電子束輻照預處理對核桃青皮活性物提取及其抑菌活性的影響

喜梅花，候妤婕，沈荷玉，蔡瑩瑩，敖婧芳，白俊青，蔚江濤，羅安偉*

1(西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 咸陽，712100)2(楊凌核盛輻照技術有限公司，陜西 咸陽，712100)

目前，我國核桃總產量位居世界第一，同時核桃品種多、資源豐富[1]。核桃青皮具有較強的抑菌和抗氧化活性，這歸因于天然活性物質的存在，如多酚、黃酮、三萜等[2-3]。然而，核桃青皮經常被當作農業廢料處理，造成極大的浪費。合理開發利用核桃青皮中天然產物資源極具前景和意義，既能減少環境污染，又能創造良好的社會經濟效益。

近年來，電子束輻照預處理技術成為提高某些化合物含量和生物活性的有效手段。電子束輻照是一種電離能，可應用于提取前處理和材料改性，具有對環境影響小、滲透能力低、能量低等優點；另一方面，研究者們發現其可通過降解、破壞植物細胞壁化學結構，促進活性物質溶出，進而提高活性物質的提取效果和功能活性。具體來說，電子束輻照預處理可以通過降解木質纖維素中的木質素而破壞細胞壁內的化學結構，降低纖維素的聚合度[4-6]。如，電子束輻照預處理已成功應用于提高羅望子中多糖和藜麥中的多酚、類黃酮和脂肪酸的提取。何毅等[7]發現該技術可提高麥冬總皂苷含量，BAK等[8]證明當電子束輻照劑量為80 kGy時，水稻中纖維素酶活性顯著提高。但是，電子束輻照預處理如何提高核桃青皮生物活性物質的含量及其抑菌活性鮮有報道。

因此，本文以核桃青皮為原料，經電子束輻照預處理后對其進行結構表征，采用超聲波輔助提取法制備核桃青皮提取物。探究電子束輻照預處理對核桃青皮活性物含量的影響，為有效利用核桃青皮及拓寬電子束輻照技術在高效提取植物活性物質中的應用提供科學理論依據。此外，還考察了經電子束輻照預處理的核桃青皮提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和沙門氏菌的抑菌活性，為開發核桃青皮天然抑菌產品提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

核桃青皮：新新2號核桃品種的成熟外果皮，于2020年8月購自西安雨潤批發市場。

供試細菌：金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、蠟樣芽孢桿菌(ATCC 14579)、大腸桿菌(ATCC 25922)、沙門氏菌(ATCC 14028)，由西北農林科技大學食品科學與工程學院微生物實驗室提供。

食子酸、蘆丁、齊墩果酸標準品(純度≥98%)、其他化學試劑(分析純),上海源葉生物科技有限公司(中國上海);LB肉湯培養基,青島高科技工業園海博生物技術有限公司;LB瓊脂培養基,北京陸橋技術股份有限公司;pH=7.2 PBS緩沖溶液、無菌水。

1.1.2 儀器與設備

ESS-010-03電子直線加速器,楊凌核盛輻照有限公司;場發射掃描電子顯微鏡,美國FEI公司;KQ-700DE數控超聲波清洗器,上海佑科儀器有限責任公司;RE-52AA旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠;Varioskan las熒光酶標儀,美國Thermo;高分辨離子淌度液質聯用儀HRLCMS,美國應用生物系統公司;Philips X′ pert pro PW1730 X射線衍射儀,阿姆斯特丹(荷蘭);SW-CJ-1D凈化工作臺,蘇州凈化設備有限公司;DHP9025電熱恒溫生化培養箱,上海一恒科技有限公司;WGL-230B電熱鼓風干燥箱,北京科偉永興儀器有限公司;TDL-5-A離心機,上海安亭科學儀器廠;Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀,芬蘭華萊公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃青皮電子束輻照預處理

將核桃青皮自然晾曬干燥(水分含量≤10%)，粉碎過60目篩。核桃青皮粉末經藥用PE自封袋封裝，每袋0.5 kg，厚度1～2 cm，單層擺放于輻照托盤中，置于傳送帶上送入輻照室進行輻照處理。輻照裝置為ESS-010-03電子直線加速器，額定能量10 MeV、功率10 kW，掃寬800 cm，束流2 mA。輻照劑量分別設計為0、10、20、30、40 kGy，每個劑量各2袋，輻照時放入劑量片以計算各樣品輻照的實際吸收劑量。對應輻照劑量的實際吸收劑量分別為0、10.26、20.59、30.79、41.18 kGy，因輻照劑量和吸收劑量差異不顯著，本文圖、表中的劑量均以輻照劑量標注。

1.2.2 核桃青皮結構表征

通過X射線衍射、電鏡掃描對1.2.1得到的樣品進行結構觀察[9]，分析電子束輻照對核桃青皮組織結構和細胞壁的破壞效果。采用X射線衍射儀，在5°～60°(2θ)，步長0.05°(2θ)范圍內，得到核桃青皮的X射線衍射譜圖。掃描電鏡法分析電子束輻照前后核桃青皮表面物相結構，電鏡工作電壓為5 kV、放大1 600倍。

1.2.3 多酚、黃酮、三萜類活性物提取工藝

參照徐亞飛等[10]方法并稍作改進。按照1.2.1方法，稱取樣品1.00 g，以料液比1∶40(g∶mL)加入體積分數75%乙醇溶液，在溫度50 ℃，超聲功率490 W，超聲提取120 min。8 000 r/min離心10 min，上清液于旋轉蒸發儀上減壓濃縮回收溶劑至近干，得到核桃青皮提取物。

1.2.4 多酚、黃酮、三萜含量測定

總多酚含量的測定采用改進的Folin-Ciocalteu法[11]。總黃酮含量的測定采用改進的硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[12]。總三萜含量測定采用改進的香草醛-冰醋酸比色法[13]。

1.2.5 核桃青皮活性物的組分分析

供試液：以30 kGy電子束輻照預處理的核桃青皮粉末為原料，參照1.2.3超聲條件進行提取，色譜甲醇溶解。

色譜條件[14]：采用超高效液相系統[Shimadzu，LC-30A，(ultra high performance liquid chromatography，UHPLC)]進行組分分析，UHPLC色譜柱為Shim-pack Velox C18柱(150 mm× 2.1 mm，2.7 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，洗脫梯度為0 min，5%B；0～5 min，5%～40%B；5～25 min，40%～85%B；25～45 min，85%～95%B；45～50 min，95%B；流速為0.6 mL/min，進樣體積為10 μL，檢測波長為254 nm，柱溫為30 ℃。

質譜條件：采用超高效液相系統配備高分辨率質譜(HRMS，ABSCIEX，TripleTOF5600+)，電噴霧離子源，正、負離子兩種模式收集；離子掃描范圍(m/z)：100～1 000；N2為霧化氣(壓力6 Psi)和干燥氣(流速為10 L/min)，溫度為550 ℃；噴霧電壓為5 500 V。

1.2.6 抑菌活性測定

1.2.6.1 抑菌圈測定

樣品液：分別稱取50.00 g的0 kGy和30 kGy核桃青皮粉末，參照1.2.3方法得到核桃青皮提取物浸膏，75%乙醇溶解(質量濃度0.08 g/mL)，備用。

菌懸液制備：分別將金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌活化培養，制成1×106CFU/mL的菌懸液，待用。

抑菌圈的測定：根據劉思玉等[15]的方法稍作修改。取200 μL不同菌懸液分別均勻涂布于固體培養基上，將無菌牛津杯放入培養皿中，每皿等距放置3個，吸取200 μL樣品液于牛津杯中，37 ℃恒溫培養24 h，十字交叉法測量抑菌圈直徑(d)。陰性對照為75%乙醇溶液，陽性對照為0.01 g/mL慶大霉素溶液，重復3次。

1.2.6.2 最小抑菌濃度的測定

根據KANATT等[16]的方法稍作修改，采用二倍稀釋法測定最小抑菌濃度。樣品液通過LB肉湯稀釋，使其終質量濃度分別為0.256、0.128、0.064、0.032、0.016、0.008、0.004 g/mL。以含菌液的肉湯為陰性對照，0.01 g/mL慶大霉素溶液為陽性對照。37 ℃搖床培養24 h，以沒有菌體生長所對應的提取物濃度為最小抑菌濃度。通過肉眼觀察，細菌無菌落生長表現為培養液呈澄清色。

1.2.6.3 生長曲線的測定

根據STRANTZALI等[17]的方法，取培養至對數期的供試菌和樣品液，加入LB肉湯中，使其終濃度為最小抑菌濃度。置于37 ℃、180 r/min 恒溫搖床中培養，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 取樣，測定OD600nm值。以培養時間與OD600nm值的關系繪制生長曲線。

1.3 數據處理

采用Origin 2019、Mintab 18.0 for Windows軟件進行方差分析，以P<0.05為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 電子束輻照預處理對核桃青皮細胞壁結構的影響

核桃青皮細胞壁中富含果膠。果膠的結晶度通常由X射線衍射圖中尖銳和寬泛的衍射峰進行確定，這些峰代表了果膠中大量羧基性多半乳糖醛酸結構。X射線通過晶體時，結晶物質通常有屬于自己的衍射圖譜，若結構發生變化，對應的結晶峰也會發生改變。由X衍射光譜(圖1)可見，經過10、20、30、40 kGy劑量輻照預處理的X射線衍射圖形與未輻照處理的核桃青皮(0 kGy)基本一致，均在2θ為30°、38°附近有弱吸收峰，在24°附近有中等強峰，在15°附近有強吸收峰，說明電子束輻照預處理對核桃青皮細胞壁中的果膠結晶結構影響較小，這與ASGARI等[18]報道電子束輻照對核桃青皮預處理后的結果相似。

圖1 不同劑量輻照處理的核桃青皮X衍射光譜Fig.1 X-ray diffraction spectra of green walnut husk irradiated with different doses

由掃描電鏡(圖2)分析核桃青皮表面物相結構變化可知，未經輻照處理的核桃青皮粉末(即0 kGy)組織結構較為完整致密，幾乎無空隙，孔洞數量較少，而經過不同劑量輻照處理后的核桃青皮粉末表面受到一定程度的破壞，組織結構疏松、空隙明顯增大，出現眾多孔洞。隨著輻照劑量升高(10～40 kGy)，組織結構疏松程度、孔洞數量呈增加趨勢，說明電子束輻照預處理對植物組織的疏松程度有影響，新增的不規則空隙可減少超聲提取作用下的天然產物溶出阻力，進而提高其溶劑浸出量[19]。

2.2 電子束輻照預處理對核桃青皮活性物含量的影響

由表1可看出電子束輻照預處理對總多酚、總黃酮、總三萜含量的影響。不同輻照劑量下，不同活性物質的含量都呈顯著差異(P<0.05)。隨著輻照劑量增加，總多酚、總黃酮、總三萜含量均顯著升高，且均在30 kGy時達到最大值，故30 kGy是提高核桃青皮活性物質含量的適宜輻照劑量。輻照劑量升高到40 kGy時，可能由于輻照劑量過高，在改變核桃青皮組織結構的同時，也對活性物結構產生破壞，導致含量下降。輻照劑量為30 kGy時，總多酚、總黃酮和總三萜含量分別為(20.89±0.18)、(38.01±0.63)、(14.73±0.26) mg/g，與未輻照的樣品相比，含量分別提高了14.78%、43.0%、13.69%，表明電子束輻照預處理有效地提高了核桃青皮中多酚、黃酮、三萜類化合物的提取效果，特別是黃酮類化合物。

2.3 核桃青皮活性物組分分析

利用UHPLC-MS/MS對樣品分別在正、負離子模式下進行組分分析(圖3和圖4)。共檢測到106個化合物，與本地自建化合物庫進行對比，并結合文獻分析，結果見表2。結果表明，在鑒定的63個化合物中，包括24個黃酮及黃酮苷類化合物、16個多酚類化合物、14個三萜酸及其皂苷類化合物、5個醌類化合物和4個其他化合物。其中，保留時間為7.25 min，分子離子峰[M-H]+為m/z353.088 1(誤差為-0.5 ppm)，這與綠原酸的分子質量相吻合，結合文獻分析，推測該物質極有可能是綠原酸[20]；ABU-REIDAH等[21]利用RP-UHPL和ESI-QTOF-MS分析了萵苣代謝產物的化合物組成，其中，咖啡酸質譜信息與本研究基本一致；VERDU等[22]比較UHPLC-UV和UHPLC-MS/MS兩種方法對蘋果汁中多酚組成進行了分析，發現，保留時間為16.21 min，離子峰[M-H]+為m/z463.088 5可能是金絲桃苷；62號和63號物質[M-H]-為455.354 1，保留時間為39.34 min，結合文獻信息[23]分析，推斷該化合物可能是熊果酸或齊墩果酸。此外，鑒定出的活性物種類以黃酮類最多，多酚類次之，三萜類最少，這與核桃青皮活性物含量的試驗結果一致，說明電子束輻照預處理對核桃青皮中黃酮類化合物的提取具有更明顯的促進作用。

a-0 kGy;b-10 kGy;c-20 kGy;d-30 kGy;e-40 kGy圖2 不同劑量輻照處理的核桃青皮掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy images of green walnut husk irradiated with different doses

表1 不同輻照劑量對核桃青皮多酚、黃酮、三萜含量的影響Table 1 Effect of different radiation dose on the contents of polyphenols, flavonoids and triterpenoids

圖3 30 kGy輻照預處理的核桃青皮提取物的UHPLC-MS/MS負離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of extract of green walnut husk irradiated with 30 kGy by UHPLC-MS/MS in negative ion mode

圖4 30 kGy輻照預處理的核桃青皮提取物的UHPLC-MS/MS正離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of extract of green walnut husk irradiated with 30 kGy by UHPLC-MS/MS in positive ion mode

2.4 核桃青皮提取物抑菌活性試驗結果分析

2.4.1 核桃青皮提取物抑菌圈直徑結果分析

核桃青皮提取物對4種細菌均具有一定抑菌作用(圖5)。據報道，木犀草素是一種具有抗菌和抗氧化活性的黃酮類化合物，可抑制化膿隱秘桿菌、大腸埃希菌、沙門菌和鏈球菌的生長[24]。核桃青皮中還含有沒食子酸、齊墩果酸、熊果酸、槲皮素、山奈酚、綠原酸等化合物，這些化合物的存在可能是核桃青皮具有良好抑菌作用的主要原因。由表3可知，經30 kGy

表2 30 kGy輻照預處理的核桃青皮提取物化學成分鑒定Table 2 Identification of chemical composition in green walnut husk extract pretreated by 30 kGy

處理的核桃青皮提取物的抑菌圈直徑均顯著高于未輻照組(P<0.05)，且30 kGy處理的核桃青皮提取物對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性更加強烈，抑菌圈直徑分別達到(22.88±0.45)、(23.98±0.16) mm。這可能是核桃青皮經電子束輻照處理后，黃酮、多酚、三萜等活性物質溶出率增加，提高了核桃青皮提取物4種細菌的抑菌效果，進一步證明電子束輻照預處理有利于核桃青皮活性物的溶出。

2.4.2 最小抑菌濃度試驗結果分析

表4為未輻照與30 kGy輻照后的不同質量濃度核桃青皮提取物對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度試驗結果。與未輻照核桃青皮提取物相比，除沙門氏菌外，最小抑菌濃度均有所下降，金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為0.008、0.008、0.016、0.032 g/mL。抑菌能力不同與細菌種類和提取物濃度有關。兩種類型細菌菌體細胞壁結構不同[25]，革蘭氏陰性菌具有脂多糖的雙層膜結構，革蘭氏陽性菌具有外膜和獨特的胞質間隙，提取物中的黃酮、多酚、萜類化合物更容易破壞單層細胞壁，從而抑制菌體的生長[26]。此外，經輻照預處理后，最小抑菌濃度的降低也表明電子束輻照預處理可以提高核桃青皮活性物質的含量，從而提高了抑菌活性。

a-大腸桿菌；b-金黃色葡萄球菌；c-蠟樣芽孢桿菌；d-沙門氏菌圖5 核桃青皮提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和沙門氏菌的抑制作用Fig.5 Inhibition of green walnut husk extracts on Escherichia coli,Staphylococcus aureus, Bacillus cereus and Salmonella注：a～d圖中各組樣品從左至右處理依次為0 kGy，30 kGy、陽性對照組

表3 抑菌活性試驗結果Table 3 Antibacterial activity test results

表4 最小抑菌濃度測定結果Table 4 The results of minimum inhibitory concentration determination

2.4.3 生長曲線試驗結果分析

圖6分別測定了濃度為最小抑菌濃度下的對照組(不含核桃青皮提取物)，0 kGy(未輻照核桃青皮提取物)與30 kGy輻照預處理的提取物對細菌生長的影響。與對照組相比，4種致病菌在未輻照青皮提取物溶液中的生長對數期均發生了一定的滯后，這與汪濤等[27]的研究結論相似，說明核桃青皮在天然抑菌劑的開發方面有較好的潛在價值。4種致病菌在未輻照和輻照的核桃青皮提取物溶液中的生長曲線差異明顯，說明電子束輻照預處理后的提取物對細菌生長抑制作用更強烈。因此，電子束輻照預處理技術可為拓寬植物廢棄物的利用方面提供參考。

a-大腸桿菌;b-金黃色葡萄球菌;c-蠟樣芽孢桿菌;d-沙門氏菌圖6 輻照前后核桃青皮提取物對細菌生長曲線的影響Fig.6 Effect of electron beam irradiation on bacterial growth curve of green walnut husk extracts pretreated and untreated

3 結論

研究表明，電子束輻照預處理技術提高了核桃青皮活性物質含量，在10～30 kGy劑量內，活性物含量與輻照劑量呈效應-劑量關系，這與結構表征研究結果一致。抑菌試驗表明，電子束輻照增強了核桃青皮對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果。因此，電子束輻照技術在天然產物活性物提取方面具有潛在的工業應用前景，輻照預處理后的核桃青皮提取物具有良好的抑菌潛力，可用于天然抑菌劑的開發。