超微粉碎對米糠多酚的組成及抗氧化活性的影響

衛子顏，謝勇，王朦朦，蔡夢思，唐蘭蘭，劉雄

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

據統計，稻谷是我國的第二大糧食作物，其中2019年產量為1.078 7億t[1]。米糠是稻米加工的副產物，是米粒(胚乳)的表皮、胚和一些淀粉質胚乳的混合物，約占稻谷重量的10%，含有豐富的不飽和脂肪酸、膳食纖維、礦物質及多酚等營養成分[2]。研究表明，米糠中的多酚含量達4.13 mg GAE/g[3]，多酚種類主要包括阿魏酸、對香豆酸、香草醛、咖啡酸、香豆酸等，具有較好的抗氧化活性；此外，這些酚類物質能通過調節腸道菌群的構成及腸道酶的活性有效改善胃腸健康[4]、通過抑制NF-κB等信號通路來減輕炎癥保護心肌細胞[5]、預防結腸癌等疾病[6]。然而，由于米糠的口感較粗糙且不易消化，大部分被用作飼料或直接被丟棄，造成了米糠資源的浪費。

超微粉碎是一種高效、綠色的食品加工技術，通過機械或流體動力學的方法將原料加工為微米級甚至是納米級，減小原料的粒徑，不僅可以改善原料的理化、功能、食用特性，還可促進原料中營養物質、生物活性組分的釋放和吸收[7-8]。CHAIT等[9]、蔡婷等[10]發現超微粉碎處理能顯著提高角豆、苦蕎中多酚類物質的含量及抗氧化能力。目前，超微粉碎技術應用于米糠的研究大部分體現在理化及功能性質方面[11-12]，而對米糠中多酚的組成及功能活性影響的關注甚少。例如，WANG等[13]研究了米糠中結合酚類化合物的組成及抗氧化活性，發現結合酚中的酚酸主要有阿魏酸、香草醛和對羥基苯甲酸等，張媛等[14]探究了超微粉碎對脫脂小米米糠抗氧化性的影響，發現微粉粒徑的大小與其抗氧化能力呈負相關性，但對超微粉碎處理對米糠中多酚組成和抗氧化活性之間的相關性未進行深入的探討。另外，鮮有人關注加工對米糠多酚在消化道的釋放的影響。

因此，本研究將米糠進行超微粉碎處理，探究超微粉碎對米糠中酚類化合物的含量及組成、DPPH自由基清除力、ABTS陽離子自由基清除力、鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power，FRAP)以及體外胃腸釋放度的影響，并分析米糠多酚的含量、組成與抗氧化能力之間的相關性，以期建立超微粉碎對米糠多酚類成分的影響規律，為米糠的深加工研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠，湖北省恩施市新塘鄉；標準品沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、香草醛、香草酸、阿魏酸、槲皮素，北京邁瑞達科技有限公司；水溶性維生素E標準品、ABTS、DPPH、福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶、胰酶、膽鹽，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

BJ-300型高速多功能粉碎機，上海拜杰實業有限公司；CJM-SY-B高能納米沖擊磨，秦皇島市太極環納米制品有限公司；BIOTEK型酶標儀，美國基因公司；AXTG16G離心機，鹽城市安信實驗儀器有限公司；SHZ-88型水浴振蕩器，朗越儀器制造公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；Mastersizer 3000激光粒度儀，英國馬爾文公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 超微脫脂米糠粉的制備

將新鮮米糠用乙醇進行脫脂處理，烘干后過60目篩，得到粗粉；使用BJ-300型粉碎機粉碎粗粉2 min，得到微粉A；使用高能納米沖擊磨粉碎粗粉，得微粉B。用Mastersizer 3000激光粒度儀測得粗粉、微粉A、微粉B的平均粒徑分別為208.3、85.7、14.9 μm，裝袋密封，于-18 ℃冰箱保藏備用。

1.3.2 米糠游離態酚、結合態酚的提取

米糠游離酚、結合酚的提取參考文獻[15]的方法并稍做修改，稱取1.5 g米糠與50 mL預冷丙酮溶液(80%，體積分數)混合，超聲提取30 min后，以8 000×g離心10 min，重復3次，合并上清液并在45 ℃下旋轉蒸干，用甲醇定容至10 mL，-18 ℃保存。將提取完游離酚后的殘渣在室溫下加入2 mol/L的NaOH溶液40 mL，充入N2，避光振蕩1 h，用6 mol/L的HCl溶液將pH調至2.0，加入40 mL乙酸乙酯，混勻，重復5次，合并上清液在45 ℃下旋蒸，用甲醇定容至10 mL，即得結合態多酚，-18 ℃保存。

1.3.3 總酚含量的測定

參考SINGLETON等[16]的方法，并略做修改。用Folin-Ciocalteu法進行測定，以沒食子酸作為標準品制作標準曲線。

1.3.4 HPLC法檢測米糠中的酚類物質

取樣品溶液過0.22 μm濾膜，用日本島津LC-20A HPLC儀檢測多酚組成。色譜條件：色譜柱為Thermo-C18(150 mm×4.6 mm，3 μm)、流動相流速為0.7 mL/min、柱溫30 ℃、進樣量10 μL、檢測波長為280；流動相A相：0.4%乙酸水溶液，B相：乙腈。梯度洗脫程序：5%B (0 min)，25%B (0～40 min)，35%B (40～45 min)，50%B (45～50 min)，5%B (50～55 min)。以沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、香草醛、香草酸、阿魏酸、槲皮素為標準品，混標進樣，繪制標準曲線得各標準品的線性方程，計算提取液中的主要酚類物質含量。圖1為9種混合多酚標準品的HPLC圖，表1為各標準品峰面積與質量濃度之間的回歸方程。

1-沒食子酸；2-原兒茶酸；3-對羥基苯甲酸；4-香草酸；5-咖啡酸；6-香草醛；7-對香豆酸；8-阿魏酸；9-槲皮素圖1 多酚混合標準品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard mixture

表1 九種標準品的回歸方程Table 1 Regression equations of nine standard substances

1.3.5 體外抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除力測定

參考ROY等[17]的方法，將樣品稀釋20倍，向1 mL待測樣品中加入48 mg/L的DPPH溶液2 mL，混勻，在室溫下避光反應30 min，測定517 nm處的吸光度。以Trolox為參照，結果以每100 g多酚提取物(以干基計)所對應的Trolox當量表示(μmol Trolox/100g)。

1.3.5.2 ABTS陽離子自由基清除力測定

參考徐洪宇等[18]的方法測定。取0.1 mL待測溶液與2.9 mL ABTS陽離子自由基稀釋液混合，于黑暗處30 ℃反應10 min，并在734 nm下測定其吸光度。以去離子水作空白，結果以每100 g多酚提取物(以干基計)所對應的Trolox當量表示(μmol Trolox/100g)。

1.3.5.3 FRAP測定

根據中國南京生物工程研究所提供的試劑盒的要求進行測定。酚類樣品將Fe3+還原為Fe2+，在測定過程中，Fe2+與菲咯啉類物質反應生成絡合物。記錄520 nm處的吸光度，結果以每克多酚提取物(以干基計)所還原的Fe2+當量表示(μmol Fe2+/g)。

1.3.6 體外模擬胃、腸消化

參考SUN等[19]的方法稱取0.5 g米糠粉，加入50 mL胃液，混勻后，在37 ℃水浴中水平振蕩(150 r/min)消化1 h，然后將所得的消化物以4 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液作為胃消化液，-20 ℃貯存。剩余消化液用10% NaOH溶液調至pH為7.0，然后加入5 mL腸液，混勻，在37 ℃水浴中水平振蕩(150 r/min)消化4 h，然后將所得的消化物以4 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液作為腸消化液，-20 ℃貯存。

1.3.7 多酚化合物的體外釋放度

參考YOU等[20]的方法計算酚的體外釋放度，模擬體外胃腸消化后酚的釋放度按公式(1)計算。

(1)

式中：A是在體外消化后樣品中的總酚含量，mg；B是體外消化前樣品中的總酚含量，mg。

1.4 數據處理與分析

本研究中每個試驗均重復進行3次，采用Microsoft Excel 2019 統計數據、SPSS 25.0分析顯著性、Origin 2018軟件作圖，實驗結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 超微粉碎對米糠多酚含量的影響

超微粉碎后米糠的多酚含量變化如表2所示，2種微粉的游離酚、總酚含量均顯著高于粗粉(P<0.05)，而結合酚含量則低于粗粉組。與粗粉相比，微粉A、B的總酚含量分別增加了2.30%、5.21%。超微粉碎處理顯著提高了米糠多酚等營養物質的溶出，這與趙萌萌等[21]報道超微粉碎后青稞麩皮中多酚含量增加的結果一致。一方面是由于超微粉碎處理使米糠的細胞壁結構被破壞，米糠粉體的蛋白質、膳食纖維網絡結構發生變化、細化，細胞內部的成分溶出的阻力減小，從而使米糠中酚類物質的溶出率提高；另一方面，超微粉碎處理增大了米糠粉體的孔隙率以及與提取溶劑的接觸面積，使提取更充分，從而增加了微粉多酚提取物的含量。而超微粉碎處理后結合酚的含量均有所降低，這與TAO等[22]發現超微粉碎柑橘皮渣中結合酚含量下降18.0%的結果類似。這可能是機械化作用及粉碎過程中的熱效應可使多酚與細胞壁物質之間的共價作用或非共價作用解除，結合酚與細胞壁結構成分如纖維素、木質素等之間的酯鍵、糖苷鍵部分斷裂，而導致結合態多酚向游離態多酚轉化[23]。

表2 超微粉碎處理的米糠中多酚含量 單位:mg GAE/g

2.2 超微粉碎處理對米糠多酚組成的影響

超微粉碎后米糠中酚類物質(游離型、結合型)的主要成分與含量如表3所示。

表3 超微粉碎處理的米糠中多酚的組成及含量 單位:μg/g

超微粉碎處理對米糠中酚類物質的組成及含量均有一定影響，且粗粉、微粉A、微粉B的總酚類物質含量差異顯著(P<0.05),分別為1 466.97、1 620.44、1 666.11 μg/g。米糠中提取出的酚類物質主要有原兒茶酸、香草酸、對香豆酸、香草醛、阿魏酸，其中游離酚以香草酸、香草醛、對香豆酸、阿魏酸為主，結合酚以香草醛、對香豆酸、阿魏酸為主。阿魏酸含量最多，達1 234.53 μg/g，是米糠結合酚中最主要的酚酸，只有少量的對羥基苯甲酸、咖啡酸。不同粉碎方式對米糠提取物中多酚組分有一定影響，超微粉碎處理后游離酚中原兒茶酸、香草醛、阿魏酸含量明顯增加，結合酚中對香豆酸、阿魏酸含量明顯增加。由于本實驗選用的標準品種類以及檢測條件有限，米糠多酚提取物中還存在未檢出的單體酚類化合物。如WANYO等[24]從米糠多酚提取物中除檢出原兒茶酸、對香豆酸、阿魏酸，還檢測出丁香酸和芥子酸。ZHANG等[25]在米糠多酚提取物中還檢出山萘酚、異阿魏酸。

2.3 超微粉碎處理對米糠多酚抗氧化活性的影響

如圖2所示，米糠粗粉及2種微粉的多酚提取物均有一定的抗氧化活性，且微粉組的抗氧化活性顯著高于粗粉(P<0.05)。米糠粉體的DPPH自由基清除力(圖2-a)、ABTS陽離子自由基清除力(圖2-b)、FRAP(圖2-c)均隨粉碎粒度的減小而逐漸增大，其中微粉B的多酚提取物具有最高的抗氧化能力。相較于粗粉，微粉B多酚的DPPH自由基清除力、ABTS陽離子自由基清除力、FRAP分別增加了33.21%、22.88%、30.11%。一方面可能是因為米糠微粉的粒徑越小，組織被破碎的程度越徹底，多酚等抗氧化物質與提取溶劑的接觸面積增大，更易于溶出，使粉體的抗氧化活性提高；另一方面可能是超微粉碎處理后米糠粉體中的多酚組成發生了變化，微粉中抗氧化性較強的酚酸，如對香豆酸、阿魏酸等含量增加[26]，從而增強了粉體的抗氧化能力。

a-DPPH自由基清除力；b-ABTS陽離子自由基清除力；c-FRAP還原能力圖2 超微粉碎處理對米糠多酚抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of ultrafine grinding treatment on the antioxidant activity of rice bran polyphenols注：字母a、b、c表示差異顯著(P<0.05)

2.4 米糠酚類物質含量與抗氧化活性之間的相關性分析

為進一步明確米糠中的酚類物質含量與其抗氧化活性的關系，進行相關性分析。由表4可知，米糠中的總酚含量與DPPH、ABTS、FRAP法測定的抗氧化活性均呈顯著正相關(P<0.05)，其相關系數分別為0.989、0.997、0.986。米糠中多酚含量越高，其清除自由基的能力越強，說明米糠酚類提取物中含有豐富的抗氧化物質。對香豆酸、阿魏酸、香草醛與米糠多酚提取物的DPPH自由基清除力、ABTS陽離子自由基清除力、FRAP成顯著正相關(P<0.05)，說明對香豆酸、阿魏酸、香草醛是米糠多酚提取物中抗氧化的主要貢獻物質，這與ZHAO等[27]報道的米糠多酚中對香豆酸、阿魏酸是清除自由基能力的主要貢獻物質的結果一致，可能是由于對香豆酸、阿魏酸在米糠多酚中有較高的含量。

2.5 體外模擬胃腸消化過程中米糠總酚的含量及釋放度

酚類要在人體內發揮健康益處，前提是它們可以通過胃腸道被吸收和代謝，最終在特定組織或器官上起作用，發揮其健康益處。在消化過程中，大多數游離酚的釋放主要發生在上消化道，而結合酚主要通過腸道酶和微生物酶的作用在較低的消化道中，破壞結合酚與細胞壁之間的共價鍵來釋放結合酚[28]。由表5可知，米糠中的總酚含量在經過體外模擬胃腸道消化后，呈現出先降低后升高的趨勢，這與朱秀靈等[29]關于蘋果中的酚類化合物體外消化的研究結果相似，說明胃腸消化會使酚類化合物發生降解或者轉換，從食物基質中釋放出來。且腸道消化期間酚類化合物的釋放量增加，可能是由于腸酶和膽汁鹽的作用，使與基質結合的酚類化合物得到釋放。酚類物質的體外消化釋放度隨米糠粒徑的減小而逐漸增加，與粗粉相比，微粉A、B的體外釋放度分別提高了2.61%、7.31%。這可能是因為超微粉碎后的米糠粒徑越小，比表面積越大，從而增強了細胞壁中的多酚與胃腸消化液之間的相互作用，促進多酚的釋放。此外，超微粉碎會使糊粉細胞破裂，改變了食物基質中酚類物質的結構特性，及其與蛋白質、多糖等成分的相互作用，使多酚更具有生物可及性[30]。

表4 米糠中酚類物質含量與體外抗氧化活性的相關性分析Table 4 Correlation analysis of phenolic substances in rice bran and antioxidant activity in vitro

表5 體外胃腸消化后米糠中酚類化合物的釋放度 單位：mg GAE/g樣品

3 結論

(1)米糠經超微粉碎處理后，其多酚提取物含量均顯著增大(P<0.05)。與粗粉相比，微粉A、B的多酚提取物含量分別增加了2.30%、5.21%，微粉B(粒徑為14.9 μm)的多酚提取物含量最高，為(5.113±0.012) mg GAE/g。米糠中的酚類物質主要有原兒茶酸、香草酸、香草醛、對香豆酸、阿魏酸，其中游離酚以香草酸、香草醛、對香豆酸、阿魏酸為主，結合酚以香草醛、對香豆酸、阿魏酸為主。超微粉碎處理后游離酚中原兒茶酸、香草醛、阿魏酸含量明顯增加，結合酚中對香豆酸、阿魏酸含量明顯增加。

(2)2種微粉(粒徑分別為85.7、14.9 μm)的抗氧化活性(DPPH自由基清除力、ABTS陽離子自由基清除力、FRAP)均顯著優于粗粉(粒徑為208.3 μm)(P<0.05)，且米糠粉體的粒徑越小，其抗氧化活性越強。

(3)米糠中的多酚含量與DPPH、ABTS、FRAP法測定的抗氧化活性均呈顯著正相關(P<0.05)。米糠酚類提取物中香草醛、對香豆酸、阿魏酸是清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、還原Fe3+的主要貢獻物質。微粉A、B的體外釋放度分別提高了2.61%、7.31%。

以上表明，超微粉碎技術既減小了米糠粉體的粒徑，一定程度上提高了酚類物質的溶出率、體外抗氧化活性、體外釋放度。然而，本研究中體外消化實驗不包括結腸發酵階段，需要通過結腸發酵模型來完整地模擬米糠中多酚化合物在體內的吸收和代謝，才能更好地評價其生物體外釋放及生物利用情況，為探究米糠的功能特性提供科學依據。