AsA-GSH循環的抗氧化能力，而高濃度(3.84～7.68 mol·L-1)或長時間(12～18 h)則相反。外源H2O2引發導致燕麥種胚細胞H2O2和丙二醛含量增加，而抗壞血酸過氧化物酶，單脫氫抗壞血酸還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶是外源H2O2引發下燕麥種胚細胞內抗壞血酸-谷胱甘肽循環清除H2O2的關鍵酶，這與種子老化過程中內源H2O2的影響一致，為深入探究H2O2影響種胚細胞AsA-GSH循環抗氧化性能的分子機制提供了理論依據，有利于燕麥種子的長期貯藏與科學利用。