不同品種花生紅衣中八種酚類物質成分分析

高錦鴻，蘆鑫，孫強，黃紀念*，王強，賈聰，王瑞丹

1(河南省農科院農副產品加工研究所，河南 鄭州，450002)2(河南省農產品生物活性物質工程技術研究中心，河南 鄭州，450002)3(中國農業科學院農產品加工研究所，北京，100193)

花生，一年生豆科草本植物[1]，是重要的高蛋白油料作物之一。我國是世界花生生產大國，2019年產量約1 752萬t。花生紅衣作為花生加工副產物之一，資源豐富，年產量約45萬t(按花生總質量的2.6%計[2])。目前，除少量花生紅衣應用于制藥及食品加工[3]，大多用于飼料或被舍棄，其商業價值十分低廉，僅約70 ～120元/t，在很大程度上造成資源浪費。

花生紅衣含有豐富的營養成分，除含有約37%～42%的纖維素、10%～14%的脂肪和11%～17%的蛋白外，還含有約15%的酚類物質[4]。花生紅衣中含有的酚類物質具有降血糖、清除自由基、促進血小板生成、降血脂及抑菌等多種生理功能[5]。CHRISTMAN等[6]通過體內外試驗研究發現花生紅衣多酚提取物具有降血糖功效；趙萍等[7]的研究表明花生紅衣多酚提取物對DPPH自由基具有較好的清除能力；劉婧依等[8]探討了升血小板膠囊聯合花生衣提取液治療特發性血小板減少性紫癜患者的臨床效果，結果表明血小板數目高于對照組。為充分利用花生紅衣中的酚類物質，國內外學者對花生紅衣的提取方法開展了諸多研究，目前采用的主要方法包括溶劑提取、超聲波輔助提取及微波輔助提取[9]。

研究發現，花生紅衣酚類提取物的活性強弱受其酚類物質的組成和含量的影響[10-11],而花生紅衣中酚類物質的組成和含量又受到花生品種等因素的影響，例如，宋昱等[10]對3個不同花生品種的花生衣中的原花青素進行了檢測分析，發現花生衣原花青素組分的單體種類及含量均不同；張姣勤[11]對8個不同花生品種中的多酚含量進行測定，結果可大致分為3組，含量分別為190、160、130 mg/g，總酚含量具有較大差異，且不同單酚間也具有明顯差異，但單酚含量未進行定量分析。因此分析不同品種間花生紅衣中的酚類物質組成和含量，掌握花生紅衣酚類物質的組成變化規律，對于花生紅衣制藥及功能性花生紅衣食品的選材和質量控制尤為重要。目前，雖然國內外開展了花生紅衣酚類成分分析的研究，但研究不系統，僅集中于總酚、某種酚類濃度檢測，且未覆蓋在不同花生品種中分布規律[12-15]。此外，現有的檢測花生紅衣酚類物質的主要方法為HPLC，由于花生紅衣中的酚類物質組成復雜，不同酚類濃度相差懸殊，造成現有高效液相檢測方法存在預處理繁瑣，檢測過程復雜，難以兼顧多種酚類檢測等缺點，難以滿足花生紅衣酚類物質檢測工作，有必要建立一種更加方便、準確、高效的適宜檢測花生紅衣中主要酚類物質高效液相方法。

因此，本文通過實驗構建能夠同時檢測8種花生紅衣中酚類的HPLC方法，通過分析40種花生紅衣的酚類物質組成，利用相關性分析方法和聚類分析方法進行相關性分析和類群劃分，以揭示花生紅衣間8種酚類成分的含量特點、不同酚類成分之間的相關性及類群之間的差異性，為花生紅衣的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：供試40個花生品種由河南綠色作物研究中心提供，具體花生品種如下：遠雜9102(YZ9102)、花育23(HY23)、花育24(HY24)、魯花11(LH11)、天府3號(TF3)、豐華(FH)、四粒紅(SLH)、冀花2號(JH2)、二粒紅(ELH)、白沙1016(BS1016)、冀花5號(JH5)、花育26(HY26)、大白沙(DBS)、拔二罐(BEG)、黑花生(HHS)、白沙(BS)、花育25號(HY25)、白沙308(BS308)、冀花4號(JH4)、國育2016(GY2016)、小白沙(XBS)、大果101(DG101)、豫花9414(YH9414)、大麻(DM)、商花5號(SH5)、魯花14(LH14)、徐花13(XH13)、徐花14(XH14)、遠雜9307(YZ9307)、青花6號(QH6)、花育16(HY16)、漯花8號(LH8)、豫花25(YH25)、花育37(HY37)、花育19(HY19)、豐花1號(FH1)、冀花20(JH20)、花育48(HY48)、花育42(HY42)、花育38(HY38)，其中HHS、GY2016為黑花生。花生經去紅衣機分離并收集紅衣，保存于-4 ℃冰箱中。

原兒茶素、表沒食子酸兒茶素、兒茶素、咖啡酸、表兒茶酸、原花青素C1、阿魏酸、表兒茶素沒食子酸酯和蘆丁標準品(純度≥98%)，北京世紀奧科生物技術有限公司；乙腈(色譜純)，美國VBS公司；冰乙酸(HPLC≥99.9%)，阿拉丁；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Ultimate 3000高效液相色譜儀，美國賽默飛公司；XS205電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；T18DS25高速均質機，艾卡(廣州)儀器設備有限公司；XH-2008DE智能溫控雙頻超聲波合成/萃取儀，北京祥鵠科技發展有限公司；Lyovac GT1 型冷凍干燥機，德國SRK公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HPLC條件

HPLC色譜柱：X-Bridge shield RP18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫，30 ℃；進樣量，10 μL；檢測波長：250 nm(原兒茶酸、表沒食子酸兒茶素)、280 nm(兒茶素、表兒茶素、原花青素C1、表兒茶素沒食子酸酯)、320 nm(阿魏酸、咖啡酸)和370 nm(蘆丁)；流動相A：0.1%乙酸-乙腈溶液，流動相B： 0.1%乙酸-水溶液；梯度洗脫：0～7 min(5% A～7% A，1 mL/min)； 7～30 min(7% A～10% A, 1 mL/min)；30～60 min(10% A～12% A，1 mL/min)；60～80 min(12% A～15% A，1 mL/min)；80～100 min(15% A～80% A, 1～0.9 mL/min )。

1.3.2 標準品溶液的制備

分別精確稱取一定質量的原兒茶酸、兒茶素、咖啡酸、表兒茶素、原花青素C1、阿魏酸、表兒茶素沒食子酸酯和蘆丁8種標準品，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，其中蘆丁需加入少量二甲基亞砜助溶。隨后配制成一系列濃度的混合標準溶液。將標準品溶液用0.45 μm微孔過濾膜過濾，用HPLC分析檢測，并建立相對應的回歸方程。

1.3.3 花生紅衣中酚類物質的提取

1.3.3.1 超聲波輔助提取[12]

以大果101為例，取適量花生紅衣，置于粉碎機中，粉碎過60目篩，精確稱取適量篩下物置于錐形瓶中，分別采取均質提取、超聲提取和回流提取等提取方法，對不同提取溶劑、提取時間、料液比等因素做單因素試驗探究酚類化合物的提取率，以提取率為主要指標，綜合考慮提取方法，選擇80%(體積分數)乙醇水溶液作為提取溶劑、料液比1∶30(g∶mL)、超聲波輔助提取花生紅衣中酚類物質，超聲時間20 min，超聲功率 300 W，超聲溫度40 ℃，超聲提取后5 000 r/min 離心15 min，收集上清液，沉淀重復上述操作2次，合并3次花生紅衣酚類化合物提取液，經減壓濃縮、真空冷凍干燥，獲得花生紅衣酚類提取物。

1.3.3.2 供試樣品的制備

將各花生品種的花生紅衣酚類提取物保存于干燥器中備用。經考察溶劑、料液比、超聲波輔助溶解時間等因素，選擇甲醇為溶劑，稱取0.1 g花生紅衣酚類提取物，以料液比1∶50(g∶mL) 配制成溶液，超聲輔助溶解20 min，10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，既得供試樣品，4 ℃保存備用。

1.3.3.3 花生紅衣中酚類化合物的檢測

將供試樣品溶液經0.22 μm有機濾膜過濾后置于進樣瓶中，用于HPLC檢測。以標準溶液質量濃度(μg/mL)為縱坐標，以對應峰面積為橫坐標，繪制標準曲線，并進行回歸計算得到8種酚類化合物回歸方程，檢測供試樣品中8種酚類物質的含量。每種酚類化合物分別以信噪比為3和10對應的酚類化合物標準品質量濃度計算檢出限和定量限。

1.4 數據統計分析

所有數據均為3次重復實驗的平均值，應用SPSS 16.0 和Origin 8.5對數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 八種酚類標準品溶液和花生樣品的HPLC檢測結果

由圖1-a可以看出，在此色譜條件下，8種酚類化合物的標準品可得到較好的分離。由圖1-b可知，大果101花生紅衣中除蘆丁外，其余7種酚類物質均有檢出，且目標峰的保留時間與標準品溶液的保留時間一致，在此色譜條件下花生紅衣樣品中的酚類化合可物得到較好的分離。

峰1-原兒茶酸；峰2-兒茶素；峰3-表兒茶酸；峰4-阿魏酸；峰5-原花青素C1；峰6-表兒茶素沒食子酸酯；峰7-咖啡酸；峰8-蘆丁a-八種酚類物質在250、280、320、370 nm處的液相檢測圖譜；b-花生樣品大果101提取液在相同條件下的液相檢測圖譜圖1 酚類標準品及DG101的高效液相檢測圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of phenolic standard and DG101

2.2 單酚標準曲線

在優化的實驗條件下，將一系列混合標準品溶液進HPLC分析，以標準溶液質量濃度(μg/mL)為縱坐標，各酚類物質對應的峰面積為橫坐標，繪制標準曲線，如表1所示，8種酚類物質在標準品質量濃度范圍內均呈現良好的線性關系。

表1 八種酚類物質的標準曲線、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges, limits of detection and limits of quantitation of eight phenols

2.3 HPLC方法學考察

如表2所示，HPLC方法學考察結果顯示，8種酚類物質的精密度相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為0.67%～1.96%，穩定性RSD為0.73%～2.31%，重復性RSD為1.85%～3.92%，平均回收率為94.15%～100.62%，RSD為0.86%～2.74%，表明儀器精密度良好，實驗方法穩定性、重復性和加標回收率均符合常規定量分析要求，可以滿足花生紅衣中8種酚類物質的含量測定要求。且該HPLC方法與張姣勤[11]建立的花生紅衣酚類HPLC檢測方法相比，基線平穩，雜峰少；與劉翠[16]建立的HPLC方法相比，省去了固相微萃取柱的樣品純化，采用甲醇再溶解，既除去部分雜質，又提高供試樣品濃度，降低檢測成本；與RESURRECCION等[17]建立的檢測方法相比，簡化了樣品的純化步驟，減少了有毒試劑的使用，且降低了流動相的流速，對設備要求降低，更便于推廣使用。

表2 八種酚類物質的方法學考察Table 2 Methodological study of eight phenols

2.4 八種酚類物質的統計分析和熱圖分析

采用上述HPLC檢測方法，對40種不同品種花生紅衣中的8種酚類物質進行檢測，為了直觀系統地表明各品種間中不同酚類物質的變化情況，通過描述性分析對于40種不同品種花生紅衣中的酚類物質進行了綜合表述。由表3可知，40種不同品種花生紅衣的8種酚類物質的總含量平均值為1.692 mg/g，且各個品種間酚類物質總含量存在差異，介于0.901～3.390 mg/g。8種酚類物質在不同品種的花生紅衣中存在差異性，變異系數介于0.447～4.783，其中蘆丁的變異系數最大為4.783，其次為表兒茶酸和咖啡酸分別為2.950和0.892，研究結果與張姣勤[11]、劉翠[16]、RESURRECCION等[17]的研究結果一致。8種酚類物質中，原花青素C1在花生紅衣中的平均含量最高為0.729 mg/g，含量分布為0.141～1.947 mg/g，其次為兒茶素平均含量0.406 mg/g，含量分布為0.181～1.120 mg/g，分別占8種酚類總含量的43.08%和24.00%，平均含量較低的酚類物質為咖啡酸、表兒茶酸和蘆丁，咖啡酸含量為0.000～0.063 mg/g，平均值為0.021 mg/g，表兒茶酸含量為0.000～0.530 mg/g，平均值為0.034 mg/g，蘆丁含量為0.000～4.783 mg/g，平均值為0.034 mg/g，其僅在HHS和GY2016中檢出，且二者均為黑花生。

為了更為直觀地表述40種酚類物質中測得的8種酚類物質的具體分布情況，采用近年來被廣泛應用的熱圖分析方法對結果進行分析，如圖2所示，熱圖中顏色越接近藍色，表示相對值越高，越接近紅色，表示相對值越低。研究表明，原花青素C1是表兒茶素三聚體，具有抗癌、降糖等功效，尤其是在抗黑色素腫瘤方面效果明顯[18]；兒茶素為花生紅衣中有效的止血成分，且具有抗氧化、抗癌及抑菌作用[19]；表兒茶素沒食子酸酯是一種兒茶素單體，具有抗癌、抑菌等藥理活性[20]；且阿魏酸、原兒茶酸、表兒茶酸、蘆丁及咖啡酸，也具有抗病毒、神經保護、消炎等多種生理功能[21-24]。因此，花生紅衣中酚類物質的種類及含量豐富，且這些酚類物質均具備多種生理活性功能，表明花生紅衣具備開發功能性大健康食品的潛質。

表3 不同品種花生紅衣中8種酚類物質的統計分析 單位:mg/g

圖2 八種酚類物質含量的熱圖分析Fig.2 Heatmap of eight phenolic content

2.5 相關性分析

花生紅衣中8種酚類化合物的相關性如表4所示，原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯與原花青素C1、兒茶素與咖啡酸均呈現極顯著正相關(r=0.432，r=0.510，r=0.404，r=0.445，P<0.01)，原兒茶酸與表兒茶素沒食子酸酯呈現顯著正相關(r=0.392，P<0.05)。阿魏酸與原兒茶酸、原花青素C1及表兒茶素沒食子酸酯均呈現極顯著負相關(r=-0.538，r=-0.597，r=-0.502，P<0.01)，其余酚類化合物之間無顯著相關性。該研究結果可能與這些酚類物質生物合成及代謝通路有關，通過KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)代謝途徑對8種酚類化合物原兒茶酸(C00230)、兒茶素(C06562)、咖啡酸(C01197)、表兒茶酸(C09727)、阿魏酸(C01494)、表兒茶素沒食子酸脂(C09731)、蘆丁(C06801)及原花青素C1(C17642)所涉及的代謝通路查詢可知，它們涉及的代謝通路包括12條，其中苯丙素的生物合成(map 01061)包含這些物質的種類最多為6種(圖3)。由圖3可知，苯丙素類化合物的生物合成的經糖酵解生成 (-)-3-去氫莽草酸， (-)-3-去氫莽草酸生成原兒茶酸與莽草酸酯，莽草酸酯經酶的反應生成對香豆酸，對香豆酸可合成咖啡酸、阿魏酸，并最終形成木脂素化合物，同時，也參與合成柚皮素查耳酮，隨后形成表兒茶素、兒茶素，延伸為原花青素C1，最終聚合為高聚花青素。阿魏酸與原兒茶酸、原花青素C1屬于代謝通路中的不同分支，存在競爭性關系，這與阿魏酸同原兒茶酸、原花青素C1呈現極顯著負相關的結果相一致；而原花青素C1為兒茶素及表兒茶素的延伸單位，和兒茶素與原花青素C1呈現極顯著正相關的結果相一致。物質在生物體內的合成代謝過程是復雜，且受環境(外部因素)與基因(內部因素)的調控，因此原兒茶酸與原花青素C1及兒茶素與咖啡酸的相關性與該代謝通路中呈現的關系相矛盾，這一結果可能與它們參與的其他生物代謝通路有關，后續仍需進一步驗證。

表4 相關性分析Table 4 Correlation analysis

2.6 聚類分析

以歐氏距離和最長距離法對40個花生紅衣品種進行聚類分析[25]，如表5和圖4所示，當歐氏距離為5時，可將40個品種分成三類群。其中A群包括16個樣品，占總樣品的40.0%，該類群中蘆丁的含量均值高于B群和C群，為0.085 mg/g。B群包括17個樣品，占總樣品數的42.5%，該類群中兒茶素、原兒茶素C1的含量均值均高于A群和C群，分別為0.350、0.787 mg/g。C群包括7個樣品，占總樣品數的17.5%，其原兒茶酸、咖啡酸、表兒茶酸、表兒茶酸沒食子酸酯和阿魏酸的含量均值在三類群中均為最高，分別為0.188、0.306、0.830、0.278、0.247 mg/g。

綜上所述，3個類群具有不同的加工適用性，其中，A類群可用于蘆丁和阿魏酸開發利用的首選資源，B類群適用于兒茶素、原兒茶素C1、表兒茶素沒食子酸酯的開發利用，C類群可用于原兒茶素、咖啡酸、表兒茶酸、表兒茶酸沒食子酸酯和阿魏酸的開發利用，且8種酚類物質總含量最高。花生紅衣中酚類物質的含量可能與花生品種、產地有關[10-11,17]，聚類分析較好地體現了不同品種間花生紅衣酚類物質的差異性，為花生紅衣營養價值及藥用開發提供了一定的數據和理論支撐。

圖3 花生紅衣中酚類物質在map 01061的生物合成代謝通路Fig.3 Phenolic compounds biosynthesis pathways of map 01061 in peanut skin注：方框，酶的國際命名編號；圓圈，化合物；紅色圓圈，本文涉及到的酚類化合物；實箭頭，反應方向；虛箭頭，與其他代謝途徑的關系

表5 各類群品種中8種酚類物質的表現特征Table 5 Performance of eight phenolic compounds characters of various groups of varieties

圖4 聚類分析圖(最長距離法)Fig.4 Cluster diagram (the furthest neighbor method)

3 結論

本研究建立了HPLC同時檢測花生紅衣中8種酚類物質的檢測方法，經驗證該方法重復性好、精密度高、穩定性好、加標回收結果準確可靠，可在100 min內對8種酚類物質進行有效分離，峰形對稱、分離度高。通過對40個不同品種花生紅衣中8種酚類物質的檢測分析表明，8種酚類物質在不同品種中的組成及含量均存在差異；不同酚類物質間表現出一定的相關性；聚類分析可將40個資源劃分為三類。

酚類物質作為花生紅衣的主要活性成分，其各組分的組成和含量對于花生紅衣的功能性質起著決定性作用，因此，建立合理高效的檢測方法，對不同品種的花生紅衣酚類成分進行綜合分析評價，對于花生及花生紅衣品種的選育、資源開發利用提供依據具有重要的研究意義，但花生紅衣中的酚類物質成分復雜多樣，盡管本研究已實現8種酚類物質的同時檢測，但仍然具有一定的局限性，有待進一步深入研究。