貴州巖溶山區野生天藍苜蓿根瘤菌資源發掘、固氮特性及其多樣性研究

曾慶飛， 韋興迪， 韋 鑫， 歐二綾， 吉玉玉， 舒健虹， 龍忠富

(貴州省農業科學院草業研究所, 貴州 貴陽 550006)

貴州是位于我國西南部的一個唯一沒有平原支撐的低緯度高原山區省，也是喀斯特地貌發育最強烈、分布面積最大的典型區域。地勢、海拔差異和豐富的降雨量，形成了貴州極為明顯的立體氣候特征和植物種類的豐富多樣性[1]。貴州境內生長著多種天然野生豆科牧草，其中天藍苜蓿(Medicagolupulina)在全省范圍內廣為分布[2]。

天藍苜蓿是苜蓿屬一年生或越年生的優良野生草本植物，具有適應性廣、抗逆性強、匍匐生長、耐踐踏性好并能通過共生固氮提高土壤肥力等諸多優良特性，同時還是一種適口性好、粗蛋白含量高、粗纖維含量低的優質飼用牧草[3]。國內外針對天藍苜蓿的研究主要集中在地理分布、生物學特性及其在建植草坪綠地、護坡固土等栽培應用[4-6]，以及不同地區天藍苜蓿根瘤菌的系統發育、多樣性和宿主專一特性等方面。我國已有西北地區[7]、西藏林芝地區八一鎮[8]、云南部分地區[9]以及部分尾礦區[10-11]的天藍苜蓿根瘤菌系統發育和多樣性的研究報道。在貴州地區，林家棟等[2]對全省天藍苜蓿野生資源作過系統調查，統計結果顯示，省內從羅甸縣海拔520 m的低熱河谷地區到威寧縣海拔2 600 m的高寒地帶均有野生天藍苜蓿的分布，但是針對環境特殊且資源豐富的貴州巖溶山區天藍苜蓿根瘤菌尚缺乏具體的研究。

豆科植物與根瘤菌共生結瘤系統的有效形成是基于根瘤菌與豆科植物的相互識別與匹配，植物與根瘤菌之間存在著相對專一的共生范圍[12]；這一共生范圍受自然生態與地理環境的影響和控制，根瘤菌與豆科植物的共生關系因區域地理環境的差異而表現出不同的多樣性特征[13]。

本文從采自貴州省不同生態功能區域的野生天藍苜蓿根瘤樣品中分離、純化根瘤菌株，進行分子生物學鑒定及區系分布特征分析；并選擇來自不同地域、不同種類的天藍苜蓿根瘤菌，采用盆栽回接方法，結合菌株固氮酶活性的測定，篩選結瘤固氮能力強、植物促生效果好的優良根瘤菌株，以期探明貴州野生天藍苜蓿根瘤菌的資源特異性，并為地區農業及草地生態畜牧業的可持續發展，為喀斯特生態環境的重建與修復，提供可利用的共生微生物資源和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1根瘤樣品 34份野生天藍苜蓿根瘤樣品(置入變色硅膠管)采自貴州省黔東南、黔東北、黔北、黔西南和黔南地區19個縣(市)的4個不同生態功能區[14]，具體采集地點及根瘤樣品編號見圖1。

圖1 野生天藍苜蓿根瘤樣品編號及采集地點Fig.1 Root nodule sample numbers of wild Medicago lupulina and their sampling sites注：審圖號GS(2021)5448號；圖例中空白框代表沒有采集過樣品的區域Note:Drawing No. GS(2021)5448；The blank box in legend represented regions where no samples were collected

1.1.2牧草種子盆栽回接試驗 用百脈根(Lotuscorniculatus)種子(品種名：‘歌德’)購于貴陽霖卉園林綠化有限公司。

1.2 根瘤菌株的分離純化

將采集到的天藍苜蓿根瘤樣品用清水沖凈，吸水紙吸干表面水分后用無菌水浸泡過夜至吸脹狀態。挑取10～20顆碩大飽滿的單個根瘤放入無菌小燒杯中，用95%的酒精浸泡5 min，再換用0.1%的HgCl2繼續浸泡5 min，無菌水洗滌5～l0次；轉至無菌研缽中加入1 mL無菌水研磨，用移液槍將研磨液轉至加有剛果紅的酵母甘露醇瓊脂(Yeast mannitol agar,YMA)平板上，均勻涂布，28℃培養箱內恒溫倒置培養3～7 d，3 d后每天觀察1次。挑取菌落圓形、表面光滑隆起、略透明或半透明、濕潤黏稠、不吸色、邊緣整齊的典型單菌落，用平板劃線法接種于另一新的YMA平板上，28℃恒溫倒置培養，長出菌落后挑取單菌落用于革蘭氏染色鏡檢，直至獲得純化菌株。將純化菌株接種至YMA液體培養基中，28℃振蕩培養7 d后用30%甘油保種，-70℃超低溫冰箱中凍存。

1.3 根瘤菌株的鑒定與區系分析

1.3.1根瘤菌株的形態學鑒定 參照《微生物分類學》中原核細菌的鑒定方法[15]，對純化后染色鏡檢為紅色的革蘭氏陰性(G-)菌株進行菌體形狀、莢膜和鞭毛有無等形態特征的觀察。其中菌體形狀在革蘭氏染色鑒定時直接觀察；菌體莢膜采用石碳酸復紅染色液初染、黑色素復染方法，油鏡觀察菌體莢膜的有無(菌體呈紅色，莢膜無色，背景灰色或黑色)；鞭毛采用硝酸銀鞭毛染液染色法，油鏡觀察菌體鞭毛的有無(菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色)。

1.3.2根瘤菌株的16S rRNA基因序列比對 采用北京百泰克生物技術有限公司的細菌基因組DNA抽提試劑盒提取各菌株的總DNA，選用16S rRNA基因擴增通用引物對P1-P6擴增各菌株的16S rDNA片段；將純化回收的PCR產物與質粒PMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α；提取陽性轉化子的質粒DNA，酶切驗證后送昆明碩擎生物科技有限公司測序。利用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blast軟件將測得的各菌株序列分別進行在線比對，同時從GenBank數據庫中下載與待分析序列相近的已知種模式菌株的16S rDNA序列，將測得的菌株序列與模式菌株序列利用DNAMAN分析軟件進行多重比對后，確定各菌株的種屬分類地位。

1.3.3根瘤菌株的區系分析 根據分離菌株的系統發育分析結果，分別對貴州巖溶山區、貴州不同生態功能區中所分離鑒定到的天藍苜蓿根瘤菌的種屬組成、分離頻度以及優勢種類進行系統分析。分離頻度采用微生物區系分析普遍使用的相對頻率和絕對頻率中的相對頻率計算公式分別計算[16]：分離頻度(%)=(某個種出現的樣品數/總樣品數)×100%。

1.4 優良根瘤菌株的盆栽回接篩選

1.4.1供試菌株 鑒于菌株盆栽回接篩選實驗的龐大工作量，同一地域、同一宿主植物的同種根瘤菌株之間固氮促生功能與生理代謝的相似性，不同地理生態環境、不同種類的根瘤菌株之間代謝功能特性的差異性等特點[17]，本研究從已鑒定保存的根瘤菌株中優先選擇分離自不同地域、不同種類的具有代表性的天藍苜蓿根瘤菌作為盆栽篩選試驗的供試菌株。

1.4.2盆栽播種 選取發芽率正常的百脈根種子，經75%酒精2 min、3%次氯酸鈉10 min(玻璃棒攪拌2～3次)、無菌水清洗5～6次后，播種于盛有滅菌珍珠石的花缽中，置于人工氣候室中培養(溫度25℃、每天光照16 h)。1周左右種子發芽長出幼苗后澆Hoagland全營養液(上海國藥)，幼苗生長3周后去除弱苗劣苗，每盆保留生長健壯的10株幼苗用于菌液回接處理。

1.4.3菌液培養 從-70℃超低溫冰箱中取出用于篩選試驗的保種根瘤菌株，融化后無菌接種環蘸取菌液于YMA平板上劃線接種，28℃恒溫倒置活化培養，待長出菌落后挑取單菌落接種于500 mL YMA液體培養基中，28℃，200 r·min-1恒溫振蕩培養5～7 d。

1.4.4盆栽回接篩選 每個菌株菌液回接百脈根花盆為1個處理，澆灌無菌YMA液體培養基為空白對照(CK)，每個處理設置3個重復，菌液或培養基的回接量為50 mL·盆-1。回接后每隔1天澆灌10 mL Hoagland營養液保持基質濕潤。培養70 d，100 d后，以花盆基質表面的圓心為圓點，隨機畫出3條互為120度角的半徑線，以每條半徑線的中點處為取樣位點，在每一處理的每個重復中選取3個百脈根植株，再另選1個長勢適中的植株，共10個植株，取出沖洗干凈并吸干根表水分，統計總根瘤數及單株根瘤數的平均值；將10個植株的地上部分和地下根系分離，105℃烘箱中殺青30 min，降至85℃恒溫烘干12 h至恒重后，采用萬分之一電子天平稱重，計算單株地上生物量和地下生物量的平均值。

1.5 菌株的固氮酶活性測定

將全部待測菌株分別劃線接種于CCM培養平板上，28℃下恒溫倒置培養5～7 d，挑取單菌落接種至CCM液體培養基中，28℃，200 r·min-1恒溫振蕩培養5～7 d后，采用青島科創質量檢測有限公司的固氮酶(NITS)酶聯免疫分析試劑盒測定各菌株的固氮酶活性。以OD值為橫坐標，標準物的濃度為縱坐標，繪出標準曲線，通過標準曲線計算樣品中固氮酶(NITS)的活性濃度，其中回歸方程為Y=95.842 0x-3.958 5，R2=0.997 2。根據各菌株回接百脈根后的共生結瘤數、對植株地上地下部的促進生長量以及固氮酶活性的測定結果，篩選出優良固氮促生根瘤菌株。

1.6 數據統計分析

采用Excel 2010整理數據，選用LSD法對獲得的數據進行多重比較，同時使用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 分離獲得的根瘤菌菌株及其形態特征

從34份野生天藍苜蓿根瘤樣品中，經分離純化和革蘭氏染色鑒定，共獲得83個革蘭氏陰性(G-)純化菌株。對全部G-菌株進行菌體形態的觀察，顯示菌體形態均呈桿狀，長短不一，菌體表面有莢膜或無莢膜，但均有鞭毛，鞭毛周生、側生或端生，符合根瘤菌的基本形態特征。

2.2 根瘤菌株的種類鑒定與區系分析結果

利用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取83個G-保存菌株的總DNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，均形成23 kb左右的條帶。選用16S rDNA序列PCR通用引物對P1—P6，所有待測菌株均擴增出約1.5 kb的序列片段。根據16S rDNA序列測定比對結果，結合菌體的形態學特征，分離獲得的天藍苜蓿根瘤菌株的種屬鑒定結果見表1。鑒定結果顯示，83個G-菌株中共鑒定出根瘤菌69株，其余14個菌株屬于在根瘤內與根瘤菌一起共生的根瘤內生細菌。

表1 基于16S rDNA序列比對的天藍苜蓿根瘤菌株分子鑒定結果Table 1 Taxonomic identification results of rhizobial strains of Medicago lupulina based on 16S rDNA sequence alignment

續表1

將鑒定出的根瘤菌種類進行區系分析(表2)，結果顯示，分離獲得的野生天藍苜蓿根瘤菌分屬于6個屬25個種。6個屬分別為：根瘤菌屬(Rhizobium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。其中中華根瘤菌屬的分布頻率最高，達55.71%，為優勢屬；根瘤菌屬和假單胞菌屬次之，同為17.14%；25個種中的草木樨中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)分布頻率最高，達到38.51%，為優勢種。

表2 天藍苜蓿根瘤菌株區系分析結果Table 2 The result of floristic analysis of rhizobial strains of Medicago lupulina

本研究供試的34份野生天藍苜蓿根瘤樣品采自于貴州5個生態功能區中的4個區域，4個生態功能區天藍苜蓿根瘤菌的分類及種屬分布結果如表3。分析結果表明，東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態區中鑒定出的種類最多，包括6個屬中的24個種；其次是中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態區，共鑒定出Rhizobium，Sinorhizobium和Pseudomonas3個屬中的7個種；而西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環境生態區只鑒定出Sinorhizobium和Rhizobium2個屬中的3個種，南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態區僅鑒定出Sinorhizobium和Agrobacterium2個屬中的2個種。

表3 研究區野生天藍苜蓿根瘤菌種屬分布特征Table 3 Species distribution characteristics of wild Medicago lupulina rhizobia in the study areas

2.3 共生結瘤固氮高效根瘤菌株的篩選

根據天藍苜蓿根瘤菌的分離鑒定結果，按照不同地域和不同種類的挑選原則，共選出28個菌株作為篩選對象，分別為：ZLMR157-3，SSMR173-1，YEMR179-4，YLMR181-5，YHMR184-8，YMMR186-4，JMMR204-2，JMMR207-2，JMMR214-8，QCMR243-3，QCMR243-6，TFMR310-2，MXM R315-1，MLMR319-2，ZJMR341-3，ZWMR343-1，ZYMR346-1，ZYMR348-2，ZDMR352-1，WXMR364-1，WNMR367-1，WNMR367-2，WNMR367-3，WXMR380-2，WZMR395-2，WZMR395-3，DHMR424-1，DPMR429-1。

28個供試菌株菌液回接處理后，百脈根植株的根瘤平均數、地上部干重、地下部干重的測定結果見表4。與直接用無菌培養基澆灌的對照組(CK)相比，28個菌株都具有不同程度的共生結瘤和促生作用，單株平均結瘤數在9～53之間。對比根瘤數、地上部干重和地下部干重3項測定指標，發現其中9個菌株(ZLMR157-3，SSMR173-1，YLMR181-5，JMMR204-2，JMMR207-2，TFMR310-2，ZDMR352-1，WXMR380-2和WZMR395-2)的結瘤促生效果與對照和其余19個供試菌株呈顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)的差異；9個優良菌株中又有5個菌株(SSMR173-1，YLMR181-5，JMMR204-2，TFMR310-2和WZMR395-2)的結瘤數和促生效應與其余4個菌株差異顯著(P<0.05)，與對照和另外19個供試菌株的差異達極顯著水平(P<0.01)。

表4 百脈根盆栽回接篩選試驗測定結果Table 4 The determination results of the potted back inoculation and screening test of Lotus corniculatus

2.4 供試菌株固氮酶的活性

28個供試菌株固氮酶活性的測定結果見表5，供試根瘤菌株均具有固氮酶活力(27.85～265.61 IU·L-1)。不同菌株之間的固氮酶活性存在差異，其中促生效果較好的9個菌株的固氮酶活性也相對較高(208.73～266.33 IU·L-1)，活力大小順序為：TFMR310-2>YLMR181-5>SSMR173-1>WZMR395-2>WXMR380-2>ZLMR157-3>JMMR207-2>ZDMR352-1，與其余19個菌株均呈顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)的差異。

表5 供試根瘤菌株固氮酶活性測定結果Table 5 Measured result of nitrogenase activity of the experimental rhizobium strains 單位:IU·L-1

綜合促生效果與結瘤固氮能力，在28個供試菌株中，分別分離自思南沙溝、印江朗溪、江口閔孝、天柱鳳溪和威寧中水天藍苜蓿根瘤樣品的5個菌株SSMR173-1，YLMR181-5，JMMR204-2，TFMR310-2和WZMR395-2具有最高的固氮酶活性以及最強的結瘤促生能力，屬于供試菌株中的最優固氮根瘤菌株；另外，分別分離自貞豐連環、江口民和、鎮遠大地和威寧秀水的4個菌株ZLMR157-3，JMMR207-2，ZDMR352-1和WXMR380-2，與除5個最優根瘤菌株以外的其余19個菌株的促生效果和結瘤固氮能力均呈現顯著或極顯著的差異，屬于篩選出的優良根瘤菌株。

3 討論

天藍苜蓿作為一種適應性極強的野生豆科草本植物，在我國除青藏高原的高寒地區和荒漠以外，其余各地均有分布[18-19]，暗示其蘊藏著豐富的共生微生物資源。2008年，馮春生[7]采用數值分類法及分子生物學技術，對分離自我國西北地區的67株天藍苜蓿根瘤菌進行了系統發育分析，表型分群方法和遺傳分群方法一致表明，各代表菌株形成了根瘤菌屬(Rhizobium)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)和中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)3個系統發育分支，而大部分菌株屬于草木樨中華根瘤菌(S.meliloti)；同年，位秀麗[10]對西北尾礦區天藍苜蓿根瘤菌的多樣性進行了研究，通過多相分類方法和系統發育分析發現，69株供試天藍苜蓿根瘤菌同樣被分別劃分在中華根瘤菌屬、根瘤菌屬和土壤桿菌屬，其中64株屬于中華根瘤菌屬。兩個研究結果顯示，與天藍苜蓿共生的根瘤菌種類較為專一。2009年張斌等[9]采用boxA1R單引物對分離自云南省楚雄州、德宏州、玉溪市、文山州及紅河州部分地區天藍苜蓿及南苜蓿根瘤的90株根瘤菌進行BOX-PCR分析和聚類分析，發現天藍苜蓿根瘤菌可細分為7個遺傳群，顯示與天藍苜蓿共生的根瘤菌又具有豐富的遺傳多樣性。

本研究從貴州巖溶山區分離到的天藍苜蓿根瘤菌中，也包含有中華根瘤菌屬、根瘤菌屬和土壤桿菌屬的種類，其中中華根瘤菌屬在全部6個屬中所占比例最大，草木樨中華根瘤菌在所有25個種中的比例也最高，它們是天藍苜蓿根瘤菌中的優勢屬和優勢種；對分離自貴州4個生態功能區中的天藍苜蓿根瘤菌分別進行區系分析發現，不同生態功能區所鑒定出的屬種數量各不相同，但是每一個功能區中都包含有中華根瘤菌屬和草木樨中華根瘤菌的種類。說明中華根瘤菌屬以及其中的草木樨中華根瘤菌是與天藍苜蓿較為專一的共生根瘤菌種類，這一結果與馮春生[7]、位秀麗[10]的研究結論是一致的。而另一方面，除中華根瘤菌屬、根瘤菌屬和土壤桿菌屬的種類以外，本研究在貴州天藍苜蓿根瘤菌中同時還鑒定出假單胞菌屬(Pseudomonas)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)的種類存在，這一結果又與張斌等的研究結論有相似之處。這進一步說明，每一種豆科植物，除了存在與其較為專一的共生根瘤菌種類以外，生態地理環境對共生根瘤菌的多樣性也存在著深刻的影響[20]。貴州省生態環境復雜多樣，不同生態功能區域中不同的地理生態條件導致不同種類的根瘤菌會與天藍苜蓿共生結瘤，從而形成了貴州巖溶山區天藍苜蓿根瘤菌特定的豐富多樣性，這也更加證實了陳文新等關于根瘤菌與豆科植物的共生關系會因區域地理環境的差異而呈現出不同多樣性的科學觀點。

從科學理論的角度講，每一種植物分離出的根瘤菌，首先應該回接該種植物，但由于本研究的篩選試驗是與分離自貴州多花木藍和葛藤的根瘤菌同時進行的，目的是為了篩選獲得寄主識別范圍廣、結瘤固氮能力強的抗逆高效根瘤菌株，因此一并選擇了既是一種優良豆科牧草和飼用植物[21]又是一種水土保持性能良好的抗逆先鋒植物的百脈根[22]作為回接宿主植物。這是鑒于生產應用目的的考慮，但是將根瘤菌株回接其分離宿主植物的科學價值還是不可忽略的，本研究將在下一步繼續開展利用篩選出的優良固氮菌株回接天藍苜蓿的后續試驗，以對優良菌株的結瘤促生特性作出進一步的鑒定。

本研究根據共生結瘤數、對共生宿主植物的促生效果以及菌株本身的固氮酶活性三項參數，篩選獲得了9株促生固氮效果良好的根瘤菌，其中有5株被鑒定為優良菌株中的最優固氮根瘤菌，它們的固氮酶活性以及對宿主植物的促生長率都與另外4個優良菌株呈現出顯著水平的差異。本文對固氮酶活性的測定是在獨立培養菌株的條件下進行的，有研究者認為，根瘤菌是在與豆科植物共生的情況下行使生物固氮功能的，單獨測定根瘤菌株的固氮酶活力未必能夠代表共生根瘤菌的固氮能力。但是，Pagan[23]研究報道中提出，根瘤菌獨立生長時在一定的環境條件下其固氮酶活性也能表達，這一發現突破了根瘤菌只有與高等植物共生才能固氮的概念。與共生條件下相比，采用生物試劑盒對獨立菌株固氮酶活力的測定值可能偏低，但它在一定程度上依然能夠反映出根瘤菌的共生固氮能力[24]。本研究篩選出的9個優良菌株的結瘤促生效果及固氮酶活性均與其余19個供試菌株的差異達顯著或極顯著水平，表明篩選的結果能作為貴州巖溶山區草地生態畜牧和喀斯特環境修復的共生微生物資源。

4 結論

貴州天藍苜蓿根瘤菌主要包括中華根瘤菌屬、根瘤菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、中慢生根瘤菌屬和慢生根瘤菌屬6個屬的25個種，其中中華根瘤菌屬是優勢屬，草木樨中華根瘤菌是優勢種，采樣涉及的4個生態功能區域中天藍苜蓿根瘤菌的種屬數量和區系分布特征存在著明顯的差異性。

從分離鑒定的天藍苜蓿根瘤菌中，優先選擇28個來自不同地域和不同種類的菌株作為篩選對象，其中9個菌株(ZLMR157-3，SSMR173-1，YLMR181-5，JMMR204-2，JMMR207-2，TFMR310-2，ZDMR352-1，WXMR380-2和WZMR395-2)對多年生優良豆科飼用牧草百脈根具有良好的共生結瘤和固氮促生效果，具有開發應用潛力。