富含魚油和白藜蘆醇的凝固型酸奶制備和分析

羅惠，常旋,3，程昊，梁麗*

1(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)3(恒楓食品科技有限公司，浙江 杭州，311215)

隨著人們生活水平的提高以及健康觀念的增強，營養豐富、風味獨特且易于消化吸收的酸奶受到了越來越多消費者的青睞，酸奶市場規模逐年擴增。雖然市面上酸奶產品層出不窮，但是現有酸奶產品同質化現象嚴重。隨著消費者對于營養功效的需求日益提高，營養強化型酸奶的開發逐漸成為研究熱點[1]。開發富含功能因子的營養強化型酸奶，進一步提高酸奶的營養價值，對于酸奶行業發展具有重要意義。目前，已有研究利用功能性油脂或天然活性提取物對酸奶進行營養強化。具有多種有益健康的功能食品已被報道為功能食品的十大發展趨勢之一，不同功能因子組合間增效作用也已被報道，這些都驅動了富含多種功能因子的營養強化型酸奶的研究發展。

魚油富含二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)等多不飽和脂肪酸，對促進大腦發育、改善視力以及保護肝臟等具有重要作用。但是，水不溶性及魚腥味限制了魚油在酸奶產品中的應用；而且，EPA和DHA的高不飽和雙鍵極易氧化降解，產生自由基、氫過氧化物等不穩定的中間化合物以及次級氧化產物，導致營養和感官品質的下降[2]。添加抗氧化劑可以在一定程度上抑制魚油的氧化，如綠茶多酚可以有效地改善魚油的氧化穩定性，植物甾醇也可以防止多不飽和脂肪酸的氧化[3-4]。白藜蘆醇是天然多酚化合物，具有很強的抗氧化性，并具有抗炎、保護心血管以及預防動脈粥樣硬化等功效，但低水溶性、化學不穩定性等問題同樣不利于其在酸奶中的應用[5]。利用噴霧干燥技術將功能因子包埋于微膠囊粉末，可以提高功能因子的溶解度、穩定性，掩蓋其不良風味，使得低水溶性功能因子能夠應用于酸奶中，提高酸奶營養價值。

乳清分離蛋白(whey protein isolate，WPI)具有良好的乳化性，常作為微膠囊壁材，包埋和保護芯材。利用谷氨酰胺轉移酶處理可以形成ε-(γ-谷氨?；?-賴氨酸共價鍵，能夠改善乳清分離蛋白性能[6]。阿拉伯膠(gum arabic，GA)是一種陰離子多糖，具有乳化性，不但可以吸附在油-水界面，而且可以提高微膠囊粉末玻璃化轉變溫度，降低結塊性，改善貯藏穩定性[7]。在本課題組的前期研究中，利用噴霧干燥技術，以酶交聯乳清分離蛋白以及阿拉伯膠作為壁材，制備得到魚油和白藜蘆醇共包埋微膠囊粉末，魚油和白藜蘆醇包埋率分別為(89.58±0.56)%、(88.72±1.02)%[8]。本研究將魚油微膠囊粉末、魚油和白藜蘆醇共包埋微膠囊粉末添加至凝固型酸奶中，探究微膠囊粉末對于酸奶感官品質、乳酸菌數、pH、持水力、功能因子(EPA、DHA、白藜蘆醇)穩定性以及氧化穩定性的影響，為設計開發具有功能因子的營養強化型酸奶提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白(純度92%)、酸奶發酵劑(Yo-MixTM305 LYO 100 DCU)，美國Davisco食品國際公司；阿拉伯膠、三氟化硼-甲醇溶液(14%)，Sigma-Aldrich公司；谷氨酰胺轉胺酶(transglutaminase，TGase)，泰興市東圣生物科技有限公司；反式-白藜蘆醇(純度>98%)，上海生工生物工程有限公司；魚油(食品級)，上海賀普實業有限公司；脫脂牛奶(伊利)、白砂糖，無錫歐尚超市；甲醇(HPLC級)，美國AQA公司；過氧化氫異丙苯，北京伊諾凱科技有限公司；正己烷(色譜標準物)、異丙醇、異辛烷、正丁醇、鹽酸(GR)、硫氰酸銨、氯化鋇、硫酸亞鐵、無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉，均為分析純，國藥集團(上海)化學試劑有限公司；實驗過程所用水均為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設備

分析天平、EL3002電子天平、EF20型pH計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；5804R型冷凍離心機、5424R型冷凍離心機、移液槍，艾本德中國有限公司；磁力攪拌器、漩渦混合儀，德國IKA公司；IKA T25高速分散機、AH-2100型高壓均質機(配有SDC-6智能節能恒溫槽)，TS75工業系統有限公司；B-290實驗室型噴霧干燥儀，瑞士Büchi有限公司；HS-800D恒溫水浴槽，中國太倉華利達公司；恒溫培養箱，上海精學科學儀器有限公司；CP100 NX超速離心機，日本日立公司；DC-24型氮吹儀，上海安普科學儀器有限公司；GC-2010PLUS氣相色譜儀(全自動液體/頂空，FID/FTP/FPD)，日本島津公司；UV-1800紫外可見分光光度計，蘇州普金生物科技有限公司；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-1FD超凈工作臺，無錫凱派克斯科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微膠囊粉末的制備

配制25%(質量分數)WPI溶液、35%(質量分數)阿拉伯膠溶液，攪拌使它們充分溶解后調節pH至7.0，置于4 ℃備用。根據WPI質量加入轉谷氨酰胺酶(8 U/g蛋白)，在50 ℃條件下水浴加熱1.5 h，然后將酶交聯的WPI(TG-WPI)溶液置于冰盒中，后續實驗均在冰浴條件進行。參考BAKRY等[9]的方法制備魚油微膠囊粉末。在TG-WPI 溶液中加入一定量超純水稀釋后加入魚油，于16 000 r/min下剪切2 min，獲得粗乳液；然后于10 ℃、50 MPa條件下均質3次，獲得乳狀液。乳狀液中含17.5% TG-WPI以及11.67%魚油。加入阿拉伯膠攪拌0.5 h，最終乳狀液中含15%(質量分數，下同)TG-WPI、5%阿拉伯膠、10%魚油。使用Büchi B-290實驗室型噴霧干燥儀，在進口溫度170 ℃、出口溫度(85±5)℃、進料速率540～630 mL/h、空氣流速600 L/h條件下噴霧干燥，獲得魚油微膠囊粉末。

將白藜蘆醇溶解于70%乙醇中，配制質量濃度為50.5 mg/mL的白藜蘆醇-乙醇溶液；添加白藜蘆醇-乙醇溶液至TG-WPI溶液中，并加入一定量超純水，于500 r/min下攪拌0.5 h，獲得WPI和白藜蘆醇摩爾比為1∶1的溶液；然后，制備魚油和白藜蘆醇共包埋乳狀液，最終乳狀液中含0.19%(質量分數)白藜蘆醇，再噴霧干燥制備得到魚油和白藜蘆醇共包埋微膠囊粉末。

1.3.2 凝固型酸奶的制備

將5%白砂糖加入脫脂牛奶中，攪拌使其充分溶解。設置無添加的對照組，命名為Y；其余3組加入魚油、魚油微膠囊粉末或魚油和白藜蘆醇共包埋微膠囊粉末，分別命名為FY、FMY、FRMY，不同組酸奶組成如表1所示。攪拌待添加物完全溶解后于65 ℃水浴加熱，并于20 MPa條件下均質15次；然后，將樣品于95 ℃滅菌10 min，在室溫環境待其溫度降至40 ℃；添加酸奶發酵劑(0.04 g/L)，攪拌使其混勻，隨后在40 ℃發酵，以pH=4.6判斷發酵終點，置于4 ℃冰箱后熟。制得的酸奶在4 ℃冰箱貯存21 d，測定其指標變化。

表1 酸奶組成Table 1 Composition of yogurt

1.3.3 酸奶感官評價

參考王富云等[10]的方法并作一定修改，由10名經過培訓的感評人員(5男5女)按照表2酸奶感官評價標準對各組酸奶的色澤、氣味、滋味、質構和總體接受度進行評價。

表2 酸奶感官評價標準Table 2 Sensory evaluation of yogurt

1.3.4 酸奶乳酸菌數的測定

參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》測定酸奶中乳酸菌數。

1.3.5 酸奶pH的測定

利用pH計測定各組酸奶在4 ℃貯存期間pH的變化情況。

1.3.6 酸奶持水力的測定

稱取5 g酸奶于50 mL離心管中，于4 ℃、5 000×g條件下離心5 min，取其上清液稱重。根據公式(1)計算酸奶持水力：

(1)

式中：m為酸奶質量；m1為離心后上清液的質量。

1.3.7 酸奶中功能因子穩定性的測定

稱取5 g酸奶，攪拌均勻后測定貯藏期間白藜蘆醇、DHA和EPA保留率。根據公式(2)計算4 ℃貯藏期間白藜蘆醇的保留率：

(2)

式中：c0為第1天酸奶中白藜蘆醇的含量；cn為第n天酸奶中白藜蘆醇的含量。

1.3.7.1 酸奶中白藜蘆醇的測定

參考ZHANG等[11]的方法，取一定量酸奶，加入4 mL甲醇后渦旋1 min，并于4 ℃、10 000×g條件下離心10 min，取其上清液測定在306 nm處吸光度，代入標準曲線計算白藜蘆醇含量。

1.3.7.2 酸奶中EPA、DHA的測定

參考王彩霞[12]的方法，在酸奶中加入1 mL乙醇，再加入5 mL正己烷，于10 000 r/min下剪切1 min、渦旋3 min，于4 ℃、5 000×g離心5 min后移取2 mL上層液體至具塞試管中，氮吹儀除去有機試劑，提取魚油。

魚油甲酯化：添加2 mL 0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液至含魚油的具塞試管中，渦旋1 min后于65 ℃ 水浴加熱30 min；加入2 mL三氟化硼-甲醇溶液，于70 ℃加熱30 min。然后，將具塞試管冷卻，加入2 mL正己烷并渦旋30 s，加入4 mL飽和NaCl溶液，吸取上層有機液并加入少量無水硫酸鈉后，取清液過有機相濾膜。

氣相色譜分析：色譜柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣體積為1 μL，氣化室溫度為250 ℃，色譜柱流量1.0 mL/min，N2吹掃流量3 mL/min，分流比為10∶1；色譜柱溫度為50 ℃；升溫程序：初始溫度為50 ℃，持續1 min，以25 ℃/min的升溫速率升至200 ℃，再以3 ℃/min 的升溫速率升至230 ℃，持續23 min；檢測器溫度為250 ℃；尾吹氣為氮氣(30 mL/min)，氫氣(40 mL/min)，空氣(400 mL/min)。

1.3.8 酸奶中油脂氧化的測定

參考KLINKESORN等[13]的方法并做一定修改。在酸奶中加入1.5 mL異辛烷/異丙醇(體積比3∶1，)混合液，渦旋30 s后于3 000×g條件下離心5 min提取氫過氧化物。取0.2 mL上層有機相，添加到2.8 mL 甲醇/正丁醇(體積比2∶1)混合液中，再加入15 μL硫氰酸銨溶液(3.94 mol/L)和15 μL亞鐵離子溶液(在酸性溶液中將0.132 mol/L氯化鋇溶液和0.144 mol/L硫酸亞鐵溶液以體積比為1∶1混合得到)，渦旋30 s后避光反應20 min，測定510 nm處吸光度，通過過氧化氫異丙苯標準曲線確定氫過氧化物濃度。

1.4 數據處理

實驗結果以平均值±標準偏差表示；采用SPSS 20.0軟件進行單因素ANOVA分析，P<0.05說明數據之間存在顯著性差異；使用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 感官評價

世界衛生組織和聯合國糧農組織推薦的DHA和EPA每日攝入量為250～2 000 mg，參考此攝入量，添加魚油及微膠囊粉末至酸奶中，制得的酸奶外觀形態如圖1所示，4組酸奶均為凝固狀，其中對照組酸奶顏色呈乳白色，色澤均勻，但有少許乳清析出；而添加魚油及微膠囊粉末組酸奶顏色偏黃，表面光滑，凝乳細膩且無明顯乳清析出。對貯藏前后的酸奶進行感官評定，評價結果如圖2所示。由圖2-a可知，魚油本身特有的魚腥味會對酸奶的氣味、滋味造成不良影響，使得FY組酸奶的可接受程度明顯下降。微膠囊化可以掩蓋魚油的魚腥味，FMY及FRMY組酸奶的氣味、滋味均明顯優于FY組酸奶，這與JAMSHIDI等[14]所獲得的結果一致。此外，微膠囊粉末的加入使得酸奶的質構有所改善，FMY及FRMY組酸奶均勻細膩且無乳清析出，總體接受度也明顯優于FY組酸奶，ZHONG等[15]同樣發現添加魚油/谷維素納米乳液強化酸奶可以改善酸奶的質地。在4 ℃條件下貯藏21 d后，Y組酸奶的氣味及滋味評分有所下降；直接添加魚油的FY組酸奶所有指標評分都相對較低；FMY及FMRY組酸奶的氣味及滋味評分未發生明顯變化，且貯藏后仍能保持較好的質構特性，無明顯乳清析出。由此可見，乳清蛋白微膠囊粉末可以作為酸奶穩定劑，有效防止貯藏期間魚腥味的加重。然而，微膠囊化不能完全掩蓋魚腥味，導致貯藏后酸奶總體接受度有所下降，該情況還有待進一步改善。

圖1 酸奶外觀形態圖Fig.1 Appearance of yogurt

a-貯藏前酸奶；b-貯藏后酸奶圖2 酸奶貯藏前后感官評定結果Fig.2 Sensory evaluation of yogurt before and after storage

2.2 乳酸菌數

保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌是酸奶發酵過程中常用的乳酸菌菌種，具有產酸增黏作用，對于酸奶的風味及質地具有重要影響，一般認為酸奶乳酸菌總數達106CFU/g以上才能保證足夠的益生活性[16]。由表3、表4可以看出，隨著貯藏時間的延長，4組酸奶的保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌菌數均有所減少，但貯藏期間其乳酸菌菌落數均高于106CFU/g。魚油及微膠囊粉末的加入對于酸奶乳酸菌數無明顯影響，說明魚油及微膠囊粉末對乳酸菌沒有抑制作用。FENG等[17]也發現加入蝦青素微膠囊的酸奶其乳酸菌數與原味酸奶無明顯差異，而在酸奶中添加茴香油同樣不會對乳酸菌活性產生顯著影響。

表3 貯藏期間酸奶的保加利亞乳桿菌菌落數Table 3 Lactobacillus bulgaricus activity of yogurt during storage

表4 貯藏期間酸奶的嗜熱鏈球菌菌落數Table 4 Streptococcus thermophilus activity of yogurt during storage

2.3 pH

pH會對酸奶的風味及口感產生一定影響，貯藏期間酸奶的pH變化情況如表5所示。隨著貯藏時間的延長，4組酸奶的pH均呈現逐漸下降的趨勢，其中Y組及FY組酸奶pH下降趨勢一致，而FMY組及FRMY組酸奶pH變化趨勢相同。酸奶pH的降低是乳酸菌發酵使得乳糖分解產生乳酸所導致的，貯藏前期乳酸菌代謝活性相對較強，因而酸奶pH降低較快，而貯藏后期乳酸菌代謝減弱，因而pH無明顯變化[18]。貯藏21 d后，各組酸奶pH均降至4.2左右，魚油及微膠囊粉末的加入并未顯著影響酸性物質的產生。ABEDI等[19]同樣發現貯藏4周后添加黑種草籽油微膠囊的營養強化型酸奶和對照組酸奶pH沒有顯著差異。

表5 貯藏期間酸奶的pH值Table 5 pH of yogurt during storage

2.4 持水力

酸奶持水力是指凝固型酸奶持有全部或部分自身水的能力，是衡量酸奶穩定性的重要指標之一。表6為貯藏期間酸奶的持水力變化情況，由表6可知，4種凝固型酸奶的持水力在貯藏期間均無明顯變化，其中Y組酸奶持水力相對較低，酸奶三維凝膠網絡結構穩定性相對較差。魚油加入后，可以與酪蛋白相互作用形成凝膠網絡，使得FY組酸奶持水力有所提高[20]。而FMY及FRMY組酸奶的持水力顯著高于FY及Y組，可見微膠囊粉末的加入有利于提高酸奶持水力，防止貯藏期間乳清的析出，孫亞利[21]也發現添加苦蕎黃酮提取物微膠囊的酸奶持水力優于普通酸奶。付麗等[22]同樣發現乳清蛋白粉的加入可以明顯提升酸奶持水力。這可能是由于乳清蛋白與酪蛋白相互作用，形成蛋白質均勻多孔網狀結構，使得蛋白與水的結合能力有所增強，從而可以防止乳清的析出。

表6 貯藏期間酸奶的持水力Table 6 Water holding capacity of yogurt during storage

2.5 功能因子穩定性

魚油富含多不飽和脂肪酸，其中EPA可以增強機體免疫功能、降低膽固醇水平、預防和治療動脈硬化等心血管疾病，DHA則具有促進大腦發育、提高記憶力、保護肝臟和改善視力等作用。圖3-a、圖3-b分別為4 ℃ 貯藏期間酸奶中EPA、DHA保留率。貯藏期間FY、FMY及FRMY組酸奶中EPA及DHA含量均呈現下降趨勢，直接添加魚油的FY組酸奶中EPA、DHA保留率明顯降低，貯藏21 d后剩余55.54% EPA和52.50% DHA。而FMY組酸奶EPA、DHA保留率均明顯高于FY組酸奶，分別為64.42%和63.47%。FRMY組酸奶EPA、DHA保留率則與FMY組接近，分別為70.59%和69.34%，白藜蘆醇的加入沒有顯著影響酸奶中EPA和DHA的保留率。并且，酸性條件有利于延緩白藜蘆醇的降解[23]。由圖3-c可知，貯藏期間白藜蘆醇保留率隨時間延長有所下降，但貯藏結束后，FRMY組酸奶中仍能保留約80%白藜蘆醇。DE MOURA等[24]添加玫瑰茄花青素微粒于酸奶中，發現在貯藏后其酚類化合物含量高于直接添加游離提取物的酸奶。

a-EPA保留率；b-DHA保留率；c-白藜蘆醇保留率圖3 貯藏期間FY、FMY和FRMY組酸奶中EPA、DHA保留率及FRMY組酸奶中白藜蘆醇保留率Fig.3 Retention of EPA, DHA in FY, FMY and FRMY yogurts and of resveratrol in FRMY yogurt during storage注：大寫字母代表不同時間，小寫字母代表不同樣品；不同字母代表存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.6 油脂氧化

由于魚油含有高不飽和雙鍵，因此在加工和貯藏過程中極易發生氧化，導致酸敗及異味的產生。圖4為FY、FMY及FRMY組酸奶在4 ℃貯藏期間氫過氧化物值的變化情況。貯藏1 d后，FY組酸奶的氫過氧化物值(0.61 mmol/g油)略高于FMY及FRMY組酸奶。貯藏過程中，3組酸奶的氫過氧化物值均呈現逐漸增大的趨勢。貯藏21 d后，添加2種微膠囊粉末的酸奶，其氧化程度均低于魚油組酸奶，說明微膠囊化有利于提高魚油的氧化穩定性。TAMJIDI等[18]同樣發現利用明膠/阿拉伯膠包埋魚油可以有效防止油脂的氧化。此外，貯藏結束后FRMY組酸奶的氫過氧化物值明顯低于FMY組酸奶，這表明白藜蘆醇的加入可以進一步抑制魚油的氧化。

圖4 貯藏期間FY、FMY和FRMY組酸奶氫過氧化物值Fig.4 Hydroperoxide value in FY, FMY and FRMY yogurts during storage

3 結論

利用基于乳清蛋白的微膠囊粉末對魚油進行包埋和保護有利于掩蓋其固有魚腥味，提高酸奶的可接受程度。微膠囊粉末的加入能夠提高酸奶持水力，改善酸奶的質構，防止貯藏期間乳清的析出。貯藏期間，酸奶乳酸菌數及pH均呈現下降趨勢，但微膠囊粉末的加入對于酸奶乳酸菌數及酸性物質的產生沒有顯著影響。添加魚油和白藜蘆醇共包埋微膠囊粉末可以提高酸奶的營養價值，酸奶于4 ℃貯藏21 d后仍可保留70.59% EPA、69.34% DHA以及81.06%白藜蘆醇，可見微膠囊化對于功能因子有較好的保護效果。此外，微膠囊化顯著提高了魚油的氧化穩定性，白藜蘆醇的加入有利于進一步抑制魚油氧化。共包埋以及微膠囊化有利于實現魚油、白藜蘆醇等低水溶性功能因子在酸奶行業的應用，具有良好的發展前景及巨大的市場潛力。