枯草芽胞桿菌發酵制備南極磷蝦肽及其體外抗氧化活性研究

楊柳，鄭漢豐，郭全友，楊絮，周國燕，鄭堯

1(中國水產科學研究院 東海水產研究所，上海，200090)2(上海理工大學 健康科學與工程學院，上海，200093)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)，生物資源量大，約6.5億～10.0億t，其營養價值高，被譽為“人類未來的動物蛋白庫”。20世紀60年代起，南極磷蝦成為各國戰略爭奪資源，挪威、中國、智利、日本等是主要捕撈及加工國家[1]。目前，南極磷蝦以凍蝦和蝦粉等產品形式為主。南極磷蝦富含內源酶，易使蝦體發生自溶，導致品質下降。磷蝦經蒸煮、分離和干燥等工藝生產的蝦粉，由于內源酶失活和水分含量降低，易于運輸和貯存，南極磷蝦粉的船上加工和全效利用成為關注重點。

南極磷蝦粉富含蛋白質、蝦青素、磷脂脂肪酸等成分[2]，多用于磷蝦油提取[3]。提油后的脫脂蝦粉中含有大量優質蛋白，制備具有抗氧化、降血壓等功能活性的磷蝦肽受到業內關注[4-5]。蛋白肽制備多用酶解與發酵法[6]，但酶解所得蛋白肽多含疏水性氨基酸，苦味明顯[7]，而微生物發酵產生的有機酸對苦味有掩蓋作用、外肽酶具有脫苦功效[8]，所得多肽風味更佳，適口性更強。同時，生物酶價格昂貴，酶解法在工業應用受到限制，因此，微生物發酵法成為一種天然綠色的多肽制備方法。

枯草芽胞桿菌是發酵制備多肽的安全菌種之一，具有產酶豐富、生長迅速等特點，在食品工業領域應用廣泛[9]。除選擇合適的菌株以最大限度地提高目標產物的產量外，發酵時間、初始接種量等發酵條件同樣影響發酵效能[10]。抗氧化是蛋白肽最主要的生物活性，自由基清除率、還原力等能有效評價蛋白肽的抗氧化活性。目前，以南極磷蝦粉為原料，發酵制備多肽的研究報道較少。

本文選擇枯草芽胞桿菌為發酵菌種，針對料液比、發酵時間、初始接種量等因素進行優化，并進行正交試驗。選擇自由基清除率、亞鐵離子螯合力及總抗氧化力對兩種工藝制備的南極磷蝦粗多肽體外抗氧化活性進行評價。為提高南極磷蝦多肽的發酵效能和抗氧化活性等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦粉購自中國水產有限公司，運至實驗室后均于-20 ℃冷凍保藏。

枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CICC 10071購于中國工業微生物菌種保藏管理中心，運至實驗室活化后采用甘油保藏，于-80 ℃冷凍保藏。

95%乙醇，上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醛溶液、氫氧化鈉標準溶液(0.05 mol/L)，上海麥克林生化科技有限公司；牛血清蛋白，美國Sigma公司；LB固體培養基、LB液體培養基，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KDN-103F凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；LRH-250恒溫培養箱、DK-8D恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；ZHWY-100H/200H恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；UV9100紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科有限公司；SPARK 10M多功能酶標儀，奧地利Tecan有限公司；2011-B6236立式滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；Avanti J-301低溫高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵工藝流程

發酵工藝流程如下：

原料→脫脂→滅菌→發酵→離心、抽濾→滅酶→取上清液待測

脫脂：95%乙醇，1∶10(g∶mL)1 000 r/min攪拌8 h，靜置過濾，取沉淀，50 ℃烘干24 h，研缽研碎，于-18 ℃冷凍保藏。滅菌：按一定料液比稱取脫脂蝦粉于250 mL錐形瓶中，加入100 mL去離子水，調節pH值，于121 ℃滅菌15 min，超凈臺中冷卻至室溫待用。發酵：按比例接入一定量的枯草芽胞桿菌于滅菌蝦粉中，采用30 ℃于恒溫培養振蕩器中發酵一定時間，設置轉速為180 r/min。離心、抽濾：發酵結束后，取發酵液8 000 r/min離心15 min，取上清抽濾待用。滅酶：將離心、抽濾后的發酵液于95 ℃滅酶15 min。

1.3.2 菌株復活與保藏

取LB液體培養基0.5 mL完全溶解凍干菌粉后，轉移至裝有5 mL LB液體培養基的試管中混勻，30 ℃靜置培養48 h，連續接種3代至菌株活力正常。轉接至1.5 mL離心管，采用甘油保藏菌株，于-80 ℃保藏備用。

1.3.3 菌株活化及種子液制備

1.3.3.1 菌株活化

取1.5 mL離心管甘油保藏菌株，轉接至100 mL LB液體培養基中，30 ℃、180 r/min搖床培養24 h，劃線轉接于LB固體培養基上，30 ℃培養48 h備用。

1.3.3.2 種子液制備

稱取3 g脫脂蝦粉于250 mL錐形瓶中，加入100 mL去離子水，于121 ℃滅菌15 min，超凈臺中冷卻至室溫，挑取單個菌落接種于滅菌蝦粉中，30 ℃、180 r/min搖床培養48 h，測定菌液濃度，選擇菌液濃度達109CFU/mL的種子液備用。

1.3.4 發酵工藝優化試驗

1.3.4.1 單因素試驗

依據前期預研結果，分別探究料液比[1∶100、3∶100、5∶100、7∶100、9∶100(g∶mL)]、發酵時間(1、2、3、4、5 d)、初始接種量(1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108CFU/mL)、發酵液初始pH值(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)對南極磷蝦肽制備效果的影響。發酵結束后經離心、抽濾、滅酶后，取適量上清液備用，進行多肽得率、水解度及蛋白回收率的測定。

1.3.4.2 正交試驗

根據單因素試驗優化結果，進行L9(34)正交試驗，對發酵時間、料液比和初始接種量3個因素進行優化，確定南極磷蝦蛋白肽制備的最佳工藝。正交因素及水平設計如表1所示。

表1 正交試驗設計L9(34)因素及水平Table 1 Independent variables and their levels chosen for L9 (34) orthogonal array design

1.4 指標的測定

1.4.1 枯草芽胞桿菌活菌數的測定

選擇LB固體培養基，使用稀釋涂布平板法，將已涂布的平板倒置，于30 ℃培養24 h后計數，以對種子液中枯草芽胞桿菌活菌數進行測定。

1.4.2 多肽得率的測定

使用雙縮脲法對多肽得率進行測定。取0.6 mL發酵上清液，加入0.6 mL 三氯乙酸溶液(100 g/L)，混勻后靜置10 min后，6 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，混勻后靜置60 min，于540 nm處測定吸光度。以1 mL去離子水代替樣品做參比，牛血清蛋白為標準品，測定標準曲線，由標準曲線計算得多肽質量濃度。多肽得率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：c為發酵液多肽質量濃度，mg/mL；v為發酵液體積，mL；m為脫脂蝦粉質量，g。

1.4.3 水解度的測定

水解度是反映蛋白水解過程中肽鍵的斷裂情況，是衡量蛋白水解程度的重要指標。發酵液中氨基酸態氮含量使用甲醛電位滴定法測定[11]；原料中總氮含量參照GB 5009.5—2016，使用凱氏定氮法測定。水解度的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：m1為發酵液中氨基酸態氮含量，g；m2為脫脂蝦粉中總氮含量，g。

1.4.4 蛋白回收率的測定

蛋白質回收率是指發酵上清液中可溶性蛋白與原料總蛋白的百分比，用于表征發酵過程中菌株分泌蛋白酶對原料蛋白質的利用效率。參照GB 5009.5—2016，使用凱氏定氮法，測定發酵上清液與脫脂蝦粉中的總氮含量。蛋白回收率的計算如公式(3)所示：

(3)

式中：ω1為發酵上清液總氮含量，g/100g；ω2為脫脂蝦粉總氮含量，g/100g；m1為發酵上清液質量，g；m2為脫脂蝦粉質量，g。

1.4.5 體外抗氧化活性

1.4.5.1 自由基清除率

(1)DPPH自由基清除率

參照CHEN等[12]的方法，稍作修改。將發酵液凍干后，分別配制質量濃度為1、2、3、4、5 mg/mL多肽樣液，取1 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L，甲醇溶解)，與1 mL樣液混合，室溫下避光靜置30 min，于517 nm處測得吸光度，以維生素C為陽性對照。DPPH 自由基清除率的計算如公式(4)所示：

(4)

式中：A1為待發酵液吸光度；A0為超純水代替發酵液測得的吸光度；A2為甲醇代替DPPH溶液測得的吸光度。

(2)ABTS陽離子自由基清除率

參照KETNAWA等[13]的方法，稍作修改。ABTS母液(7 mmol/L ABTS、2.45 mmol/L過硫酸鉀混合)，于室溫避光反應16 h，用甲醇稀釋ABTS母液，使其吸光值在734 nm處為0.7±0.02。將發酵液凍干后，分別配制質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的多肽樣液。將樣液與ABTS溶液1∶3混合，室溫下避光反應6 min，于734 nm處測定吸光值，以維生素C為陽性對照。ABTS陽離子自由基清除率的計算如公式(5)所示：

(5)

式中：A1為待發酵液吸光度；A0為超純水代替發酵液測得的吸光度；A2為甲醇代替ABTS溶液測得的吸光度。

(3)羥自由基清除率

參照陳麗花等[14]的方法，將發酵液凍干后，分別配制質量濃度為1、2、3、4、5 mg/mL多肽樣液，取1 mL樣液，加入1 mL硫酸亞鐵溶液(6 mmol/L)、1 mL 過氧化氫溶液(6 mmol/L)，混勻后靜置反應10 min，加入1 mL水楊酸溶液(6 mmol/L)混勻，室溫下靜置30 min，于510 nm處測定吸光度，以維生素C為陽性對照。羥自由基清除率計算如公式(6)所示：

(6)

式中：A1為待發酵液吸光度；A0為超純水代替發酵液測得的吸光度；A2為超純水代替水楊酸測得的吸光度。

1.4.5.2 亞鐵離子螯合力

參照SUN等[15]的方法，將發酵液凍干后，分別配制質量濃度為1、2、3、4、5 mg/mL多肽樣液。取5 mL樣液，再加入0.1 mL氯化亞鐵溶液(2 mmol/L)和0.2 mL菲洛嗪溶液(5 mmol/L)，混勻后反應10 min，于562 nm處測定吸光度，以維生素C為陽性對照。亞鐵離子螯合力的計算如公式(7)所示：

(7)

式中：A1為待發酵液吸光度；A0為超純水代替發酵液測得的吸光度。

1.4.5.3 總抗氧化能力

將發酵液凍干后，分別配制質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL多肽樣液，使用總抗氧化能力[鐵離子還原能力(ferric reduction ability plasma assay，FRAP)]試劑盒對發酵液的還原力進行測定，以維生素C為陽性對照。

1.5 數據統計與分析

使用SPSS 26.0軟件進行單因素試驗數據處理及顯著性分析(P<0.05)，使用GraphPad Prism 7.0作圖，使用minitab進行正交試驗設計及數據分析。

2 結果與分析

2.1 發酵條件單因素試驗

2.1.1 發酵時間的確定

時間對微生物生長代謝有顯著影響。如圖1所示，隨發酵時間的增長，多肽得率先增后降，水解度和蛋白回收率均呈上升趨勢。隨發酵時間的增長，菌株進入衰亡期，產酶量下降，同時發酵體系中多肽被進一步水解為氨基酸，因此發酵后期多肽得率出現下降[16]。水解度反映肽鍵斷裂的程度，隨發酵時間的增長，發酵體系中的蛋白酶總量逐漸增多，因此水解度呈上升趨勢，這與WANG等[17]的研究結果一致。水解度高說明發酵體系中小分子物質濃度升高，影響蛋白酶對底物蛋白的利用效率，因此蛋白回收率最終趨于平緩。結合實際情況，發酵時間過長不利于工業生產，能耗高成本大，因此選擇1～3 d為后續正交試驗范圍。

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率圖1 發酵時間對南極磷蝦粉的影響Fig.1 Effect of fermentation time on Antarctic krill powder注：不同字母上標表示差異顯著(P<0.05)(圖2～圖4同)

2.1.2 料液比的確定

料液比是限制發酵效能的關鍵因素[18]。如圖2所示，隨料液比的升高，發酵液中多肽得率呈現先增后減的趨勢，水解度先快速增長后趨于平穩，蛋白回收率則隨料液比的升高而下降。當料液比較低時，菌株因營養不足而生長緩慢，分泌蛋白酶較少，不利于蛋白水解。隨料液比增高，菌株因營養充足而生長迅速，發酵體系中蛋白酶豐富，蛋白水解程度增高。但當料液比過高時，大量蛋白酶使體系中的多肽進一步降解為小肽與氨基酸，導致多肽得率下降而水解度仍呈增長趨勢。蛋白回收率呈現完全相反的變化趨勢，說明發酵過程中菌株所分泌的蛋白酶對底物的利用率不高，底物蛋白并未得到完全利用[19]。因此選擇料液比1∶100～5∶100(g∶mL)進行后續正交試驗。

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率圖2 料液比對南極磷蝦粉的影響Fig.2 Effect of material liquid ratio on Antarctic krill powder

2.1.3 初始接種量的確定

適宜的接種量可以提高發酵速度，有效節約時間和成本。如圖3所示，多肽得率隨接種量的增多而先增后減，水解度與蛋白回收率則呈上升趨勢。當接種量較低時，發酵體系中微生物濃度過低，產酶量有限，底物蛋白水解程度低，發酵液中多肽含量少。當接種量過高時，底物營養不足，微生物生長受限，發酵體系中的多肽優先用于微生物生長，多肽得率下降。水解度隨接種量的升高而升高，最終趨于平穩，同時蛋白回收率呈上升趨勢，說明底物蛋白充足，發酵體系中的蛋白酶含量與底物蛋白濃度達到平衡狀態。綜合考慮，選擇接種量1.5×106～1.5×108CFU/mL進行后續正交試驗。

2.1.4 初始pH的確定

pH會影響微生物對底物的利用及其分泌蛋白酶的活性，從而影響發酵效率，因此需對發酵的初始pH進行確定。如圖4所示，隨初始pH的升高，多肽得率與水解度呈先增后減的趨勢，蛋白回收率緩慢升高。pH的改變使多肽得率有所變化，但各組間并不存在顯著差異。枯草芽胞桿菌在發酵過程中主要分泌的蛋白酶為堿性蛋白酶，因此當處于堿性環境時水解度與蛋白回收率更高。由圖5可知，pH對發酵效能影響不大，且原始pH在7.0～8.0，因此在后續正交試驗中不需對此因素進行優化，選擇原始pH即可。

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率圖3 接種量對南極磷蝦粉的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on Antarctic krill powder

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率圖4 初始pH對南極磷蝦粉的影響Fig.4 Effect of initial pH on Antarctic krill powder

2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇發酵時間(A)、料液比(B)及初始接種量(C)為因素，以多肽得率、水解度、蛋白回收率為指標，進行三因素三水平正交試驗，優化南極磷蝦粉的發酵工藝，結果如表2所示。

由極差可知，發酵條件對多肽得率的影響主次順序依次為：C>A>B，發酵條件對水解度的影響主次順序依次為：A>B>C，發酵條件對蛋白回收率的影響主次順序依次為：B>C>A。由k值可知，對多肽得率和水解度而言，最佳發酵條件為A3B2C3，即發酵時間3 d、料液比3∶100(g∶mL)、初始接種量1.5×108CFU/mL，對蛋白回收率而言，最佳發酵條件為A3B1C3，即發酵時間3 d、料液比1∶100(g∶mL)、初始接種量1.5×108CFU/mL。對兩種工藝進行驗證實驗，結果如表3和表4所示，多肽得率兩種工藝無顯著差異，水解度A3B2C3更高，可達(13.50±0.19)%，蛋白回收率A3B1C3更高，可達(14.39±0.48)%。

2.3 南極磷蝦粗多肽的體外抗氧化活性分析

2.3.1 自由基清除率

氧化反應會產生損害細胞的自由基，主要包括活性氮(reactive nitrogen species，RNS)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)兩種[20]。因此，自由基清除實驗是篩選具有高抗氧化活性蛋白質水解物的一種有效、簡便的方法。

DPPH自由基為活性氮自由基，其清除率廣泛用于天然提取物抗氧化活性的評估中。如圖5-A所示，兩種南極磷蝦粗多肽對DPPH自由基的清除效果隨樣品質量濃度的增加先升高，后逐漸平穩。A3B1C3組粗多肽對DPPH自由基的半數效應濃度值(half clearance concentration，EC50)為1.55 mg/mL，A3B2C3組粗多肽對DPPH自由基的EC50值為2.24 mg/mL，對比PARK等[21]的研究結果，2種南極磷蝦粗多肽對DPPH自由基的清除能力優于多數南極磷蝦酶解產物對DPPH自由基的清除能力，且兩者中前者的清除能力更強，這可能是因為各種肽段間存在相互促進的作用，且粗多肽中可能含有少量殼聚糖，也會提高粗多肽對DPPH 自由基的清除能力，但與維生素C對照組對DPPH自由基的清除能力仍存在差異。

表2 枯草芽胞桿菌發酵制備南極磷蝦肽正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal test in preparation of Bacillus subtilis

表3 枯草芽胞桿菌發酵制備南極磷蝦肽正交試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test results of Bacillus subtilis

表4 最佳發酵條件實驗結果Table 4 Experimental results of optimal fermentation conditions

ABTS陽離子自由基清除率主要用于評價親水性和親脂性化合物的抗氧化活性[22]。如圖5-B所示，2種南極磷蝦粗多肽對ABTS陽離子自由基的清除效果與樣品質量濃度的關系與DPPH自由基清除效果趨勢一致，其對ABTS陽離子自由基的EC50值均為0.16 mg/mL，高于對DPPH自由基的EC50值，說明2種南極磷蝦粗多肽對ABTS陽離子自由基的清除能力更強，這與LATORRES等[23]的研究一致，且當質量濃度為0.5 mg/mL時與維生素C對照組對ABTS陽離子自由基的清除效果接近。

羥自由基為活性氧自由基，是最具活性的自由基，可與生物體內的大多數生物分子發生反應，因此羥自由基清除能力在抗氧化活性評估中至關重要。如圖5-C所示，兩種南極磷蝦粗多肽的羥自由基清除效果與樣品質量濃度呈正相關。A3B1C3組粗多肽對羥自由基的EC50值為3.95 mg/mL，A3B2C3組粗多肽對羥自由基的EC50值為4.05 mg/mL，說明前者的羥自由基清除能力強于后者，推測前者中含有更多由極性氨基酸組成的肽段[24]，但與維生素C對照組對羥自由基的清除能力相比，仍處于較低水平。

A-DPPH自由基清除率；B-ABTS陽離子自由基清除率；C-羥自由基清除率圖5 不同南極磷蝦粗多肽的抗氧化分析Fig.5 Antioxidant analysis of different Antarctic krill crude peptides注：A～D不同字母表示同一南極磷蝦粗多肽在不同質量濃度下自由基清除率差異顯著(P<0.05)；a～c不同字母表示在相同質量濃度下各南極磷蝦粗多肽間自由基清除率差異顯著(P<0.05)(圖6、圖7同)

2.3.2 亞鐵離子螯合力

機體內多數氧化反應都需要過渡金屬離子的催化，因此亞鐵離子螯合力廣泛用于評價多肽的抗氧化能力[25]。結果表明，兩種南極磷蝦粗多肽的亞鐵離子螯合力均與樣品質量濃度具有量效關系。A3B1C3組粗多肽對亞鐵離子螯合力的EC50值為0.22 mg/mL，A3B2C3組粗多肽的EC50值為0.23 mg/mL，二者無顯著差異，但均處于較高水平，說明南極磷蝦粗多肽中可能含有較多由中性和酸性氨基酸組成的肽段，其側鏈中的羥基和氨基易于與亞鐵離子結合，從而達到抑制氧化的作用[25]，但仍低于維生素C對照組的亞鐵離子螯合力。

圖6 不同南極磷蝦粗多肽的亞鐵離子螯合力Fig.6 Fe2+ chelating activity of different Antarctic krill crude polypeptides

2.3.3 總抗氧化能力

FRAP法是測定產物總抗氧化能力的常用方法，本實驗以Trolox為參考抗氧化劑化合物，南極磷蝦粗多肽的總抗氧化能力以Trolox等效抗氧化能力表示。如圖7所示，隨南極磷蝦粗多肽質量濃度的升高，其總抗氧化能力呈增高趨勢，且A3B1C3組的總抗氧化能力高于A3B2C3組，說明前者的組分中含有很好的氫或電子供應體，具有更強的還原力[25]，但仍低于維生素C的總抗氧化能力。

A-不同粗多肽總抗氧化能力；B-維生素C的總抗氧化能力圖7 不同南極磷蝦粗多肽的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of different Antarctic krill crude peptides

3 結論

本研究以南極磷蝦粉為原料，脫脂后利用枯草芽胞桿菌發酵制備南極磷蝦蛋白肽，得到2種最佳發酵工藝，通過體外抗氧化活性實驗，兩種南極磷蝦粗多肽均具有良好的抗氧化活性，其中高水解度組粗多肽的總抗氧化能力更強，高蛋白回收率組粗多肽的DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率更強，但2組粗多肽的亞鐵離子螯合力則無顯著差別。本研究初步證實通過微生物發酵制備具有抗氧化性的南極磷蝦蛋白肽具有可行性，但并未對此多肽進行分離純化，多肽組成及抗氧化機制尚不明確，后續可針對單一肽段進行深入研究，以優選出抗氧化活性突出的特定肽段，為南極磷蝦粉的全效利用和生物加工提供參考。