益生菌中短鏈脂肪酸的合成途徑及功能性研究

卜子晨，夏永軍，艾連中，熊智強，宋馨，王光強

(上海理工大學 健康科學與工程學院，上海食品微生物工程技術研究中心，上海，200093)

益生菌是指攝入大量會對宿主生命和健康產生有益功效的微生物[1]。許多研究表明，益生菌能夠通過體內細菌數量的平衡和良好的新陳代謝的促進來鑄造健康且穩定的腸道環境,能夠調節宿主的防御，預防傳染病，緩解消化道部分慢性炎癥[2]。所以益生菌常被認為是一種具有預防力和治療代謝相關疾病的一種有潛力的工具，而益生菌微生物的生長和代謝活性可被宿主未消化的各種碳水化合物(益生元)選擇性地刺激。在人類結腸模型系統中，益生菌與益生元的組合能夠改變優勢細菌和糞便微生物的短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)的生產[3]。SCFAs是一組揮發性脂肪酸，參與人體代謝，并在肝臟、骨骼肌、脂肪組織和胰島等不同器官中具有重要功能[4]。SCFAs可直接影響碳水化合物代謝和脂質利用，并通過副交感神經系統間接調節能量代謝，緩解肥胖和糖尿病癥狀，限制炎癥并抑制腫瘤細胞生長[5]。SCFAs參與調節性T細胞(Tregs)的發育并影響巨噬細胞的活性，以及抗炎細胞因子如IL-10，IL-4的產生，血漿B細胞的增殖，通過抑制組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)和激活GPR109A、GPR43、GPR41等，最終發揮抗炎作用，并對微生物病原體產生耐受性[6]。大量實驗證明益生菌可以有效調節腸道微生物組并對結腸中SCFAs含量有影響，且研究人員強調益生菌產生的SCFAs具有免疫調節作用，但其作用機制仍需進一步研究。利用益生菌預防和治療腸道失調，使結腸中SCFAs含量增加，似乎是進一步研究的重要方向。

1 短鏈脂肪酸

1.1 短鏈脂肪酸的特點

SCFAs是腸道細菌從內源或飲食來源發酵碳水化合物和蛋白質的最終產物。它們由2～6個碳的飽和脂肪酸組成，包括乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)、異丁酸(iC4)、戊酸(C5)、異戊酸(iC5)和己酸(C6)。其中乙酸、丙酸、丁酸含量最高，占所有SCFAs 中的90%～95%[7]。短鏈脂肪酸的產生可能受到多種因素的調節，包括膳食攝入中存在的微生物群的數量和類型、底物來源和腸道運輸時間。其主要產生部位是結腸，大多在近端結腸(70～140 mm)釋放濃度非常高，遠端結腸(20～70 mm)和回腸末端(20～40 mm)濃度較低[8]。結腸中乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比為60∶25∶15，比例會因飲食、菌群組成、發酵位點和宿主基因型等因素而變化。丁酸主要被結腸細胞利用，而乙酸和丙酸通過門靜脈到達肝臟。丙酸隨后被肝細胞代謝，而乙酸則留在肝臟或被系統釋放至外周靜脈系統[9]。

1.2 短鏈脂肪酸在益生菌中的分布

益生菌，益生元，特別是兩者的結合，在SCFAs酸的形成中發揮著最重要的作用。SCFAs多是由沒有消化吸收的食物殘渣中的碳水化合物經結腸內厭氧菌酵解產生，其中產SCFAs的益生菌主要包括乳桿菌、雙歧桿菌和丁酸梭菌等。PENG等[10]研究表明飼料中添加植物乳桿菌B1可以增加腸道中乳酸菌的數量，它們可以產生更多的乳酸和SCFAs，并能降低盲腸中大腸桿菌的水平。OYARZABAL等[11]研究表明乳酸菌在含2.5 g/L乳糖的培養基上產生45 μmol/mL的乳酸和SCFAs，從而降低環境的pH值，減少其他有害菌生長。雙歧桿菌主要通過發酵途徑產生SCFAs，其中山藥低聚糖在模擬結腸環境中可被植物乳桿菌和雙歧桿菌等腸道益生菌作為碳源利用，其中乙酸在雙歧桿菌48 h的發酵液中含量高達1.85 mg/mL，丙酸在雙歧桿菌8 h發酵液中含量高達0.082 mg/mL[3]。梭菌屬的許多微生物都能產生丁酸作為主要的發酵產物，比如丁酸梭菌和酪酸梭菌以及嗜熱的熱丁酸梭菌常被用來生產約10 g/L的丁酸[12]。其中當強化梭基培養基pH值控制在6.5時，拜氏梭菌Br21發酵木糖唯一的產物就是丁酸。所以工業上?？刂苝H值來提高Br21的丁酸含量。

1.3 益生菌短鏈脂肪酸的合成路徑

研究表明，益生菌在SCFAs的生產中起著至關重要的作用，不同的細菌合成SCFAs的效率不同。產生SCFAs的途徑有很多種(圖1)，細菌中產生SCFAs最普遍的途徑是通過糖酵解途徑，某些細菌類群如雙歧桿菌也可以利用磷酸戊糖途徑產生相同的代謝物。腸道微生物通過結腸發酵過程中以3∶1∶1的化學計量生成乙酸、丙酸和丁酸。乙酸是結腸中含量最多的SCFAs，占糞便中SCFAs的一半以上。其中乙酸通常通過乙酰輔酶A或Wood-Ljungdahl途徑從丙酮酸中生成乙酸,常見的是由乙酰輔酶A衍生，將CO2還原為CO生成[13]。丙酮酸或乙酰輔酶A產醋酸主要依賴于磷酸乙酰轉移酶(pta編碼)和醋酸激酶(ackA編碼)。乙酸也可以通過Wood-Ljungdahl途徑由氫和CO2或甲酸合成而形成乙酸，約占總量的1/3[14]。MILLER和WOLIN利用放射性同位素分析表明，細菌如產氣莢膜梭菌和嗜熱鏈球菌等生產乙酸的主要途徑是Wood-Ljungdahl途徑，這被認為是最有效的乙酸生產途徑。丙酸發酵的主要底物是葡萄糖和乳酸，常見的合成途徑主要有3種，擬桿菌一般是通過甲基丙二酰輔酶A利用琥珀酸途徑形成丙酸[15]。這一途徑中的限制酶是從磷酸烯醇丙酮酸催化形成?；且宜岬牧姿嵯┐急狒燃っ负蛯⒉蒗Ｒ宜徂D化為蘋果酸的蘋果酸脫氫酶。梭狀芽孢桿菌以丙烯酰輔酶A為前體可以通過丙烯酸酯途徑來形成丙酸[16]。最后，還可由脫氧糖如鼠李糖從二羥基丙酮磷酸或乳酸產生1,2-丙二醇，它可以進一步代謝為丙酸鹽或丙醇[17]。丁基輔酶A可以通過兩種不同的途徑生成丁酸。以糞球菌為代表，利用磷酸轉丁基酶產生丁基磷酸，通過丁酸激酶的作用產生丁酸[18]。第二種機制涉及到乙酸輔酶A轉移酶，利用乙酸作為底物轉化為丁酸[19]。DUNCAN等[20]在體外培養研究發現，分離自人糞樣的74株產丁酸菌中50%需要消耗乙酸產生丁酸，表明他們都是利用丁酰輔酶A和乙酰輔酶A轉移酶來形成丁酸。BOTTA等[21]研究表明植物乳桿菌S2T10D可以通過底物谷氨酰胺生成丁酸。當谷氨酰胺含量從2 mmol/L增加到6 mmol/L時，乳桿菌O2T60C的代謝活動減緩，同時，植物乳桿菌S2T10D誘導產生大量丁酸。

2 益生菌以短鏈脂肪酸為功效成分而發揮的功能

2.1 緩解炎癥性腸病

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBDs)其典型癥狀包括腹痛、腹瀉、便血、食欲不振、乏力和體重減輕[22]。一些益生菌菌株已被證實可以改善高血壓、肥胖、炎癥、葡萄糖穩態紊亂和血脂水平異常等代謝疾病，其中SCFAs可作為活性成分而有效改善部分疾病癥狀[6]。腸道是SCFAs介導腸上皮完整性或黏膜免疫反應的主要部位。導致SCFAs減少的腸道菌群紊亂與包括IBD在內的結腸疾病有關。SCFAs通過調節免疫細胞趨化性、活性氧(reactive oxygen，ROS)釋放以及細胞因子釋放發揮抗炎功能。丁酸鹽通過抑制IL-12和上調人單核細胞中IL-10的產生，抑制促炎分子TNF-α、IL-1b和NO的產生，并降低NF-κB的活性。

腸道菌群在調節腸道穩態和炎癥性腸病的發病機制中的作用已得到公認。SCFAs由腸道細菌，從其他不消化的富含纖維的飲食中代謝，已被證明可以改善IBD和過敏性哮喘動物模型的疾病。OHARA等[23]給10個結腸癌患者和20個健康成人接受格氏乳桿菌LG21治療12周，結果表明給藥后體內腸道中乳酸菌含量上升，產氣莢膜梭菌數量下降，并且糞便中丁酸濃度和自然殺傷細胞活性顯著上升。FUKUDA等[24]使用了灌胃7 d雙歧桿菌的小鼠和腸出血性大腸桿菌O157∶H7致死感染的簡化模型，研究發現雙歧桿菌有助于保護小鼠免受大腸桿菌O157∶H7誘導的死亡，并且灌胃雙歧桿菌的小鼠乙酸含量明顯高于非灌胃的小鼠，結果表明糞便乙酸含量與小鼠對大腸桿菌O157感染的抗性呈正相關。通過向無菌小鼠的飲用水中添加右旋糖酐硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)的化學方法誘導結腸炎。與常規飼養小鼠相比，這些小鼠體內細菌的缺失及其對免疫反應的影響導致了嚴重的結腸炎癥。在飲用水中加入150 mmol/L乙酸處理小鼠，可顯著改善疾病指數，增加結腸長度，降低疾病活動指數(disease activity index,DAI)和炎癥介質髓過氧化物酶(mediomedullperoxidase，MPO)水平，并降低TNF-α和炎癥MIP1a(也稱為CCL3)水平[25]。從臨床健康斷奶仔豬的結腸內容物中篩選出具有潛在益生特性的乳酸菌菌株，并通過菌株耐酸和體外黏附能力從體外分離出具有較高代謝產物如丁酸，乙酸和乳酸的約氏乳桿菌L531，發現L531中的SCFAs可以防止嬰兒鏈球菌感染引起的腸道代謝穩態破壞，并增強宿主對微生物器官的控制能力，防止其被沙門氏菌感染破壞[26]。因此，使SCFAs水平正?；约靶迯褪д{可能對IBD的治療具有協同和有益的作用。

2.2 緩解糖尿病

糖尿病患者具有腸道微生物組改變的特點，可導致肥胖、代謝性內毒素血癥、B細胞功能障礙、全身性炎癥和與疾病相關的氧化應激[27]。SCFAs在控制葡萄糖穩態中的作用可能是由于它們參與了葡萄糖合成。研究表明，在飲食中添加阿拉伯木聚糖可以通過增加血漿SCFAs濃度來改善Ⅱ型糖尿病患者的糖耐量。簡而言之，SCFAs控制葡萄糖穩態的機制是SCFAs可以通過與細胞膜上的FFAR2受體結合，直接刺激結腸杯狀細胞(分泌細胞)分泌胰高血糖素樣肽(glucagaon-like ppeptide-1,GLP-1)。也有報道顯示，丙酸通過游離脂肪酸受體激活GLP-1介導的神經網絡，從而調節回腸細胞參與糖穩態，這表明在飲食中添加SCFAs可能直接提高糖耐量。

研究表明，某些益生菌如雙歧桿菌在人和動物實驗中都能分泌胰島素類似物，促進靶脂肪細胞的預期生物學效應[28]。越來越多的證據表明，補充益生菌和益生元可降低血清總膽固醇、低密度脂蛋白和炎癥，從而對心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)具有預防和治療作用。EJTAHED等[29]研究益生菌和傳統酸奶對2型糖尿病患者血脂水平的影響。通過隨機雙盲對照試驗，將60例2型糖尿病患者分為兩組，分別每天飲用300 g含有嗜酸乳桿菌La5和乳酸雙歧桿菌Bb12的益生菌酸奶或300 g常規酸奶，持續6周。食用益生菌酸奶可使總膽固醇降低4.54%，低密度脂蛋白降低7.45%。并且動脈粥樣硬化指標顯著降低。益生菌酸奶可改善2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)患者的總膽固醇和低密度脂蛋白濃度，并可能有助于改善心血管疾病的危險因素。由于T2DM腸道菌群失衡，容易導致SCFAs的產生減少。益生菌治療由于腸道細菌產生的SCFAs的增加以及其他功能，可能對治療糖尿病有效。WANG等[30]為了探討植物乳桿菌、乳球菌、副干酪乳桿菌等14種益生菌可能的抗糖尿病機制。對60只小鼠隨機分為模型組和不同濃度的益生菌組，通過6周的實驗結果發現，所測益生菌可改善血糖和血脂指標，導致T2DM發育延遲。這些益生菌還通過提高SCFAs(丙酸和丁酸)的水平以及cluaudin-1和mucin-2的表達來改善腸道菌群的功能并降低大腸桿菌和脂多糖水平。此外益生菌通過上調G蛋白偶聯受體43/41、原胰高血糖素和轉化酶1/3的活性顯著促進胰高血糖素樣肽-1的分泌。這些研究的結果表明，14種復合益生菌可能被認為是治療T2DM患者的潛在治療方法。TONUCCI等[31]旨在研究益生菌對T2DM血糖控制、脂質和SCFAs的影響，對50名志愿者每天攝入120 g/d的發酵牛奶，持續6周。實驗分為益生菌組(含嗜酸乳桿菌La-5和動物雙歧桿菌BB-12發酵乳)和對照組(含常規發酵乳)。6周后，益生菌組糞便中乙酸水平顯著下降至0.58%(質量分數)。益生菌組的糖化血脂蛋白(HbA1c)下降0.65%，并且總膽固醇和低密度脂蛋白分別下降0.15、0.2 mmol/L。這些結果表明益生菌的攝入改善了T2DM受試者的血糖控制，發酵牛奶的攝入可以使乙酸含量增加。

2.3 防止過度肥胖

肥胖是心血管疾病、血脂異常、肝膽疾病、糖尿病、過早死亡和幾種癌癥的危險因素[32]。據估計，世界上有17億人超重。肥胖個體的腸道菌群組成通常會發生改變，這表明腸道菌群可以被認為是導致肥胖發生的因素。在適當的飲食中使用益生菌控制微生物種群可以減少腸炎，改善腸道屏障的完整性，增加有益細菌的數量，從而導致體重減輕[33]。有證據表明，在脂肪組織中，SCFAs與G蛋白偶聯受體43結合，抑制脂肪積累，從而減少脂肪酸攝入量。此外，GPR43的激活促進了線粒體的生物發生，增加了細胞利用能量產生熱量的能力。這是由于SCFAs與腸細胞表面受體GPR41/43作用，促進腸道激素分泌，這些激素可以調節胃腸道運動和分泌，改變腸壁通透性，減少胃腸道從食物中吸收能量。

很多研究表明，使用益生菌可以改善動物以及人類的腸道失調和肥胖[34]。MCINTOSH等[35]研究調查了補充鼠李糖乳桿菌CGMCC1.3724(LPR)對肥胖男性和女性24周體重減輕和維持的影響。實驗證明LPR益生菌組女性的平均體重下降顯著高于安慰劑組，而在兩組男性中相似。與此同時，與肥胖相關的腸道菌群變化可能導致SCFAs的產生減少。HUANG等[36]研究了豆蔻中植物乳桿菌對異常碳水化合物的改善作用評價高脂飲食(high fat diet，HFD)誘導的大鼠代謝，其中模型組喂食高脂飼料，治療組在高脂飼料的基礎上，喂食植物乳桿菌發酵的豆蔻[40 mg/(kg·d)]，口服4周后大鼠糞便中乙酸含量從4.16 mg/kg顯著提升至7.86 mg/kg，丙酸和戊酸含量也有顯著提升，結果表明植物乳桿菌在大豆中共培養增加大鼠腸道SCFAs釋放。在另一項研究中，調查40名學齡兒童(19名正常體重兒童和21名超重兒童)飲用益生菌后的腸道菌群變化。受試者被分為正常體重組和超重體重組，并進一步分為干預組和對照組。這些兒童飲用含有干酪乳桿菌Shirota菌株的益生菌飲料4周。研究發現，飲用益生菌飲料導致超重兒童腸道菌群中乳酸菌和雙歧桿菌數量顯著增加。在正常體重和超重的兒童補充4周后，觀察到兩組的SCFAs濃度都顯著增加，特別是丙酸。此外，超重兒童糞便中SCFAs的濃度(特別是丁酸和丙酸)高于正常體重兒童[37]。NAGATA等[38]研究了34名兒童的腸道菌群變化，其中包括正常體重22名和肥胖體重12名。研究發現肥胖組接受了飲食和運動治療6個月后每天飲用含有干酪乳桿菌Shirota飲料，體重顯著下降，并且高密度脂蛋白水平顯著上升。此外，糞便中雙歧桿菌的濃度顯著增加從1×107cells/g增長至1×109cells/g，乙酸濃度從攝入前的45 μmol/g明顯升高至攝入后的57 μmol/g。結果表明干酪乳桿菌Shirota有助于減輕體重，同時也改善肥胖兒童的脂質代謝。

2.4 抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡

SCFAs除了在免疫、炎癥和代謝中發揮重要作用外，還影響腫瘤細胞的增殖和凋亡。在牛腎上皮細胞體外培養中，因為丁酸鹽影響有絲分裂G1的早期階段，當添加10 mmol/L丁酸鹽引起細胞周期阻滯和細胞生長抑制。SCFAs(主要是丁酸和丙酸)的治療可以抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

CHEN等[12]在人類結腸癌細胞系HCT116、SW1116和Caco-2的研究中，分析了丁酸梭菌23857和枯草芽孢桿菌19398的作用和機制，由于條件培養基中存在桿菌肽或丁酸，導致細胞周期停滯和凋亡激活，從而減少了細胞增殖和炎癥基因的表達。YUSUF等[39]探討與非結直腸癌(colorectal cancer，CRC)患者相比，CRC患者的微生物菌群結構與SCFAs水平之間的關系。分別對14名CRC受試者和14名非CRC受試者進行研究，用氣相色譜法對他們的糞便樣本進行SCFAs分析，并使用16S rRNA基因變性梯度凝膠電泳(denaturing gel gradient electrophoresis，DDGE)探索細菌的多樣性。分析顯示與非CRC患者相比，CRC患者糞便中雙歧桿菌數量減少，所有結直腸癌受試者的雙歧桿菌顯性譜帶均消失。乙酸、丙酸和丁酸的濃度顯著降低，平均下降到8.55 μg/mL，丙酸為5.61 μg/mL，丁酸為3.79 μg/mL。

2.5 CVD

心血管疾病是當今世界發病和死亡的主要原因，目前正在尋找治療血膽固醇升高的方法。研究表明，含有乳酸菌的發酵牛奶可以降低膽固醇。一些乳酸菌，主要是乳酸菌和雙歧桿菌，能夠調節高膽固醇血癥。體外研究和動物模型也被用來確定益生菌干預對代謝過程和與膽固醇調節相關的基因表達的影響[40]。此外，益生菌還能直接吸收膽固醇，干擾腸道對膽固醇的吸收。已有研究表明，乳酸菌發酵食物來源的不消化碳水化合物，在腸道中產生SCFAs，然后通過抑制肝臟膽固醇合成或通過將膽固醇從血漿重新分配到肝臟，從而導致全身血脂水平下降。并且SCFAs具有調節心血管疾病危險因素的能力，包括降低血壓和調節糖脂穩態。一項研究對小鼠進行高膽固醇血癥的造模實驗，高膽固醇血癥小鼠的飲用水中補充了乳酸菌和雙歧桿菌混合益生菌，持續了8周，并與對照組小鼠進行了對比，前者給予低脂肪飲食或未補充的高脂肪飲食。結果，在一個小鼠模型中發現，益生菌補充劑增加了結腸反應器中丙酸的微生物生成，同時降低了有害的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平。另一項研究旨在測定發酵乳桿菌296對高脂飲食誘導的大鼠心臟代謝紊亂的益生菌作用[41]。大鼠灌胃益生菌4周發現，乳酸桿菌296能夠改善心臟代謝紊亂患者的心血管和生化參數。SCFAs的增加調節血管舒張和誘導低血壓被認為是這種益生菌可能的作用機制。

3 展望

目前已對SCFAs的特點、在腸道和益生菌中的分布作了比較系統的研究，對其合成途徑也有了更加全面的了解。并且有大量研究表明，益生菌中的SCFAs 在維持人體腸道和免疫穩態方面發揮著非常重要的作用，如結腸炎、腸易激綜合征、2型糖尿病、肥胖癥或癌癥等。鑒于SCFAs在免疫和炎癥中的突出作用，補充SCFAs可能是未來預防甚至治療炎癥和免疫相關疾病的一種有效策略。近年來隨著分子生物學等技術不斷成熟，國內外對SCFAs的研究也越來越深入。為了更好地了解SCFAs的功能，以后需要對益生菌中產生SCFAs的基因，蛋白表達和遺傳方面做更進一步的判辨，更有力的縮小范圍并確定SCFAs在益生菌中發揮的潛力和作用，也為產生SCFAs的益生菌在食品及藥品保健品中的應用奠定更完善的理論基礎。在此基礎上，還需要研究利用基因編輯技術，如CRISPER/Cas9更加專業、精準地構建SCFAs產量高的益生菌，通過干預飲食或保健品的方法來控制本綜述所述的疾病，這對SCFAs作為臨床工具具有長遠的意義。