QuEChERS-氣質聯(lián)用儀測定喀什石榴中70種農藥殘留

阿不力米提·玉麥爾，曹續(xù)，崔智超，阿卜杜拉·玉蘇普*

1(喀什大學 化學與環(huán)境科學學院，新疆特色藥食用植物資源化學實驗室，新疆 喀什，844000)2(新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院，新疆 烏魯木齊，830000)

石榴(PnnicagranatumL.)屬于石榴屬(PunicaL.)植物，落葉灌木或小喬木，是一種集生態(tài)、經濟、社會效益及觀賞價值與保健功能于一身的優(yōu)良果樹[1-6]。新疆石榴主要產于南疆的喀什、和田等地區(qū)，主要品種有喀什石榴、皮亞曼石榴等[7-8]。喀什地區(qū)夏季氣候條件對石榴的生長發(fā)育有利，使得喀什石榴果實大而皮薄、營養(yǎng)豐富、耐貯藏[5,9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)石榴具有抗氧化和抗炎癥的功效，種植面積也在逐年擴大[11-12]。與此同時，農藥的使用問題被更多地關注和重視。

目前常用于農殘檢測的方法有液相、氣相、液質、氣質。前處理方法主要有液液萃取、固相萃取[13-15]，不過，這些檢測方法均有明顯的不足之處。例如：氣相色譜法靈敏度低，氣相色譜-質譜法易出現(xiàn)假陽性結果等。QuEChERS[16-17]是目前應用較為廣泛的一種檢測方法，其因高效、便捷、省時、試劑使用量少的顯著優(yōu)勢深受推薦。QuEChERS技術基于吸附原理，將吸附劑加入樣品提取液中，通過渦旋振蕩與基質干擾物充分接觸，將干擾物吸附在吸附劑上，達到樣品凈化的目的[18]。關于石榴中的前處理報道較少，由于樣品含豐富的色素和礦物質，還有較多的易揮發(fā)性物質，存在明顯的基質干擾效應[19-21]。

本文在QuEChERS方法的基礎上，優(yōu)化了凈化步驟，并與三重四極桿氣質聯(lián)用，檢測70種農藥時方法回收率較好，可應用于此類樣品的農藥殘留檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙酮、乙腈、正己烷(色譜純)，美國Fisher公司；結晶乙酸鈉(分析純)，天津市盛奧化學試劑有限公司；無水硫酸鎂(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；石墨化碳(carbon-graphitized carbon，carbon-GCB)，上海安譜實驗科技股份有限公司；C18吸附劑，安捷倫科技(中國)有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷(primary-secondary amine，PSA)，美國Agela公司。

70種農藥標準品的濃度均為1 000 μg/mL(農業(yè)部環(huán)境質量監(jiān)督檢驗測試中心)。根據(jù)標準品的溶解度選用正己烷、丙酮溶劑配制，參照GB/T 23200.113—2018和GB 23200.8—2016方法，根據(jù)定量限的不同配成9組20 μg/mL的標準儲備溶液[22]，避光存放于-18 ℃冰箱中。

基質匹配標準溶液：用陰性空白樣品提取液配制質量濃度為0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 μg/mL的混合標準溶液，經0.22 μm微孔膜過濾后供儀器分析。

1.2 儀器與設備

TSQ9000氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher；BSA2202S電子天平，德國Sartorius公司；K15高速離心機，美國Sigma公司；MS3渦旋混勻器，德國IKA公司；超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：TG-5MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；進樣口溫度270 ℃；進樣體積1.0 μL；載氣：高純氦氣(99.99%)；進樣方式：不分流進樣；流速1.0 mL/min。色譜柱升溫程序：柱溫40 ℃，保持1.5 min，以25 ℃/min升至180 ℃，保持1.5 min，以20 ℃/min升至280 ℃，保持6.4 min。

1.3.2 質譜條件

離子源：電子轟擊(electron impact ionization, EI)源；數(shù)據(jù)采集模式：單離子檢測掃描(single ion monitoring, SRM)模式；離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲5 min；碰撞氣：氬氣；電離能量70 eV。

1.3.3 樣品前處理

稱取10.00 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL具塞離心管中，加入3 mL水，再加入10 mL(1.0%體積分數(shù)乙酸+乙腈)，渦旋混勻1 min。樣品冷凍10 min后，加入3.0 g無水MgSO4、1.0 g結晶CH3COONa，迅速加蓋渦旋混勻1 min，冰水浴超聲提取30 min，于9 500 r/min 低溫離心3 min。冷凍10 min后，取6.0 mL上清液，移入含1 000 mg MgSO4、600 mg PSA、150 mg C18、40 mg GCB的15 mL具塞離心管中，渦旋混勻1 min，以9 500 r/min低溫離心1 min，上清液經0.22 μm有機濾膜過濾后，供氣相色譜-質譜聯(lián)用儀測定。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件

將進樣口溫度調至270 ℃，考慮到有些化合物在高溫下易分解[23-24]。程序升溫的設定不僅會影響到目標化合物的保留時間和峰形，最重要的是還會影響到離子化效率，從而影響靈敏度。由于目標化合物組分較多，為了在大批量檢測工作中節(jié)省時間，故選用內徑為0.32 mm的中等極性色譜柱，其柱容量更大，優(yōu)化后的最佳升溫程序可大大縮短進樣時間，還可以改善其峰形。

2.1.2 質譜條件

將70種農藥配制成2.0 μg/mL的混合標準溶液。農藥化合物種類多，結構差異性大，將混合標準溶液進行AUTO SRM采集得到總離子流圖(圖1)。優(yōu)化方法，選擇合適的母離子及碰撞能量，再進行二級裂解，挑選3對合適的離子和碰撞能量。

圖1 質量濃度均為2.0 μg/mL的70種農藥混合標準溶液在SRM模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram for a mixed standard solution of the 70 pesticides (2.0 μg/mL for each) in SRM mode

2.2 提取溶劑的選擇

分析農殘最常用的提取溶劑有：甲醇、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、乙腈、石油醚等，石油醚毒性較大；正己烷對油脂類易被共萃取，但對極性大的農藥很難提取出來，丙酮與水互溶，容易帶入水分對儀器以及毛細管色譜柱造成損害；乙腈對農藥的溶解性較好，對油脂和色素等溶解性較小，提取效率最好，同時乙腈對樣品基質有較強的穿透力，從而能夠獲得較高的回收率。因此，選定乙腈為70種農藥的提取溶劑。同時，由于70種農藥的穩(wěn)定性不同，為獲得最大的提取效率，考察加入乙酸對提取效果的影響。本文以喀什石榴為樣品基質，在0.05 mg/kg加標水平下對70種目標農藥的加標回收率實驗，結果顯示，在提取劑乙腈中添加1.0%(體積分數(shù))的乙酸，70種農殘平均回收率較好，而僅用乙腈作為提取溶劑時，發(fā)現(xiàn)平均回收率比加入1.0%的乙酸低，其原因在于部分農藥在乙腈中不太穩(wěn)定，加入1.0%的乙酸，使有些目標化合物在酸性條件下抑制了羧基在溶液中電離成離子形態(tài)，從而提高了回收率。從圖2可以看出，乙酸的添加量在1.0%時，回收率最高，之后呈下降趨勢(P<0.05),因此確定添加1.0%乙酸的乙腈作為最終的提取劑(圖2)。

圖2 提取液中添加1.0%(體積分數(shù))的乙酸對70種農藥平均回收率的影響Fig.2 Effect of adding 1.0% acetic acid in extraction solution on average recovery of 70 pesticides

2.3 吸附劑的選擇優(yōu)化

石榴樣品基質中含有大量色素、揮發(fā)性物質等，在提取目標物時，這些物質易與待測目標物一并提取出來，形成復雜的背景干擾和基質效應，若不進一步凈化，基質效應的干擾會影響到檢測結果的準確性。QuEChERS常用的吸附劑有PSA、C18、GCB等。PSA具有弱的陰離子交換能力，可除去脂肪酸、部分有機酸等；C18則在排除非極性雜質方面效果良好；GCB對色素有強烈的吸附作用。本文以石榴樣品為基質，在0.05 mg/kg加標水平下考察了這3種吸附劑。

2.3.1 PSA添加量的選擇

在上述優(yōu)化結果的基礎上，以新疆石榴為試驗對象，在6 mL提取液中分別添加100、200、300、600、1 000 mg PSA比較回收效果。結果表明，隨著PSA的加入，提取液顏色逐漸變淺，70種農藥的平均回收率也逐漸增高，這與PSA能除去樣品的中糖分有關。當添加量為600 mg時，平均回收率達到92%，繼續(xù)增加PSA的用量對回收率有負面的影響。故當提取液為6 mL時，PSA的添加量為600 mg較為合適，即PSA相對于提取液的添加質量濃度為100 mg/mL，回收率最高，之后呈下降趨勢(P<0.05)(圖3)。

圖3 PSA的添加量對70種農藥平均回收率的影響Fig.3 Effect of addition amount of PSA on average recovery of 70 pesticides

2.3.2 C18添加量的選擇

在上述優(yōu)化結果的基礎上，以石榴為試驗對象，在6 mL提取液中分別添加50、100、150、200、400 mg的C18比較回收效果。結果表明，當經C18的添加量為150 mg時，樣品較干凈基質干擾減少，70種農藥的平均回收率達到最佳，平均回收率為94%。故當提取液為6 mL時，C18的添加量為150 mg較為合適，即C18相對于提取液的添加濃度為25 mg/mL，回收率最高，之后呈下降趨勢(P<0.05)(圖4)。

圖4 C18的添加量對70種農藥平均回收率的影響Fig.4 Effect of addition amount of C18 on average recovery of 70 pesticides

2.3.3 GCB添加量的選擇

在上述優(yōu)化結果的基礎上，以石榴為試驗對象，在6 mL提取液中分別添加5、10、20、40、60 mg的GCB比較回收效果。實驗結果表明，GCB能有效去除石榴中的色素，使樣品更加澄清，從而減小對儀器的污染，當GCB添加量為40 mg時回收率較好，平均回收率為89%，但GCB添加量逐漸增大時，其回收率明顯降低。故當提取液為6 mL時，GCB的添加量為40 mg較為合適，即GCB相對于提取液的添加質量濃度為6.7 mg/mL，回收率最高，之后呈下降趨勢(P<0.05)(圖5)。

圖5 GCB的添加量對70種農藥平均回收率的影響Fig.5 Effect of addition amount of GCB on average recovery of 70 pesticides

綜上，本文最終確定以無水PSA、C18、GCB混合作為吸附劑，其添加質量濃度分別為100、25、6.7 mg/mL。

2.4 基質效應

基質效應會對分析方法的重復性、靈敏度、準確度等產生影響，在使用EI源時更為突出，主要表現(xiàn)為對目標化合物的離子增強作用。基質效應=基質匹配校準曲線的斜率/溶劑標準校準曲線的斜率，比值越接近1，則基質效應越小，反之亦然。以喀什石榴為樣品的基質效應(表1)。實驗結果表明，石榴基質效應以增強為主，其中毒死蜱、腐霉利、丙溴磷、六六六、敵敵畏、溴氰菊酯比值在0.25～0.76有較強的基質增強效應。吡唑醚菌酯、氧樂果、苯醚甲環(huán)唑、甲胺磷比值在1.09～1.69。通常采用的基質效應消除方法有3種，一是通過稀釋凈化，二是采用基質匹配標準溶液做校準曲線，三是采用內標法進行校正。本文使用基質匹配標準曲線的方法來消除基質效應。

2.5 方法學驗證

2.5.1 檢測方法的線性范圍、檢出限

采用陰性石榴做空白基質將農藥混合標準溶液稀釋成0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL的標準工作液，以農藥的質量濃度對應得定量離子色譜峰的面積，繪制標準曲線。以3倍的S/N計算檢測方法的檢出限，70種農藥在0.005～1.0 μg/mL線性關系良好，相關系數(shù)R2>0.995，結果如表1所示。

表1 70種農藥在皮亞勒瑪石榴基質中的線性方程、基質效應、LOD和LOQTable 1 Linear equation, Matrix effect, LODs and LOQs of the 70 pesticides in Pialema pomegranate

續(xù)表1

2.5.2 加標回收和精密度

向空白樣品中分別加0.01、0.05、0.1 mg/kg的混合標準溶液，依1.3.3處理樣品，每個水平做5個平行。按上述優(yōu)化好的方法進行測定，基質匹配外標法定量，計算平均回收率和精密度。結果所有農藥的回收率均為71.6%～107.5%，精密度<11.2%，方法回收率和精密度符合農藥殘留分析要求，如表2所示。

表2 在3個水平下的農藥回收率及精密度(n=5) 單位：%

續(xù)表2

2.6 實際樣品測定

應用該分析方法和GB 23200.113—2018方法對市場采購的皮亞曼石榴，喀什甜石榴、喀什酸石榴進行檢測。在1個石榴樣品中檢出氯氰菊酯農藥殘留，其余均未檢出。對2種加標樣品結果表明2種方法的檢測結果相近。

3 結論

建立了氣相色譜串聯(lián)三重四極桿質譜法測定石榴中農藥殘留的方法，與國家標準GB 23200.113—2018和通用的方法相比，由于目標化合物組分較多，為了在大批量檢測工作中節(jié)省時間，故選用柱容量更大的內徑為0.32 mm的中等極性色譜柱，選用外標法進行試驗。此外優(yōu)化了凈化步驟和單離子檢測掃描模式，從而能減少了基質干擾，提高方法靈敏度。由于部分農藥在乙腈中不太穩(wěn)定，僅用乙腈作為提取溶劑時，發(fā)現(xiàn)平均回收率比加入1.0%(體積分數(shù))的乙酸低，因此溶劑中加入了1.0%的乙酸。本方法準確、便捷，為同類產品的安全生產、有機產品申請和新疆本土特色食品名牌打造提供技術支持。