多種漁用麻醉劑檢測快速前處理方法的研究與建立

陸亦寬，徐迪，劉文悅，郭桂萍，盧瑛*，謝晶

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)3(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海，201306)4(中華人民共和國南通海關，江蘇 南通，226000)

據《2020中國漁業統計年鑒》統計顯示, 我國2019年水產品總產量達6 480.36萬t, 水產行業持續蓬勃發展[1]。然而水產品的安全問題卻屢見不鮮，目前水產品不合格的主要原因90%集中于獸藥殘留和重金屬超標，獸藥殘留主要有硝基呋喃類、氯霉素類、孔雀石綠等[2-3]，給我國消費者的健康造成了嚴重危害。近年來，新興獸藥漁用麻醉劑因其價格低廉、使用方便、可以有效降低水產品在運輸過程中產生的應激反應等優點[5-7]，越來越多的應用于活魚運輸過程中，構成了潛在的危害[8-10]。

目前，獸藥殘留和漁用麻醉劑的檢測方法多為儀器分析方法[11]，例如氣質聯用法[12-14]、液質聯用法[15-20]等，其樣品前處理存在操作繁瑣、耗時長、試劑消耗大、需要專業設備輔助處理等問題。例如LI等[13]采用10 mL乙腈，經冷凍離心、低溫冷凍、氮吹耗時4 h以上制備魚肉中的三卡因待測樣品；XIE等[18]制備魚肉中的孔雀石綠待測樣品，需采用50 mL乙腈，經高速離心、氮吹等前處理耗時3.5 h。

當前對前處理的優化主要集中在提取和凈化兩方面。提取方面，傳統的液-液萃取法雖易于實現，但存在試劑用量大的缺陷[12,19-20]，新興的分散液-液微萃取技術則在此基礎上顯著地降低了試劑消耗問題，提取試劑用量從mL級別降低到了μL級別，并已成功應用于果蔬、牛奶等樣品的檢測[21]。凈化方面，傳統凈化主要采用固相萃取柱消除基質干擾，簡化研究主要集中在優化萃取柱使用流程或采用其他簡便、效果相當的方法進行凈化處理。如高平等[19]采用通過式固相萃取柱檢測水產品中的漁用麻醉劑殘留，免去了傳統步驟中活化、淋洗、洗脫等步驟，且可以通過重力自然通過小柱而無需固相萃取裝置；LI等[17]通過改良QuEChERS法檢測魚肉組織中的三卡因，通過優化提取劑、改變凈化劑組成，處理時間在30 min內，回收率可達79.6%～119.7%。盡管目前樣品前處理技術有了一定的發展，但仍存在依賴專業設備輔助、需專業人員操作及應用范圍窄等問題。

本研究首先通過優化流動相、檢測波長等條件建立了三卡因的HPLC檢測方法，并應用在其他5種漁用麻醉劑的檢測上。隨后通過減少樣品及提取試劑用量、降低前處理凈化濃縮所需設備條件等途徑建立了快速前處理工藝，再通過提取試劑用量、渦旋混合時間和凈化劑用量的單因素優化，綜合6種漁用麻醉劑的人工模擬樣品檢測和回收率評價，建立了一種適用于三卡因、2-苯氧乙醇、丙泊酚、丁香酚、乙酸丁香酚酯、苯佐卡因6種漁用麻醉劑檢測的快速前處理方法。最后采用對加標樣品和模擬麻醉運輸大菱鲆的三卡因殘留樣品，通過HPLC和試紙條檢測的應用，探討了該前處理方法的適用性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

三卡因(純度99.9%)，德國Dr公司；丁香酚(純度99.9%)，德國Sigma公司；苯佐卡因(純度98%)、2-苯氧乙醇(純度98%)、乙酸丁香酚酯(純度>98%)、丙泊酚(純度98%)，上海源葉生物公司；乙腈、乙酸銨，均為HPLC級，上海麥克林生化科技有限公司；凈化劑(50% MgSO4、20%乙二胺-N-丙基硅烷、20% C18、10%石墨碳)，深圳逗點生物有限公司。

Agilent Infinity 1260高效液相色譜儀及Agilent OpenLAB Control Panel 2010數據處理軟件；渦旋振蕩器，美國奧然科技公司；掌式離心機，美國賽洛捷克公司；恒溫水浴鍋，上海藍豹實驗儀器有限公司；電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；純水儀，德國默克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品配制

標準儲備液配制：分別精確稱取100.0 mg的三卡因、丁香酚、2-苯氧乙醇、苯佐卡因、乙酸丁香酚酯、丙泊酚標準品于10 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制為10 mg/mL的標準儲備液。

1.2.2 樣品前處理方法

經典前處理方法：通過手動斬拌機斬拌魚肉，稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈和均質子，渦旋振蕩30 s后，超聲10 min，在4 000 r/min條件下離心5 min，移取上層液體至活化后C18固相萃取柱，使用甲醇洗脫并收集2 mL洗脫液于10 mL離心管中，隨后在40 ℃下氮吹至近干，用1 mL乙腈復溶，過0.22 μm 有機相膜后待HPLC分析。

簡化前處理方法：通過手動斬拌機斬拌魚肉，稱取1.0 g樣品于15 mL離心管中，加入1.5 mL乙腈和均質子，渦旋振蕩2.5 min后，分別移取上層液體1 mL 至含有150 mg的4種常用凈化劑(75 mg MgSO4、30 mg乙二胺-N-丙基硅烷、30 mg C18、15 mg石墨碳)的2 mL離心管中，渦旋振蕩2 min后，于掌式離心機離心2 min，取上清液過0.22 μm有機相膜后待HPLC分析；隨后取500 μL樣品液于2 mL離心管置于50 ℃水浴鍋中，用真空泵吹干后用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液復溶后，待試紙條檢測。

1.2.3 HPLC分析參數的設置

采用DIKMA Diaminsil Plus C18-A柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為乙腈-水，以V(乙腈)∶V(水)=7∶3的比例等度洗脫，流速0.6 mL/min，在220 nm下檢測三卡因、丁香酚；在280 nm下檢測苯佐卡因、乙酸丁香酚酯、丙泊酚和2-苯氧乙醇；柱溫35 ℃，進樣量10 μL。

1.2.4 三卡因HPLC檢測方法的建立

流動相的選擇：配制濃度為1、5、10 μg/mL的標準品，比較流動相組合為乙腈和水、乙腈和乙酸銨、乙腈和0.1%甲酸水(體積比)、甲醇和水、甲醇和 0.1%甲酸水的條件下三卡因響應值的大小。

檢測波長的選擇：配制質量濃度為1、5、10 μg/mL的標準品，比較檢測波長為200、210、220、230、240 nm 的條件下三卡因響應值的大小。

1.2.5 三卡因快速前處理工藝的建立

1.2.5.1 快速前處理工藝的建立

采用烏鱧基質為加標樣品進行前處理工藝優化，三卡因加標濃度為0.1、1、5 mg/kg。

稱樣量的優化：采用1.2.2中經典方法處理樣品，通過HPLC檢測，比較稱樣量1 g和5 g時回收率的差異。

提取和凈化濃縮流程的簡化：采用1.2.2中經典方法處理樣品，并改變提取和凈化濃縮流程，通過HPLC檢測，比較兩者回收率的差異。

1.2.5.2 快速前處理條件的優化

采用烏鱧基質為加標樣品進行前處理條件的優化，三卡因加標濃度為0.1、1、5 mg/kg。

提取劑乙腈添加量的優化：按1.2.2中簡化方法處理樣品，通過HPLC檢測，比較乙腈添加量為1、1.5、2 mL時回收率的差異。

渦旋混合時間的優化：按1.2.2中簡化方法理處理樣品，通過HPLC檢測，比較渦旋混合時間為1.5、2、2.5、3 min時回收率的差異。

凈化劑用量的優化：按1.2.2中簡化方法處理樣品，通過HPLC檢測，比較凈化劑用量為100、150、200 mg 時回收率的差異。

1.2.6 三卡因的快檢試紙條檢測

烏鱧樣品采用1.2.2中簡化方法前處理，三卡因免疫層析試紙條為實驗室前期研制。檢測方法如下：將4 μL磁納米探針與100 μL樣本混合后，振蕩超聲30 s，隨后加入16 μL層析液[含5%(體積分數)吐溫-20]、0.2～0.3 g/mL牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖溶液)，振蕩超聲30 s，將上述混合液滴加至試紙條樣品墊上，層析反應后進行肉眼判斷定性，磁信號儀精確定量。

1.2.7 漁用麻醉劑的前處理樣品制備與檢測

采用1.2.2中簡化方法前處理加標水平為0.5、5、10 mg/kg的烏鱧、海鱸魚和南美白對蝦樣品，加標漁用麻醉劑為三卡因、丁香酚、2-苯氧乙醇、苯佐卡因、乙酸丁香酚酯和丙泊酚，通過HPLC進行檢測，評價回收率?；厥章视嬎闳绻?1)所示：

(1)

2 結果與分析

2.1 漁用麻醉劑的HPLC檢測方法的建立

本研究通過優化檢測波長和流動相組成建立三卡因HPLC檢測方法。標準曲線如表1所示。檢測波長方面，結果如圖1-A所示，可以看到各個濃度下響應值從200 nm到220 nm漸漸上升，從220 nm之后響應值就開始下降，故而選擇220 nm為最佳檢測波長。流動相的優化結果如圖1-B所示，可以看到在三卡因低質量濃度1 μg/mL時，各類流動相的響應值相近，隨著濃度達5和10 μg/mL時，響應值差距拉大，乙腈-甲酸水和甲醇-甲酸水效果較差，乙腈-乙酸銨、乙腈-水和甲醇-水的響應值較好且相近，由于乙酸銨作為鹽類會對色譜系統有一定的影響，因而進一步地對這乙腈-水和甲醇-水兩組的柱效和拖尾因子進行評價。

柱效和拖尾因子體現了色譜峰的峰形好壞，影響著檢測結果準確與否。如圖1-C、圖1-D所示，在拖尾因子方面，乙腈-水和甲醇-水效果基本相當，說明色譜峰峰形較尖銳；而在柱效方面，乙腈-水的柱效明顯高于甲醇-水，說明有著更好的色譜峰性能，故而最后選擇乙腈-水為流動相。

其他漁用麻醉劑在三卡因優化后的檢測條件下進行檢測，除丁香酚外，其他漁用麻醉劑檢測波長有所調整，在280 nm檢測波長下檢測苯佐卡因、乙酸丁香酚酯、丙泊酚和2-苯氧乙醇。

表1 線性方程、相關系數及檢出限與定量限Table 1 Linear equation, correlation coefficient, limit of detection and limit of quantification

A-三卡因檢測波長的選擇；B-三卡因檢測流動相的選擇；C-乙腈-水與甲醇-水柱效的比較；D-乙腈-水與甲醇-水的拖尾因子比較圖1 三卡因HPLC檢測優化條件及漁用麻醉劑色譜圖Fig.1 Optimization of HPLC detection conditions of tricaine and chromatogram of fishery anesthetic

2.2 三卡因快速前處理方法的建立

2.2.1 烏鱧中三卡因的快速前處理流程簡化

樣品前處理主要包括樣品提取和凈化濃縮2個步驟，決定了前處理時間和復雜程度?；诖?，本文參考多篇文獻建立經典前處理方法，樣品提取參考LI等[17]、XIE等[18]提取方法，采用乙腈作為提取劑，稱樣量5 g；凈化流程參考了HUANG等[22]、高平等[19]凈化方法，采用固相萃取柱凈化和氮吹濃縮。本研究主要針對樣品提取和凈化濃縮的流程進行了簡化，降低了處理難度和所需時間，主要改變如圖2所示。

傳統獸藥前處理技術通常采用10 mL以上的提取試劑，這就導致后續操作需要大型離心機輔助以及更長的凈化濃縮耗時，例如固相萃取柱的過柱時間延長，氮吹儀的氮吹時間延長，這些因素疊加在一起致使樣品前處理時間變長、成本增加。本研究首先針對樣品提取流程進行優化，主要包括樣品用量的減少和所需設備條件的簡化，將樣品用量降低至1 g，以便使用更少的提取試劑1.5 mL，使得后續操作可在2 mL離心管中使用，實現了便攜掌式離心機代替了大型離心機的簡化。然后本研究針對樣品的凈化濃縮流程進行改良，采用QuEChERS法結合水浴鍋真空泵有效縮短了凈化濃縮所需時間，避免了傳統的固相萃取裝置和氮吹儀的使用，更便于實現現場檢測需求，將凈化耗時從1.5 h壓縮至10 min內。最后，將簡化后的提取和凈化濃縮流程結合，與經典前處理方法對比，驗證快速前處理流程簡化的可行性。具體見圖2。

圖2 前處理流程簡化示意圖Fig.2 Diagram of simplified pretreatment process

如圖3所示，可以看到在低中高3個加標濃度下，流程簡化前后三卡因的回收率較為相近。如圖3-A所示，樣品量的變化對于加標回收率基本沒有影響，說明降低稱樣量和提取劑用量的思路可行；如圖3-B 和圖3-C所示，將提取流程和凈化流程簡化后，加標回收率有所下降，但最大相差不超過5%，說明單純的渦旋振蕩可以代替渦旋與超聲聯用的提取方式，而水浴結合真空泵吹干的方式可以代替傳統氮吹。圖3-D顯示了在相同加標濃度下，傳統前處理流程和簡化前處理流程的回收率相近，且簡化前處理流程的相對標準偏差雖大于傳統前處理流程，但仍在8%以內，說明簡化前處理流程穩定性較好，可以代替傳統前處理流程。

A-樣品量變化前后三卡因回收率比較；B-提取流程簡化三卡因回收率比較；C-凈化流程簡化三卡因回收率比較；D-傳統前處理與簡化前處理方法比較圖3 傳統前處理流程簡化后的比較Fig.3 Comparison of simplified traditional pretreatment processes

2.2.2 三卡因前處理工藝優化

為了減少提取試劑的使用量，對微量提取試劑(1～2 mL)進行了優化。如圖4-A所示。提取試劑體積為1.5 mL時在各加標濃度下的回收率最佳，而1 mL效果較差，其原因可能是因為提取試劑用量較少，致使回收過程中損失較大，王錚等[23]在降低孔雀石綠提取試劑用量也遇到類似問題，過少的提取試劑可能導致假陰性結果的出現，而2 mL的回收率與1.5 mL相近，這可能是提取試劑飽和所致[15]。

因凈化時采用的是2 mL離心管，故此凈化劑用量不能太多。如圖4-B所示，當商用凈化劑用量為100～300 mg時，回收率先上升后下降，可能是因為較少的凈化劑凈化效果不佳。 LI等[17]優化三卡因前處理時的研究表明過少的凈化劑會有更明顯的基質效應，而過度的凈化劑則會導致非特異性吸附，從而使回收率下降；實驗過程中觀察到過多的凈化劑會有結塊現象，這可能是由于凈化劑中含有MgSO4，該鹽有較好的吸水效果，但吸水后會產生水合硫酸鎂晶體，導致結塊現象，這與PERESTRELO等[24]描述相近，從而影響了待測物的提取，故而最佳凈化劑用量為150 mg。如圖4-C所示，渦旋時間小于1.5 min時回收率在80%以下，回收效果較差；渦旋混合1.5 min 以后回收率逐步趨于穩定，在加標量為1和5 mg/kg時，混合2.5和3 min的回收率相近，因此選擇2.5 min為最佳渦旋混合時間。

綜上，三卡因最佳前處理工藝條件為乙腈用量1.5 mL，凈化劑添加量150 mg，渦旋混合時間2.5 min。

2.3 三卡因快速前處理方法的應用與推廣

2.3.1 快速前處理方法在多種漁用麻醉劑前處理中的應用

依據三卡因優化后的樣品前處理條件，對三卡因和其他漁用麻醉劑丁香酚、2-苯氧乙醇、苯佐卡因、乙酸丁香酚酯和丙泊酚進行加標回收實驗，加標樣品為烏鱧、海鱸魚和南美白對蝦。由圖5可知，6種漁用麻醉劑的回收率在0.5、5、10 mg/kg的添加水平下，回收率均在80%以上,說明本法有較好的應用性。苯佐卡因在3種基質中的回收率與三卡因相近，在0.5、5、10 mg/kg 3個水平下回收率均在95%以上，這可能是由于苯佐卡因與三卡因結構相近，故而有相近的表現[6]。丁香酚在海鱸魚和烏鱧中的回收率表現類似，均是在0.5、10 mg/kg回收率較高，在5 mg/kg時回收率較低，而在蝦肉基質中則依加標量大小回收率依次增加，這可能是由于基質效應不同所導致的乙酸丁香酚酯和丙泊酚較其他4種漁用麻醉劑整體回收率偏低，尤其在0.5 mg/kg 的加標量下，回收率在82.08%～85.76%，這可能是兩者的HPLC定量限較高導致，乙酸丁香酚酯和丙泊酚的定量限分別為0.683 mg/kg和0.414 1 mg/kg，接近0.5 mg/kg，導致其回收率較低，也可能是未采用最佳的提取試劑，據顏琿璘等[25]報道丙泊酚最佳提取試劑為乙酸乙酯；而乙酸丁香酚酯相較于其他麻醉劑回收率較低這與翟紋靜等[5]的研究相近。

A-乙腈添加量對于回收率的影響；B-凈化劑用量對于回收率的影響；C-渦旋時間對比回收率的影響圖4 三卡因前處理條件優化Fig.4 Optimization of pretreatment conditions for tricaine

2.3.2 三卡因快速前處理方法在試紙條檢測中的應用

為了驗證簡化后前處理方法的普適性，以烏鱧為加標樣品，制備加標水平為 0.5、5、10 mg/kg的加標樣品；此外以大菱鲆為模擬麻醉對象，在三卡因質量濃度為30 mg/mL的水中模擬運輸24 h，每隔6 h取樣1次，樣品為魚肉。所有的樣品經簡化前處理后，通過HPLC和實驗室自研的三卡因試紙條進行檢測并對比結果。如圖6-A 所示，可以看到在不同加標濃度下，試紙條檢測結果與HPLC相近，最大偏差在5%以內，說明簡化后的前處理方法可以用于試紙條檢測。從圖6-B中可以看到，實際樣品的HPLC和試紙條檢測結果類似，表明本研究所建立的樣品前處理方法適用于這2種方法，具有較好的應用前景。

A-烏鱧；B-海鱸魚；C-南美白對蝦圖5 三種基質中6種漁用麻醉劑的加標回收率Fig.5 The recoveries of six kinds of fishery anesthetics in three kinds of substrates

A-加標樣品檢測結果對比；B-實際樣品檢測結果對比圖6 免疫層析試紙條與HPLC檢測結果對比Fig.6 Comparison of results between immunochromatographic strip and HPLC

3 結論

本研究通過減少樣品和提取試劑的用量，降低了前處理設備的需求，將前處理時間控制在20 min內，建立了一種漁用麻醉劑快速前處理方法，可應用于其他多種漁用麻醉劑及多種基質的前處理中。本研究所建立的前處理方法不僅適用于HPLC分析，還可以用于快檢試紙條檢測，為其他獸藥快速前處理方法的開發提供了一種思路，為現場檢測和實驗室監控提供了技術支撐。