薰衣草精油對不同溫度下形成的副溶血弧菌成熟生物被膜的清除作用

韓翔鵬，何美珊，吳金松，李堯，劉丹，鐘青萍

(廣東省食品質量與安全重點實驗室，華南農業大學 食品學院，廣東 廣州，510642)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)為革蘭氏陰性細菌，是常見的食源性致病菌之一。該菌主要存在于海洋環境中，常見于貝類、蝦、魚類等海產和鹽漬食品如咸菜、腌肉中[1]。研究表明副溶血弧菌毒力因子主要是耐熱直接溶血素(thermotolerant direct hemolysin, TDH)、相對耐熱溶血素(TDH-related hemolysin, TRH)和不耐熱溶血素(thermolabile hemolysin, TLH)，能引起急性腸胃炎，伴隨有嘔吐、腹痛、腹瀉、低燒和頭痛等癥狀[2]。在我國，副溶血弧菌引起的食物中毒事件高發于廣東、上海、浙江等沿海城市，并高居微生物性食物中毒的第二位[3]。在國外，副溶血弧菌引起中毒事件在日本、韓國、美國、西班牙、法國等地都有報道，嚴重危害著公眾健康。

副溶血弧菌能夠直接附著在食品加工設備或非食品加工部件的表面，如墻壁和排水管上形成生物被膜，造成食品污染或設備腐蝕[4]。生物被膜具有嚴重的致病性，能夠分泌不同表面因子和毒力因子。另外，生物被膜也能促進細菌之間的基因轉移，這可能導致毒力株的數量增加[5]。與浮游形式相比，細菌以生物被膜形式存在時，耐藥性可增加10～1 000倍[6]。主要原因是生物被膜包裹的胞外多聚物基質(多糖、蛋白質、脂質、DNA)可以形成一道天然的屏障，阻止抗生素在生物被膜內部擴散[7]。此外，營養物質缺乏、代謝廢物積累、致密的空間結構等惡劣的微環境導致生物被膜內部活的非可培養(viable but non-culturable, VBNC)狀態細胞的形成[8]。因此，生物被膜利用其對環境的適應性以及對酸、堿、氧化劑甚至抗生素等多種藥物的耐受性，保護其內部細菌在外界環境發生不利變化的情況下依然能夠生長和繁殖，這使得致病菌和腐敗菌的防控變得極其困難。

目前，在食品工業中，大多使用次氯酸鈉、乳酸、過氧化氫等消毒劑進行滅菌處理，但這些消毒劑并不能完全清除致病菌生物被膜，而且其安全性也越來越受到消費者的關注[9]。此外，長期使用抗生素已導致大量致病菌形成耐藥性，這對未來致病菌感染的防控與治療極其不利[10]。因此，作為消毒劑和抗生素替代品之一的植物精油是當前研究的熱點。薰衣草精油(lavender essential oil,LEO)因其生物特性和獨特的香氣在食品工業中有很大的開發潛能。薰衣草精油最重要的特性是抗菌活性，如抗細菌、抗真菌、抗病毒、殺線蟲等[11]。此外，薰衣草精油還具有多種藥理特性，如抗氧化、抗炎、鎮靜、催眠、鎮痛和抗癌等[12]。因此本研究首先考察副溶血弧菌在32 ℃和10 ℃下生物被膜的形成情況，在此基礎上進一步分析不同濃度的薰衣草精油和4種常用抗菌劑對兩種溫度下形成的副溶血弧菌成熟生物被膜的清除效果，并探究低溫環境對副溶血弧菌成熟生物被膜抗性的影響，這對消除副溶血弧菌污染、控制食品腐敗變質和保障食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副溶血弧菌ATCC17802，廣東微生物菌種保藏中心；薰衣草精油，青島優索化學科技有限公司；乳酸、檸檬酸、次氯酸鈉、過氧化氫，廣州牌化學試劑廠；細菌基因組DNA提取試劑盒、2×SGExcel Fast SYBR mixture、四唑鎓鹽(XTT)、碘化丙啶(propidium iodide, PI)，上海生工(生物工程)股份有限公司；甲萘醌，美國Sigma公司；FITC Con-A染料、疊氮溴化丙錠(propidium monoazade, PMA)，美國Biotium公司。

含3%(質量分數) NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯培養基(tryptic soy broth, TSB)：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、NaCl 30 g、去離子水1 L，pH值為7.0～7.4，121 ℃滅菌20 min。含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養基(tryptic soy agar, TSA)：在上述TSB配方的基礎上加入1.8%(質量分數)的瓊脂，用于平板計數法測定可培養細菌數。水解酪蛋白胨肉湯(mueller hinton broth, MHB)：稱取MHB培養基21 g，加入去離子水1 L，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Forma ClassⅡ A2生物安全柜、Multiskan FC酶標儀，Thermo公司；臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；650 W鹵鎢燈，德國Osram公司；CFX96TM熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；LSM 780激光共聚焦掃描顯微鏡，德國Zeiss公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株和培養條件

副溶血弧菌接種于含3% NaCl的TSB培養基中，37 ℃、150 r/min培養12 h后，4 ℃條件下，6 000 r/min離心10 min收集菌體，以無菌生理鹽水調整菌液濃度為107CFU/mL備用。

1.3.2 生物被膜的形成及定量

采用結晶紫染色法(crystal violet staining, CV)測定生物被膜的生物量。在12孔板中垂直放置無菌玻璃片(20 mm×20 mm)，將副溶血弧菌菌液與TSB培養液按體積比1∶4混勻后(菌液終濃度為107CFU/mL)，以每孔5 mL加入到孔板中，在32 ℃及10 ℃分別培養1 d及30 d。培養完成后，將附著生物被膜的玻璃片用無菌PBS清洗3次后，65 ℃干燥固定30 min，再在孔中加入0.1%結晶紫染色30 min，用無菌PBS清洗3次，干燥后，加入33%冰乙酸脫色10 min，用酶標儀測定595 nm下的吸光度。

1.3.3 代謝活性的測定

采用XTT法測定成熟生物被膜的代謝活性。XTT用PBS配制成1 g/mL的溶液，-80 ℃保存備用，甲萘醌在使用前溶解在丙酮中，使其終濃度為1 mmol/L。將附有生物被膜的玻璃片轉移至含有PBS和玻璃珠的無菌離心管中，渦旋振蕩2 min后，收集生物被膜懸液。在96孔板中每孔中加入100 μL懸液，然后將XTT溶液和甲萘醌溶液按體積比12.5∶1混合后，每孔加入50 μL，黑暗中37 ℃溫育4 h，用酶標儀測定450 nm下的吸光度。

1.3.4 生物被膜中活菌、可培養菌和VBNC菌數量的測定

采用PMA-qPCR法定量生物被膜中活菌數。取0.5 mL副溶血弧菌菌液于1.5 mL離心管中，加入PMA(終濃度為40 μmol/L)充分混勻，避光處理5 min 后開蓋置于冰上，距離650 W鹵鎢燈20 cm曝光5 min。處理后的樣品8 000 r/min離心2 min收集菌體，加入40 g/L溶菌酶37 ℃處理1 h。按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取副溶血弧菌的DNA，-20 ℃保存備用。

根據GenBank中的副溶血弧菌ATCC17802tlh基因，在保守區域用Primer 5.0設計PCR引物，并用Primer-BLAST驗證。上游引物序列(5’→3’)TCGTGCGAAAGTGCTTGAGATG，下游引物序列(5’→3’)CGGTGAGTTGCTGTTGTTGGAT，由上海生工(生物工程)股份有限公司合成。

PMA-qPCR反應體系為25 μL：2×TaqPCR Master mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(終濃度為20 μmol/L)，副溶血弧菌模板5 μL，ddH2O 6.5 μL。反應程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共39個循環。循環結束后72 ℃保持5 min。溶解曲線：65 ℃升至95 ℃，0.5 ℃/s。

采用稀釋平板法測定生物被膜中可培養菌數。吸取100 μL 10倍梯度稀釋的菌液，均勻涂布于含3% NaCl的TSA平板上，37 ℃培養24～48 h后計數。

活菌數與可培養菌數的差值即為VBNC菌的數量。

1.3.5 最低抑菌濃度的測定

采用96孔板微量稀釋法測定不同抗菌劑的最低抑菌濃度(minimum inbibitory concentration, MIC)。將抗菌劑以MHB培養基2倍稀釋成8個梯度。每個孔中加入100 μL MHB培養基，然后，再在每個孔中加入100 μL菌液，使菌液終濃度為107CFU/mL，同時設置不含抗菌劑的對照組?？装逶?2 ℃下恒溫培養24 h后，用酶標儀在595 nm處測定OD值。MIC被定義為抑制副溶血弧菌生長的抗菌劑的最低濃度。

1.3.6 不同抗菌劑對副溶血弧菌成熟生物被膜的清除作用

根據1.3.2中的方法，制備副溶血弧菌在32 ℃和10 ℃下形成的成熟生物被膜。將附有成熟生物被膜的玻璃片取出用PBS清洗3次，去除浮游菌，然后向各孔中分別加入5 mL不同濃度(1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC)的抗菌劑，在32 ℃和10 ℃處理3 h后，按照上述方法測定生物被膜生物量和代謝活性的變化，按公式(1)計算清除率，同時測定活菌數和可培養菌數。

(1)

1.3.7 激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜

將生物被膜用PBS緩沖液洗滌3次，用濾紙輕輕擦去多余的水分，黑暗環境下在載玻片上加入5 μL的綠色熒光素標記刀豆球蛋白A(fluorescein isothiocyanate-concanavalin A, FITC Con-A)混合溶液，于4 ℃下放置30 min，再加入5 μL的PI于4 ℃下放置15 min，蓋上蓋玻片。在激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)下觀察生物被膜，激發波長為488 nm，發射波長為500～550 nm，用Image J軟件分析生物被膜多糖厚度及死菌數量的變化。

1.3.8 數據處理

實驗重復3次及以上，取平均值，利用GraphPad Prism 8.0作圖，以SPSS 20進行數據分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下副溶血弧菌生物被膜的形成

由圖1-a所示，副溶血弧菌在32 ℃下培養48 h后，生物被膜總量達到最多，代謝活性最強，隨著培養時間延長至72 h，生物被膜總量及代謝活性也隨之減少，結果表明副溶血弧菌生物被膜在32 ℃下48 h后達到成熟。圖1-b表明，副溶血弧菌在10 ℃下第6天時生物量以及代謝活性最大。取副溶血弧菌在32 ℃、16 h 和10 ℃、6 d下的生物被膜計算活菌數，結果分別為(5.56±0.62) lgCFU/cm2、(5.48±0.1)lgCFU/cm2，通過t檢驗沒有顯著差異。

a-32 ℃；b-10 ℃圖1 副溶血弧菌在32 ℃和10 ℃下形成的生物被膜的生物量和代謝活性Fig.1 The biomass and metabolic activity of V.parahaemolyticus biofilms formed at 32 ℃ and 10 ℃

2.2 薰衣草精油對不同溫度下形成的副溶血弧菌生物被膜的清除作用

薰衣草精油、檸檬酸、乳酸、次氯酸鈉、過氧化氫對副溶血弧菌MIC值分別為0.4%(體積分數)、0.312 5 mg/mL、0.625 mg/mL、1.25%(體積分數)、0.004 7%(體積分數)。對于32 ℃下形成的副溶血弧菌常溫生物被膜，薰衣草精油的清除率隨著處理濃度的增加而增大，在1/2 MIC～4 MIC清除率為36.39%～72.38%，值得注意的是，1/2 MIC和MIC的薰衣草精油對生物被膜的清除效果與其他4種抗菌劑差別不明顯，而2 MIC濃度的薰衣草精油對生物被膜清除率顯著高于其他4種抗菌劑(圖2-a)。對于10 ℃ 下形成的副溶血弧菌低溫生物被膜，1/2 MIC和MIC的薰衣草精油的清除率為58.20%和60.18%，明顯高于其他4種抗菌劑；2 MIC和4 MIC 的薰衣草精油表現出更加顯著的清除效果，清除率分別為65.40%和67.62%(圖2-b)。總的來說，薰衣草精油對副溶血弧菌成熟生物被膜清除效果優于其他4種抗菌劑，而且對低溫生物被膜也展示出較強的清除能力。

a-32 ℃；b-10 ℃圖2 不同濃度的抗菌劑對32 ℃和10 ℃下形成的副溶血弧菌生物被膜的清除效果Fig.2 The removal effects of antimicrobial agents on mature biofilms of V.parahaemolyticus formed at 32 ℃ and 10 ℃注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 薰衣草精油對不同溫度下形成的副溶血弧菌生物被膜代謝活性的影響

對于32 ℃下形成的副溶血弧菌常溫生物被膜，薰衣草精油可顯著降低其代謝活性，強于其他4種抗菌劑，在1/2 MIC～4 MIC，代謝活性下降35.72%～71.38%(圖3-a)。對于10 ℃下形成的副溶血弧菌低溫生物被膜，1/2 MIC～4 MIC的薰衣草精油可使其代謝活性降低42.06%～50.48%(圖3-b)。薰衣草精油能夠通過破壞副溶血弧菌成熟生物被膜作用于內部菌體，從而影響生物被膜細胞的代謝活性。此外，結果亦表明低溫生物被膜對抗菌劑的抗性明顯強于常溫生物被膜。

2.4 薰衣草精油處理對副溶血弧菌生物被膜活菌數的影響

采用4種濃度的薰衣草精油處理2種溫度下形成的副溶血弧菌生物被膜3 h，活菌數和可培養菌數如圖4-a所示，經過薰衣草精油處理后，32 ℃生物被膜較10 ℃生物被膜菌數下降明顯，4 MIC處理下，32 ℃生物被膜活菌數減少3.96 lgCFU/cm2，可培養菌數減少5.94 lgCFU/cm2。圖4-b顯示10 ℃低溫生物被膜活菌數減少2.88 lgCFU/cm2，可培養菌數減少3.93 lgCFU/cm2。上述結果表明，薰衣草精油對副溶血弧菌成熟生物被膜具有良好的清除效果。此外，生物被膜內活菌數與可培養菌數的差值即為VBNC菌的數量，表明薰衣草精油處理后可誘導副溶血弧菌生物被膜中VBNC菌的形成。

a-32 ℃；b-10 ℃圖3 不同濃度的抗菌劑對32 ℃和10 ℃下形成的副溶血弧菌生物被膜代謝活性的影響Fig.3 The effects of antimicrobial agents on the metabolic activity of V.parahaemolyticus mature biofilms formed at 32 ℃ and 10 ℃

a-32 ℃；b-10 ℃圖4 薰衣草精油對32 ℃和10 ℃下形成的副溶血弧菌生物被膜細胞的影響Fig.4 The effects of LEO on the cells in V.parahaemolyticus biofilms formed at 32 ℃ and 10 ℃

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察薰衣草精油處理下的生物被膜結構

使用CLSM觀察4 MIC的薰衣草精油對副溶血弧菌生物被膜的清除效果，圖5-a和圖6-a分別為未處理的32 ℃和10 ℃下形成的副溶血弧菌成熟生物被膜，呈現出密集分布的三維結構，而且多糖和活/死細胞在生物被膜中分布密集，活細胞數量顯著高于死細胞。圖5-c是4 MIC薰衣草精油處理后的常溫生物被膜，多糖大部分被清除，綠色熒光面積下降54%；且含有大量死細菌，紅色熒光面積增加80%。圖6-c為4 MIC薰衣草精油處理后的低溫生物被膜，多糖含量比對照組顯著減少，死菌增多。上述結果表明薰衣草精油能夠破壞生物被膜的結構，有效清除生物被膜胞外多糖，殺滅部分生物被膜細胞。此外，薰衣草精油對低溫生物被膜的清除能力弱于常溫生物被膜，表明低溫生物被膜的抗性較強。

a、c-處理前后的32 ℃生物被膜胞外多糖和死菌分布；b、d-處理前后的32 ℃生物被膜胞外多糖和死菌的熒光強度圖5 CLSM觀察4 MIC薰衣草精油處理32 ℃下形成的副溶血弧菌生物被膜結構Fig.5 The structure of the biofilm formed at 32 ℃ treated with 4 MIC of LEO observed by CLSM注：綠光標記多糖，紅光標記死菌(下同)

a、c-處理前后的10 ℃生物被膜胞外多糖和死菌分布；b、d-處理前后的10 ℃生物被膜胞外多糖和死菌的熒光強度圖6 CLSM觀察4 MIC薰衣草精油處理10 ℃下形成的副溶血弧菌生物被膜結構Fig.6 The structure of the biofilm formed at 10 ℃ treated with 4 MIC of LEO observed by CLSM

3 結論

本研究考察了32、10 ℃下副溶血弧菌生物被膜的形成情況，分析了薰衣草精油對其成熟生物被膜的清除作用，并選擇食品工業中常用的幾種抗菌劑作為對照處理。32 ℃是副溶血弧菌適宜的生長溫度，而且為中國南方夏季常見的溫度。此外，冷藏食品在整個貯藏、運輸和銷售過程中的溫度為2～5 ℃，通常會升高至10 ℃左右[13]。CHUNG等[14]測定不同貯藏溫度下韓國傳統醬腌蟹中副溶血弧菌的生長曲線發現，副溶血弧菌在10 ℃下能長時間存活。WONG等[15]研究也發現副溶血弧菌能在4～30 ℃下存活。BURNHAM等[16]將6 lgCFU/mL的副溶血弧菌在10 ℃ 下培養10 d，其數目可達8.31 lgCFU/mL。因此，本研究亦考察10 ℃低溫對副溶血弧菌生物被膜形成及抗性的影響。我們使用激光共聚焦顯微鏡并結合Z-TACK層切技術和IMAGE J軟件分析副溶血弧菌生物被膜結構發現，低溫生物被膜厚度較常溫生物被膜略薄，但底部細胞分布較密集，而常溫生物被膜細胞分布較均勻。

此外，研究也發現副溶血弧菌低溫生物被膜對抗菌劑的抗性明顯強于常溫生物被膜，可能的原因是低溫環境能夠誘導副溶血弧菌成熟生物被膜中VBNC狀態細胞的形成。VBNC狀態是指細菌不能在傳統培養基上生長繁殖，但仍具有活性，并可在適宜條件下復蘇的特殊狀態[21]。與正常細胞相比，VBNC細胞表現出比可培養的細胞更低的代謝活性，但能繼續保持膜完整性并產生蛋白質[22]。NOWAKOWSKA等[23]發現低溫誘導的創傷弧菌進入VBNC狀態，從而對氧化應激、熱、pH、滲透壓、抗生素、乙醇和重金屬具有更強的耐受性。我們研究發現，副溶血弧菌在低溫條件下形成的成熟生物被膜中約有1/3的細胞進入了VBNC狀態。黃韻等[24]研究也表明，單增李斯特菌在2 ℃的低溫條件下培養比在25 ℃更早的進入VBNC狀態。本文研究表明，薰衣草精油對成熟生物被膜細胞的殺滅作用隨著濃度的增加而增大，生物被膜中活細胞和可培養細胞數量逐漸降低，而且其對常溫生物被膜細胞殺滅作用顯著強于低溫生物被膜細胞，這一結論也證實常溫生物被膜對抗菌劑具有更高的敏感性。