黃粉蟲凝乳蛋白酶的分離純化及結構預測

楊祥，喬海軍，楊曉麗，文鵬程，汪月，張衛兵,*，張忠明,*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅農業大學 理學院，甘肅 蘭州，730070)3(甘肅省商業科技研究所有限公司，甘肅 蘭州，730000)

凝乳酶是干酪生產過程中的關鍵酶，能夠使牛奶凝固并在干酪成熟過程中起著不可替代的作用[1]。凝乳酶的凝乳過程包括2個階段：第一階段是對κ-酪蛋白Phe105-Met106連接的肽鍵進行水解，暴露出內部的α-酪蛋白和β-酪蛋白；第二階段是在Ca2+作用下，酪蛋白分子間形成化學鍵，并聚集形成三維網狀凝膠[2]。小牛凝乳酶是最早應用于干酪制作的，然而隨著干酪的市場需求不斷增加，小牛凝乳酶逐漸供不應求，人們不得不尋找其替代品[1,3]。駱駝凝乳酶、羔羊凝乳酶、豬胃蛋白酶等動物源凝乳酶都具有較好的凝乳活力，它們的蛋白水解力較小，制作的干酪苦味小，風味和品質也較好。帕爾瑪奶酪、高山奶酪、埃門塔爾奶酪等很多高品質的干酪都使用動物源凝乳酶進行制作[4]。動物源凝乳酶替代品中，駱駝凝乳酶與小牛凝乳酶分子結構差異很小，但其凝乳活力要高于小牛凝乳酶，且蛋白水解力只有小牛凝乳酶的30%[5]。羔羊凝乳酶的凝乳活力低于小牛凝乳酶，但具有更高的pH穩定性[6]；水牛皺胃酶的凝乳活力較低，其穩定性和蛋白水解力與小牛凝乳酶差別不大[7]；此外，從甲殼類昆蟲Munida中提取出的凝乳酶也可應用于奶酪制作[8]。昆蟲的物種豐富，數量眾多，是凝乳酶開發的良好資源，然而，在現有動物源凝乳酶中，昆蟲凝乳酶少有報道。

黃粉蟲(Tenebriomolitor)，是鞘翅目擬步行蟲科粉甲屬的昆蟲，常被用作動物飼料。近年來，將昆蟲尤其是黃粉蟲作為動物蛋白納入食品行業受到歐洲重點關注[9]。與其他動物一樣，在黃粉蟲的腸道中也存在很多蛋白酶。ELPIDINA等[10]在黃粉蟲幼蟲的后中腸中提取出胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶，并測定了其酶學性質和N端序列；CRISTOFOLETTI等[11]在黃粉蟲中腸中提取出組織蛋白酶L樣蛋白酶(calpain,CAL)，測定了其氨基酸序列并預測了其活性位點和功能；BETON等[12]在中腸中也提取得到CAL，進一步模擬出了酶的3D結構模型；馬勇等[13]研究發現將黃粉蟲漿加入牛奶后，很快會發生凝乳現象，但對其凝乳機理未做進一步的研究。本研究從黃粉蟲體中提取和分離純化出凝乳蛋白酶，鑒定出該酶的氨基酸序列，并對其結構特性進行預測，以期為黃粉蟲凝乳蛋白酶在的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃粉蟲，山東省德州市平原十號路市場；DEAE-Sepharose FF、Sephadex G75，上海源葉生物科技有限公司；0.45 μm濾膜，上海光譜實驗科技有限公司；蛋白Marker，上海索萊寶生物科技有限公司；玻璃勻漿器，上海澤葉生物科技有限公司；丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，北京酷來搏科技有限公司；甲叉雙丙烯酰胺，上海中泰化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G250、考馬斯亮藍R250，天津市光復精細化工研究所；其他常用生化試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TD5A-WS高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；HL-2B恒流泵、BSZ-160自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠；SCIENTZ-10 ND真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技有限公司；質譜儀Q Exactive HF、液相Easy nLC/ Ultimate 3000、色譜柱C18(1.9 mm，150 μm×120 mm)、色譜預柱C18(3 mm,100 μm×20 mm)， 美國Thermo Scientific公司；電泳儀、電泳自動成像儀，美國Bio-Rad公司；PPSQ-33A島津全自動蛋白質多肽測序儀，日本SHIMADZU公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃粉蟲腸道蛋白組分析

將四齡的黃粉蟲置于一塊含0.9% NaCl的冰上切去其頭和尾，從任意一端取出腸道，與pH 6.5的Tris-HCl緩沖液充分混合后，加入玻璃勻漿器中勻漿；將得到的勻漿液4 ℃、10 000×g離心20 min，收集上清液并用0.45 μm濾膜進行微濾，收集濾液[14]；將濾液送往北京市百邁客生物科技有限公司進行LC-MS/MS分析，并對得到的碎片肽段序列進行定性和定量分析以及功能注釋，建立黃粉蟲腸道蛋白數據庫。

1.3.2 黃粉蟲凝乳蛋白酶提取與分離純化

將黃粉蟲腸道經勻漿、離心、微濾后得到濾液，然后對其進行純化。首先，使用弱陰離子交換柱DEAE-Sepharose FF進行離子交換層析[15]：用pH 6.5的0.02 mol/L Tris-HCl作為平衡緩沖液平衡3～5個柱體積，平衡流速為1 mL/min；用0～0.6 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，洗脫液用平衡緩沖液配制，洗脫流速為0.5 mL/min[16]。收集具有凝乳活力的洗脫液并用3 kDa超濾離心管進行濃縮，將濃縮液作為上樣樣品，使用葡聚糖凝膠Sephadex G75色譜柱(1.6 cm×20 cm)進行凝膠過濾層析：用pH 6.0的0.02 mol/L Tris-HCl作為平衡緩沖液平衡4～5個柱體積，平衡流速為1 mL/min；用平衡緩沖液進行洗脫分離，洗脫流速為0.25 mL/min；收集具有高凝乳活力的洗脫液，得到純化的凝乳酶，冷凍干燥后保存在-80 ℃下。通過SDS-PAGE驗證凝乳酶的純度，采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。

1.3.3 N端15個氨基酸序列測定

采用Edman降解法測定該酶的N端15個氨基酸[10]；。將凍干的樣品用pH 6.0的Tris-HCl緩沖液溶解，取20 μL溶液樣品進行12% SDS-PAGE后，將SDS-PAGE膠電轉至硝酸纖維素膜上，并用麗春紅染色。剪取相應膜放置到反應器中，組裝好反應器后將其放置于儀器固定位置，通過島津全自動蛋白質多肽測序儀(PPSQ-33A)對樣品N端序列進行分析。通過軟件PPSQ-30 Analysis設置：樣品名稱、樣品號、測試循環數、選擇方法文件，設置完成后開始測試，最終確定該酶N端15個氨基酸。利用該酶的N端15個氨基酸序列與黃粉蟲腸道蛋白數據庫比對搜索出同源蛋白。

1.3.4 凝乳酶活力測定

參照ARIMA等[17]的方法，將含有10 mmol/L CaCl2的10%脫脂乳于35 ℃水浴中孵育15 min，再按質量比1∶10加入黃粉蟲凝乳蛋白酶，充分混勻后，記錄下容器壁出現絮狀顆粒所需要的時間，即為凝乳時間。凝乳活力的單位為索氏單位，1個索氏單位表示在35 ℃下，40 min內凝結1 mL底物所需要的酶量。凝乳活力計算如公式(1)所示：

(1)

式中：MCA為凝乳活力(milk clotting activity)，t為凝乳時間，s。

1.3.5 蛋白水解力測定

參照ZHAO等[18]的方法進行測定并略作修改。樣品的測定方法為：取1 mL樣品在40 ℃水浴2 min，然后加入1 mL 1%酪蛋白溶液反應10 min，再加入2 mL 0.4 mmol/L三氯乙酸溶液終止反應，靜置10 min后過濾溶液并取1 mL濾液在660 nm處測定吸光值。蛋白水解力的單位為U，1 U表示1 mL酶在1 min內水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需要的酶量。樣品的蛋白水解力(proteolytic activity，PA)計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A660為樣品在660 nm處的吸光值，4為反應試劑總體積，1/10為反應時間10 min，以1 min計算，K為吸光常數，在標準曲線上，吸光值為1時對應的酪氨酸濃度，n為稀釋倍數。

1.3.6 黃粉蟲凝乳蛋白酶一級結構分析

在GenBank數據庫采用 BLAST 程序查找與其相似的蛋白酶序列，并與黃粉蟲凝乳蛋白酶進行比較分析。

1.3.7 黃粉蟲凝乳蛋白酶理化性質預測

參考 SOLEYMANZADEH等[19]的方法計算和預測黃粉蟲凝乳蛋白酶的理化特性。利用肽特性計算器(https://pepcalc.com/)確定酶的分子質量、等電點(isoelectric point，PI)和凈電荷；利用ExPASy ProtParam工具(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam /protparam)預測酶的不穩定性指數(不穩定性指數<40預示該肽可能是穩定的，不穩定性指數>40則預示蛋白質或肽可能不穩定)[20]；使用肽工具(https://www.peptide2.com)確定酶的疏水性氨基酸比例。

1.3.8 黃粉蟲凝乳蛋白酶二級結構預測

以黃粉蟲凝乳蛋白酶的一級序列為基礎，使用PSSFinder工具預測其二級結構(http://linux1.softberry.com/ berry)[21]。

1.3.9 凝乳酶的三級結構預測

以黃粉蟲凝乳蛋白酶的一級結構為基礎，運用I-TASSER On-line Server預測其三級結構和B-factor(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)。利用COACH服務器和預測到的三級結構預測該酶的活性位點，并以TM-score和Cov作為置信度的評價指標。

2 結果與分析

2.1 黃粉蟲腸道蛋白數據庫的建立

從樣品中共鑒定到1 207種黃粉蟲腸道蛋白質及其完整氨基酸序列，其中發掘出98種新蛋白。建立了黃粉蟲腸道蛋白數據庫，將測序數據上傳至ProteomeXchange數據庫，存儲編號為PXD029111。鑒定到的蛋白涉及的主要代謝通路為碳代謝(ko01200)、氧化磷酸化(ko00190)、糖酵解/糖異生(ko00010)、半乳糖代謝(ko00052)以及多種氨基酸代謝；主要功能包括轉移酶活性(GO:0016740)、催化活性(GO:0003824)、單體碳水化合物代謝過程(GO:0044723)、酶調節器活性(GO:0030234)等。

2.2 黃粉蟲凝乳蛋白酶提取與分離純化

如圖1-a所示，粗酶液經離子交換層析后，共洗脫出6個蛋白峰，其中第1、第2和第3個峰沒有肩峰，表明雜蛋白很少，而后面3個峰都有肩峰，說明存在較多的雜蛋白，蛋白并沒有徹底被分開。在第一個蛋白峰的位置出現了具有高凝乳活力的蛋白，而這個位置是采用0 mmol/L NaCl的洗脫液洗脫的，說明該酶無法被陰離子交換柱吸附。將高凝乳活力的蛋白收集、濃縮，得到了部分純化的凝乳酶，其凝乳活力達到26.81 SU/mg，C/P(clotting activity/proteolytic activity)值為4.83，純化倍數為6.65。與粗酶液相比，其蛋白水解力明顯下降，凝乳活力有一定提高。

將該提取物進行凝膠過濾層析，結果如圖1-b所示,經凝膠過濾層析后，共洗脫出了2個蛋白峰，第2個峰相較于第1個峰要大很多，且這2個峰都沒有肩峰，說明蛋白純度較高，分離效果較好。在第二個峰的位置附近出現了具有高凝乳活力的蛋白，將其收集并進行了SDS-PAGE以測定其純度(圖1-c)，發現黃粉蟲凝乳蛋白酶已達到電泳純，分子質量約為29 kDa。該值在目前所研究的黃粉蟲腸道蛋白分子質量范圍之內，并且偏小一些[22]；其分子質量與小牛凝乳酶、山羊凝乳酶和豬胃蛋白酶相比較小，與羔羊凝乳酶[5]接近。相比于TERESHCHENKOVA等[23]只使用1種層析柱進行純化，本研究采用2種層析柱和微濾組合的純化方法能達到更好的純化效果。

經測定該酶的凝乳活力達到173.8 SU/mg，C/P值為104.70，純化倍數為43.13，蛋白水解力僅有1.66 U/mL (表1)。其C/P值要高于雞胃蛋白酶、金槍魚凝乳酶和成年的綿羊皺胃酶[24]。C/P值越高則表明在干酪的制作和成熟過程中產生的苦味越少，很多植物源和微生物源凝乳酶[18]做出的干酪質地柔軟，苦味重就是由于蛋白水解力太大，C/P值不大導致的。這些都表明該酶在干酪生產上具有一定的潛力。

a-DEAE Sepharose Fast Flow；b-Sephadex G75；c- SDS-PAGE(M-標準蛋白；1-純化的黃粉蟲凝乳蛋白酶)圖1 黃粉蟲凝乳蛋白酶的柱層析純化及SDS-PAGEFig.1 Column chromatography purification and SDS-PAGE pattern of milk-clitting protease from T.molitor larvae

表1 黃粉蟲凝乳蛋白酶純化過程Table 1 Purification procedure of milk clotting protease from T.molitor larvae

2.3 黃粉蟲凝乳蛋白酶序列鑒定

經測定黃粉蟲凝乳蛋白酶的N端15個氨基酸序列為MKLLVFSLVAISLAQ，與建立的黃粉蟲腸道蛋白數據庫比對后發現其與同源蛋白(g18990)的N端序列完全匹配(表2)；該蛋白鑒定方法被許多研究學者運用[10,12]，是一種經典有效的鑒定手段。該酶的氨基酸序列如圖2所示，其總氨基酸殘基數為279，與小牛皺胃酶和駱駝凝乳酶的N端序列都只有13.3%的相似度[21]。

表2 黃粉蟲凝乳蛋白酶的序列信息Table 2 Sequence information of milk-clotting protease from T.molitor larvae

另外，該酶序列與NCBI中的幾種蛋白水解酶有50%以上的相似度(表3)，其中最高的1種是PREDICTED:brachyurin(XP_969640.1)，相似度達到75.27%，這種蛋白水解酶來自同屬鞘翅目的紅面甲蟲(Triboliumcastaneum)，但其功能尚未證實。

圖2 黃粉蟲凝乳蛋白酶的氨基酸序列Fig.2 The amino acid sequence of milk-clotting protease from T.molitor larvae

表3 黃粉蟲凝乳蛋白酶與其他相似蛋白水解酶氨基酸序列比對Table 3 Amino acid sequence alignment of milk-clotting protease from T.molitor larvae with other similar proteases

2.4 黃粉蟲凝乳蛋白酶結構研究

2.4.1 黃粉蟲凝乳蛋白酶的理化性質

對黃粉蟲凝乳蛋白酶和幾種序列相似的蛋白酶進行了理化性質預測，結果如表4所示。黃粉蟲凝乳蛋白酶的分子質量相比表中其余幾種偏小，但是其不穩定性指數<40，這表明該酶性質穩定。凈電荷是在中性環境下預測的凝乳酶表面總體靜電荷，均為負，黃粉蟲凝乳蛋白酶與小牛皺胃酶的很接近，但比駱駝凝乳酶小很多，3種酶所帶負電荷殘基數相差很小，而黃粉蟲凝乳蛋白酶的正電荷殘基少于駱駝凝乳酶。該酶等電點與表中兩種已知凝乳酶相近，幾種酶的等電點都<7，均為酸性蛋白酶；該結果符合黃粉蟲腸道蛋白的研究范圍，黃粉蟲腸道中存在酸性和堿性的蛋白酶，而且主要的消化蛋白酶為酸性蛋白酶[12,25]。幾種酶的疏水性氨基酸比例都在40%左右，黃粉蟲凝乳蛋白酶偏高，這表明其三級結構可能保持較高穩定性[26]。另外，疏水性氨基酸在酶與反應底物相互作用涉及到的一些非共價鍵的結合上起著不可替代的作用，這也預示著該酶與κ-酪蛋白的復合物的結構可能更為穩定。

表4 黃粉蟲凝乳蛋白酶及其他相似蛋白水解酶理化性質及部分氨基酸殘基對比分析Table 4 Comparison of physicochemical properties and partial amino acid residues of milk-clotting protease from T.molitor larvae and other similar proteases

2.4.2 黃粉蟲凝乳蛋白酶二級結構

二級結構是指多肽鏈中主鏈原子的局部空間排布構象，主要包括α-螺旋、β-折疊和無規卷曲，其中α-螺旋在二級結構中起主要的穩定作用[27]。利用黃粉蟲凝乳蛋白酶的完整氨基酸序列預測出其二級結構，結果顯示其β-折疊的占比要略多于α-螺旋，而小牛皺胃酶和駱駝凝乳酶的β-折疊要明顯多于α-螺旋[21]，這表明黃粉蟲凝乳蛋白酶可能具有更穩定的二級結構(圖3)。3種酶二級結構的分布位置有很大差別，黃粉蟲凝乳蛋白酶在N端和C端都各有1個α-螺旋，后接幾個β-折疊，而其他兩種酶的N端和C段則是先排列出幾個β-折疊，后接1個α-螺旋。然而，與黃粉蟲腸道中的主要消化蛋白酶系具有一些相似之處[12]：它們在N端都有1個α-螺旋, 其中1種組織蛋白酶L樣蛋白酶 (pCAL2C25S)的C端也具有α-螺旋。

圖3 黃粉蟲凝乳蛋白酶二級結構預測Fig.3 The secondary structure prediction of the milk-clotting protease from T.molitor larvae注：PredSS是預測的二級結構;AA seq是氨基酸序列;H或是α-螺旋;S或是β-折疊;C是無規則卷曲

2.4.3 黃粉蟲凝乳蛋白酶三級結構

黃粉蟲凝乳蛋白酶的三級結構如圖4-a所示，不同的顏色代表不同的結構，預測模型的C-score為-1.24，擁有最高的置信度。該結構與小牛皺胃酶和駱駝凝乳酶結構相差甚遠[28]，這可能是分子質量和物種上的巨大差異造成的，也表明這是1種全新的凝乳蛋白酶。使用COACH服務器預測到了黃粉蟲凝乳蛋白酶可能的4個催化位點，分別是His87、Gly227、Ser229、Gly230(圖4-b)。預測結果的TM-score為0.821，Cov值0.864，預測結果也擁有很高的置信度。該酶的外層大多是α-螺旋和一些無規則卷曲，而酶分子的β-折疊結構占據了內部的大部分位置，并構成了1個夾層，夾層的夾角不大，其中卻包裹著該酶的活性位點，使其呈隱藏狀態，并沒有暴露在外層，正因存在這樣的位阻影響，底物難以接近和進入酶的反應中心，導致酶的催化效率偏低，酶活力不如小牛皺胃酶、駱駝凝乳酶等。

a-黃粉蟲凝乳蛋白酶三級結構;b-黃粉蟲凝乳蛋白酶活性位點;c-黃粉蟲凝乳蛋白酶的BFP值圖4 黃粉蟲凝乳蛋白酶三級結構、活性位點及BFP值預測Fig.4 The prediction of tertiary structure, active sites and normalized B-factor of milk-clotting protease from T.molitor larvae注：粉紅色代表α-螺旋，黃色代表β-折疊，藍白相間的表示無規則卷曲，紫色代表活性位點

I-TASSER 還預測了該酶中每個氨基酸的歸一化B因子(normalized B-factor,BFP)值(圖4-c)，BFP 值>0的氨基酸殘基是在實驗中不太穩定的結構。如圖所示，64.8%的氨基酸殘基的BFP值<0，其中又有64.4%的殘基參與構成蛋白的二級結構，這表明黃粉蟲凝乳蛋白酶的三級結構穩定性較高。

3 結論

從黃粉蟲腸中提取和分離純化出了黃粉蟲凝乳蛋白酶，通過LC-MS/MS等技術鑒定出該酶完整的279個氨基酸序列；經預測發現，該酶為酸性蛋白酶，理化性質穩定，二級結構穩定；與小牛皺胃酶和駱駝凝乳酶比較發現三者在N端序列和二級結構等方面有較大差異；通過同源建模預測出該酶的三維結構以及可能的活性位點Ser229等。本研究可為黃粉蟲凝乳蛋白酶的跨膜蛋白分析、與κ-酪蛋白復合物的構建等進一步的研究提供科學依據。