谷氨酸棒桿菌中基因NCgl2632的敲除和過表達對三種外源蛋白表達的影響

張琦，劉秀霞，楊艷坤，白仲虎*

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫,214122)2(江南大學,糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫,214122)3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫,214122)

谷氨酸棒桿菌是一種來源于土壤的革蘭氏陽性菌，由于其無內毒素、胞外幾乎無水解酶活性等優點，現在被作為工業生產菌株來發酵生產蛋白質的應用已經越來越廣泛。作為一種被廣泛應用于蛋白生產的表達宿主，對其蛋白編碼基因的改造具有相當高的實際應用前景[1-2]。

在實驗室的前期工作中，我們通過轉錄組數據分析發現了NCgl2632可能是影響谷氨酸棒桿菌能量代謝的關鍵基因之一[3]，NCBI預測基因NCgl2632預測編碼乙酰輔酶A酰基轉移酶[4]，乙酰輔酶A酰基轉移酶催化蛋白質的酰基化和去酰基化已成為真核生物蛋白質修飾中最普遍的方式之一[5]。乙酰輔酶A乙酰轉移酶(acetyl CoA acetyltransferase, AACT)也稱為乙酰乙酰輔酶A硫解酶，可以催化2個乙酰-CoA分子的縮合形成乙酰乙酰-CoA[6]。在原核生物中，AACT催化聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)是生物合成的第一步。來自微生物中乙酰-CoA的常見PHB生物合成包括3個基本酶促步驟：縮合，還原和聚合。乙酰輔酶A酰基轉移酶是催化聚羥基丁酸酯合成的第一步。乙酰輔酶A酰基轉移酶(3-ketothiolase, PhaA)負責2個乙酰-CoA部分縮合成乙酰乙酰-CoA。乙酰乙酰輔酶A還原酶(acetoacetyl-CoA reductase, PhaB)將乙酰乙酰-CoA還原為3-羥基丁酰-CoA，然后PHB合酶(PHA synthase, PhaC)催化3-羥基丁酰基-CoA的聚合以合成PHB[7]。目前PHB合成途徑已在多種原核生物中實現表達，并且能和其他多種產物共同生產[8-10]。而谷氨酸棒桿菌野生型菌株中由于缺乏PHB合成酶基因，無法產生PHB[11]。

蛋白human MutT homolog 1(hMTH1)是一種氧化核苷酸三磷酸的水解酶。細胞中活性氧所產生的氧化性DNA損傷會導致突變或細胞死亡，8-氧代鳥嘌呤(8-oxo-dGTP)是一種主要的氧化性DNA 損傷產物，由于其堿基配對的特性，可引起A∶T到C∶G或G∶C到T∶A的突變[12-13]。hMTH1廣泛分布于線粒體和細胞核中，可以水解復制過程中氧化的核苷酸三磷酸，將8-oxodGTP和其他氧化的dNTP水解為單磷酸形式，然后將其排到細胞外基質中，從而防止它們摻入DNA并導致G到T的轉化，防止癌細胞中致命的DNA損傷[14-18]。目前，在人體和動物細胞中開發hMTH1抗體以研制針對癌癥和腫瘤細胞藥物的研究已經非常廣泛[19-21]。但是，在原核細胞中關于hMTH1的表達的報道卻很少，該蛋白作為1個小分子新型蛋白，同時也有相當的藥用潛力，值得在谷氨酸棒桿菌中嘗試表達研究。

本研究針對基因NCgl2632進行了過表達和敲除改造，檢測了改造菌株中生長曲線和胞內ATP水平的變化，同時檢測了表達不同外源蛋白的差異，在此基礎上敲除基因NCgl0909進行共同改造，并選取了新蛋白hMTH1進行了表達驗證，最終針對雙敲除菌株表達該蛋白進行了發酵培養基配比優化。

1 材料與方法

1.1 主要材料

谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647、大腸桿菌DH5α，由本實驗室保存；谷氨酸棒桿菌C.g15647ΔNCgl0909，由本實驗室構建；本文中所用的引物全部由蘇州金唯智公司合成，如表1所列；EcoR I、Hind Ⅲ、XbaⅠ、SmaⅠ等本研究所用到的限制性內切酶，賽默飛世爾科技(中國)有限公司(Thermo Fisher Scientific)；高保真酶PrimerSTAR Max Premix、Ligation連接酶，大連寶生物有限公司(TaKaRa)。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2 敲除菌株的構建

利用同源重組的方法對谷氨酸棒桿菌野生型菌株的目的基因進行敲除。以谷氨酸棒桿菌的基因組為模板，用引物Ko-gene-LF，Ko-gene-LR和Ko-gene-RF，Ko-gene-RR分別擴增左右同源臂。驗證條帶大小正確無誤后，使用純化試劑盒回收得到左同源臂和右同源臂。再以回收后的左右同源臂為模板PCR擴增，回收得到左右同源臂無縫連接的融合片段。最后雙酶切融合片段和載體pK18得到線性化的載體和具有相同黏性末端的同源修復片段，連接后轉入大腸桿菌。

1.3 敲除菌株的篩選

(1)將平板上長出的單菌落同時點在LBB+K和LBB+K+蔗糖的平板上進行蔗糖敏感性篩選，在30 ℃培養箱里倒置培養24 h，挑選對應的在LBB+K+蔗糖不長的但在LBB+K上長的菌落，接種于LBB液體培養基，30 ℃培養16 h；

(2)將菌液轉接到LBB+蔗糖的液體培養基中，在30 ℃培養16 h后劃線到LBB+蔗糖固體平板上；

(3)挑取LBB+蔗糖固體平板上長出來的劃線單菌落，分別點到LBB和LBB+K固體平板上，挑選LBB平板上對應在LBB+K上不長的單菌落進行菌落PCR驗證；

(4)使用敲除驗證引物Ko-gene-LF、Ko-gene-RR作為PCR驗證引物，對照為野生型菌株，通過凝膠電泳驗證擴增產物的條帶大小。

1.4 谷氨酸棒桿菌表達目的蛋白

在30 ℃，220 r/min搖床中培養種子液14 h，按接種量1%轉接后加入誘導劑IPTG(終質量濃度為24 g/mL)，培養24 h，收獲菌體和上清液用于后續的測定實驗。

1.5 發酵樣品的SDS-PAGE和Western blot驗證

(1)取發酵全菌，破碎上清液分別與5×的Loading Buffer預混合完全，放置于100 ℃的沸水浴中保溫5 min，取出后冷卻2 min進行電泳，120 V電泳連續跑90 min。結束后倒入考馬斯亮藍染色液進行染色15 min，之后加入脫色液重復脫色直至背景清晰用凝膠成像儀拍照。

(2)根據蛋白Marker的條帶和目的蛋白大小切下膠條，采用濕轉法進行轉膜，放置順序為負極-濾紙-膠條-聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜-濾紙-正極，切下對應大小的PVDF膜先用甲醇活化5 s，濾紙、膠條、PVDF膜都事先在濕轉緩沖液中浸濕，轉膜條件為恒流300 mA，90 min。將轉好的PVDF膜用TBST洗5 min后加到5%牛奶中置于水平搖床封閉1 h，TBST洗1遍后加到含萬分之一抗體的5%牛奶中置于水平搖床孵育1 h，TBST洗3遍，用ECL顯色盒進行顯色。

1.6 蛋白hMTH1的酶活性檢測

本實驗所用人8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶(hMTH1)酶聯免疫吸附測定試劑盒購于江萊生物。取菌體量為10的新鮮收獲的發酵液12 000 r/min，離心2 min，棄上清液，菌體用PBS緩沖液洗3次，最后用1 mL的PBS重懸菌體，使用超聲波破碎儀破菌，功率為25%，程序設定為每破碎1 s停止2 s，總共破碎6 min至破碎液澄清透明后立即放于冰上，4 ℃，12 000 r/min，離心2 min，取上清液作為待檢測的蛋白樣品。將準備好的蛋白樣品和標準品各50 μL按順序加入96孔酶標板，然后分別加入帶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的檢測抗體100 μL，并在37 ℃恒溫孵育60 min，棄去液體后用洗滌液重復5次洗凈酶標板，每孔加入底物后在37 ℃避光孵育15 min。最后加入終止液后在450 nm處測定OD值并繪制曲線，每個實驗組有3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 基因NCgl2632的生物信息學分析

對基因NCgl2632進行生物信息學分析，在NCBI的Genbank查詢得知該基因長度為561 bp，通過CD seach分析發現沒有類似的保守區域，也沒有發現跨膜結構域及糖基化位點。通過疏水性分析，發現該蛋白偏向親水。該基因所編碼的蛋白質長度為186個氨基酸，蛋白大小為21 kDa，正負電荷殘基總數都為19，理論等電點PI值為7.06，通過蛋白質二維結構分析，發現有47個氨基酸形成α螺旋，占25.27%；12個氨基酸形成β轉角，占6.45%；52個氨基酸形成延伸鏈，占27.96%；75個氨基酸形成無規則折疊，占40.32%。通過swiss-model對該蛋白進行三維建模，結果如圖1所示。NCBI對該蛋白的注釋為乙酰輔酶A酰基轉移酶。

a-蛋白序列分析；b-蛋白二級結構分析；c-蛋白疏水性分析；d-蛋白三級結構建模圖1 NCgl2632基因編碼蛋白的生物信息學分析Fig.1 Bioinformatics analysis of the protein encoded by the gene NCgl2632

2.2 基因NCgl2632的過表達和敲除對生長水平和胞內ATP水平的影響

分別以質粒pECXK99E為過表達基因的表達載體，質粒pK18 mobsacB為同源重組敲除基因的自殺質粒，成功構建了基因NCgl2632的過表達和敲除菌株。將得到的菌株進行搖瓶培養，對48 h內菌株生長的OD600值和胞內ATP進行測定，同時以谷氨酸棒桿菌野生型和帶有質粒pECXK99E的菌株為對照組，結果如圖2、圖3所示。

由圖2可知，基因過表達菌株與加入pECXK99E空載體的野生型對照相比生長曲線差異不大，而基因敲除菌株與野生型對照相比生長穩定期時的最大菌體濃度略有提升。

由圖3可知，基因過表達和敲除菌株和對照相比胞內ATP水平都沒有明顯變化。

圖2 NCgl2632基因不同表達水平的菌株生長曲線Fig.2 The growth curve of the mutant strains of the gene NCgl2632注：WT：野生型C.g 15647；ΔNCgl2632:C.g 15647ΔNCgl2632;WT+pECXK99E；加入過表達質粒pECXK99E空載體的野生型C.g 15647；Over-NCgl2632：C.g 15647-Over-NCgl2632(下同)

圖3 NCgl2632基因不同表達水平菌株的胞內ATP水平Fig.3 Intracellular ATP level of the mutant strains of the gene NCgl2632

2.3 基因NCgl2632的過表達和敲除對蛋白增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)和重鏈抗體可變區(variable domain of heavy chain antibody，VHH)表達的影響

增強型綠色熒光蛋白eGFP作為最常見的模式蛋白，可以很方便地驗證菌株表達外源蛋白的強弱。圖4為基因NCgl2632的過表達和敲除菌株表達胞內eGFP得到的熒光強度比較。可以看出過表達基因NCgl2632和加空載的野生型對照相比熒光強度有明顯下降，而敲除基因的重組菌株與野生對照相比差距并不大。

圖4 NCgl2632基因不同表達水平菌株的胞內eGFP熒光強度Fig.4 Intracellular eGFP fluorescence intensity of the mutant strains of the gene NCgl2632

同時，我們還選取了誘導型VHH蛋白來進行驗證。圖5為基因NCgl2632的過表達和敲除菌株表達VHH得到的SDS-PAGE和Western blot結果圖。

分析結果可以看出，單獨敲除基因NCgl2632和野生型相比，表達分泌VHH的能力有明顯增強，而過表達基因NCgl2632和加空載的對照相比表達能力略有降低。

M-marker；1-表達VHH蛋白的野生型C.g 15647；2-表達VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632；3-表達VHH蛋白的加空載pECXK99E的野生型；4-表達VHH蛋白的C.g 15647-Over-NCgl2632；5-陰性對照圖5 SDS-PAGE和Western blot檢測NCgl2632基因不同表達水平菌株發酵上清液中VHH的表達情況Fig.5 SDS-PAGE and Western blot for VHH expression in fermentation supernatant of mutant strains with different expression levels of the gene NCgl2632

綜上，通過檢測基因NCgl2632改造菌株中外源蛋白表達能力的變化，發現過表達菌株表達蛋白的能力并沒有提升，而敲除菌株在表達分泌VHH蛋白時表達量提高。因此，我們推測敲除該基因會降低胞內乙酰輔酶A酰基轉移酶的含量，從而將浪費在合成乙酰乙酰輔酶A的乙酰輔酶A釋放到三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環中，為合成氨基酸提供更多的底物，從而提升外源蛋白的產量。

2.4 基因NCgl2632和基因NCgl0909的雙敲除對VHH和hMTH1的表達影響

在實驗室前期工作中分析NCgl0909可能也是影響外源蛋白表達的關鍵基因之一[3]，而后續的實驗表明基因NCgl0909負責編碼ABC轉運體，參與谷氨酸棒桿菌中特定底物的跨膜轉運，并且發現基因NCgl0909的敲除表型比較有利于外源蛋白表達水平的提高[22]。

因此，本實驗中同時對基因NCgl2632和基因NCgl0909進行了共同改造，選取了NCgl0909的現有敲除菌株作為出發菌株構建了C.g15647NCgl2632ΔNCgl0909雙敲除菌株，并在此基礎上構建了VHH的表達菌株。圖6為C.g15647NCgl2632和C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909表達VHH得到的SDS-PAGE和Western blot結果圖。

通過分析得知，雙敲除菌株表達分泌VHH的能力比單獨敲除NCgl2632和單獨敲除NCgl0909的菌株都強。

M-marker；1-陰性對照；2-表達VHH蛋白的野生型C.g 15647；3-表達VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632；4-表達VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl0909；5-表達VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909圖6 SDS-PAGE和Western blot檢測基因NCgl2632和基因NCgl0909雙敲除菌株發酵上清液中VHH的表達情況Fig.6 SDS-PAGE and Western blot for VHH expression in fermentation supernatant of C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909

為了進一步驗證雙敲除菌株對外源蛋白表達方面有利影響的普適性，這里選用一種大小為23.5 kDa左右的新蛋白hMTH1進行表達測試。構建了pXMJ19-hMTH1的表達質粒，30 ℃發酵24 h后取全菌和破碎上清液進行了SDS-PAGE和Western blot分析。圖7為C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909雙敲除菌株表達hMTH1得到的SDS-PAGE和Western blot結果圖。

根據Western blot結果可以得知，雙敲除菌株表達hMTH1的能力比單獨敲除NCgl2632和單獨敲除NCgl0909的菌株都強。

2.5 hMTH1蛋白活性的檢測

使用hMTH1酶聯免疫吸附測定試劑盒對改造后谷氨酸棒桿菌中發酵的hMTH1進行活性檢測，通過捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，并加入樣品與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物顯色。底物在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在450 nm處測定吸光度，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，每個實驗組包含3個平行數據，以稀釋后的標準樣品作為空白對照。如圖8所示，最終測出野生型谷氨酸棒桿菌中發酵液的破碎上清液中蛋白hMTH1的活性為32.3 U/L，而雙敲除菌株的破碎上清液中蛋白hMTH1的活性為43.4 U/L。

M-marker；1-陰性對照的破碎全菌；2-表達hMTH1蛋白的野生型C.g 15647的破碎全菌；3-表達hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632的破碎全菌；4-表達hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl0909的破碎全菌；5-表達hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909的破碎全菌;6-陰性對照的破碎上清液；7-表達hMTH1蛋白的野生型C.g 15647的破碎上清液；8-表達hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632的破碎上清液；9-表達hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl0909的破碎上清液；10-表達hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909的破碎上清液圖7 SDS-PAGE和Western blot檢測基因NCgl2632和基因NCgl0909雙敲除菌株發酵全菌和破碎上清液中hMTH1的表達情況Fig.7 SDS-PAGE and Western blot for hMTH1 expression in fermented bacteria and crushed supernatant of the gene NCgl2632 and gene NCgl0909 co-knockout strain

陰性對照-稀釋過的標準樣品；WT+hMTH1-表達hMTH1的野生型C.g 15647；ΔNCgl2632ΔNCgl0909+hMTH1-表達hMTH1的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909圖8 雙敲除菌株的破碎上清液中蛋白hMTH1的活性Fig.8 Enzyme activity of protein hMTH1 in the crushed supernatant of the co-knockout strain

2.6 hMTH1蛋白的發酵培養基配比優化

通過上述實驗可以得到用NCgl2632和NCgl0909雙敲除菌株表達hMTH1蛋白的產量相比野生型有較大提高，可以在此菌株的基礎上對發酵培養基進行進一步優化，以得到更高的蛋白表達量。谷氨酸棒桿菌細胞生長和外源蛋白的表達需要合適的培養基碳氮濃度和碳氮比，碳氮比過高可能會導致代謝不平衡，碳氮比過低容易導致菌體自溶。

通過篩選，確定了葡萄糖、玉米粉作為碳源，硫酸銨、尿素作為氮源，對選定的4個因素，設定了2個濃度梯度水平，分別是葡萄糖質量濃度80、120 g/L，玉米粉質量濃度5、10 g/L，硫酸銨質量濃度20、30 g/L，尿素質量濃度0、10 g/L。使用JMP軟件中的定制設計對4個因子2個水平進行實驗設計，得到12組實驗組合，以終生物量OD600值和單位OD值目標蛋白hMTH1的相對蛋白量為響應變量。

按照設計配制不同營養成分配比的培養基，不同培養基中分別接種C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909-hMTH1，30 ℃，200 r/min，發酵48 h后取樣分別測定菌體OD600值，結果如表2所示。取菌體量OD值為10的菌液進行破碎，取破碎液上清液進行Western blot檢測，使用ImageJ軟件對Western blot結果進行灰度分析，計算得到單位OD值的hMTH1蛋白量，結果如表2所示。第1種模式的情況下菌體的OD600值最高，為12.4，且單位OD值下的hMTH1蛋白量最高為1.875。對照組為使用基礎LBB培養基在相同的培養溫度和培養時間下培養的相同改造菌株，對照組的OD600值為9.68，單位OD值的蛋白表達量為1，第1種模式下的hMTH1蛋白表達量是對照組的1.875倍。

表2 培養基成分優化參數實驗Table 2 Experimental of optimization parameters of medium composition

用JMP軟件對結果進行標準最小二乘法擬合模型分析，可得到參數估計值如表3所示，概率表征了各因素對結果的影響程度，當概率<0.05時為顯著影響，當概率<0.01時為極顯著影響。由表3可知尿素的概率為0.002 7，說明影響效果最為顯著，葡萄糖概率為0.150 5，效果第二顯著，玉米粉的t比為負數說明與結果負相關，同時概率最大為0.874 7說明影響最不顯著。

表3 培養基成分優化參數篩選結果Table 3 Medium component optimization parameter screening result

由圖9培養基成分優化參數預測圖可知，葡萄糖含量增加對響應值有不明顯的增加，而尿素則會對2種響應值有較強的正向促進影響，玉米粉和硫酸銨的濃度增加對OD值和蛋白量的影響都很微弱。

綜上，培養基的成分配比可以確定為葡萄糖質量濃度為120 g/L，玉米粉質量濃度5 g/L，硫酸銨質量濃度30 g/L，尿素質量濃度10 g/L。選用優化后的培養基進行hMTH1的發酵，宿主菌為C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909，發酵條件為100 mL培養基在30 ℃、220 r/min下搖瓶培養48 h。使用hMTH1酶聯免疫吸附測定試劑盒對菌體的破碎上清液進行檢測發現hMTH1的活性為60.2 U/L。

圖9 培養基成分優化參數預測刻畫圖Fig.9 Medium composition optimization parameter prediction characterization

3 討論

基因NCgl2632的單獨改造對谷氨酸棒桿菌的發酵過程中生理參數的影響并不大，但這并不能說明該基因對谷氨酸棒桿菌基因組的優化毫無作用，該基因編碼的乙酰輔酶A酰基轉移酶雖然會影響胞內乙酰輔酶A的含量，進而會使TCA循環的乙酰輔酶A通量產生變化，但由于細胞本身的代謝調控機制過于復雜，少量代謝中間物的通量變化可能會由別的通路代償；而谷氨酸棒桿菌野生型菌株中由于缺乏PHB合成酶基因，無法產生PHB，所以乙酰輔酶A酰基轉移酶所催化的PHB合成反應在野生型菌株中是被阻斷的，因此該基因改造后的表型的整體生長狀態差別不大，但通過幾種不同的外源蛋白表達來進行驗證后發現，總體來說可以推論敲除基因NCgl2632對類似大小的外源蛋白產量提升是有有利影響的。

同時由于實驗室的前期工作中發現了NCgl0909的敲除表型也是有利于外源蛋白產量提升，因此我們構建了2個基因的共敲除菌株以獲得更優蛋白表達宿主，并選擇了新蛋白hMTH1在多基因改造菌株對蛋白表達影響的普適性進行了驗證，最終對發酵培養基進行了優化得到了最適合雙敲除菌株表達hMTH1的發酵培養基配比。

但是本文的研究存在很多不足，例如：雖然我們知道了敲除基因NCgl2632對蛋白表達有一些有利影響，但是并沒有深入研究具體的代謝調控機制，只能針對結果進行相應的分析。此外，由于實驗條件的限制，本文只是將hMTH1在胞內上清液中進行了可溶表達，如何將它分泌出胞外并增大該蛋白的表達量有待在接下來的實驗中近一步研究。