7 種禾本科牧草抗旱性研究與評價

紀童，蔣齊，王占軍，季波

（寧夏農林科學院荒漠化治理研究所，寧夏銀川 750002）

干旱地區降水量少、蒸發量大，土壤水分是制約該區域生態系統生產力的主要因素之一［1］。在土壤含水量極低的條件下，地上植物遭遇水分缺失，會從生長發育、形態結構、膜系統、抗氧化酶系統、滲透調節系統等多個方面作出響應［2］，如脯氨酸（proline，Pro）在植物受到逆境脅迫時會在植物體內積累，使植株對逆境的忍耐力和抵抗力增強［3］，因此，常用其增幅來評價植物抗旱性的強弱，抗旱性強的植物其增加相對較快并且含量高［4-5］，說明不同脅迫下的生理指標變化不同。因此，干旱脅迫下植物生理指標的變化被廣泛用于植物抗旱能力的評價，但單一利用生理指標變化或農藝性狀變化進行評價往往存在片面性，且無法界定試驗中各植物自身適宜的土壤水分范圍，存在一定限制。

在干旱條件下，植物不僅表現為生理指標的變化，還因缺失水分而出現植物葉片褪綠、生長減緩等形態特征的變化，逐步進入衰老死亡的進程，但不同基因型的牧草抗旱能力不同，其衰老點與衰老速率不同，抗旱性強的牧草在干旱脅迫過程中衰老延遲而且仍保持持續生長能力［6］。因此結合植物生長綠葉數及株高形態指標的變化，干旱條件下植物正常生長時土壤含水量響應閾值，植物生理指標綜合評價，對準確評判植物抗旱性意義重大。

寧夏地處我國西北內陸農牧交錯地帶干旱、半干旱氣候區，尤其以鹽池為代表的中部干旱風沙區［7］，土壤水分是制約該區域農業生產和草地植被建植的關鍵因素，篩選抗旱性強的牧草對于該區域農牧業生產及草地植被生態恢復具有非常重要的意義。本研究采用均方根偏差法（the root mean square deviation，RMSD）計算綠葉、株高收益與土壤水分收益的權衡值，將權衡值與土壤含水量作為分位數模型變量［8］，確定維持植物正常生長的土壤含水量的響應閾值，同時研究干旱脅迫下生理指標綜合評價值，進行抗旱性評價。篩選出適宜的抗旱性牧草資源，闡明不同牧草的抗旱特征，從而為干旱區優質抗旱牧草的篩選及因地制宜的實踐生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取7 種優質的多年生禾本科牧草：蒙古冰草-寧夏（Agropyron mongolicum-Ningxia）、蒙古冰草-內蒙古（A. mongolicum-Inner Mongolia）、沙生冰草（Agropyron desertorum）、扁穗冰草（Agropyron cristatum）、細莖冰草（Agropyron trach）、格蘭馬草（Bouteloua gracilis）、老芒麥（Elymus sibiricus）進行抗旱性研究，具體牧草信息見表1。

表1 供試植物Table 1 Test plants

1.2 試驗設計

采用盆栽控水法，于2019 年4 月在鹽池縣四墩子實驗基地，用統一規格（20 cm×20 cm×30 cm）的塑料花盆裝入一致的大田土壤，將7 種牧草種子種于花盆中（播種量為每盆30 粒種子），于溫室內進行培育，至苗期穩定后間苗，保證花盆中苗數相同，試驗設干旱處理組，每組設相應對照，每個品種7 個重復，對照組持續澆灌水。干旱組處理每個品種10 個重復，共計70 個花盆。7 月10 日開始脅迫試驗，試驗開始前連續3 d 澆透水，保證土壤吸足水分，然后開始斷水處理，測定持續干旱組和對照組各植物生理指標、土壤含水量、植物綠葉數及株高。

花盆土壤取自鹽池縣四墩子實驗基地，供試土壤理化性質見表2。

表2 供試田間土壤理化性質Table 2 The physical and chemical properties of the tested field soil

1.3 測定指標與方法

1.3.1生理指標測定與計算 取樣時間為早晨8：00-9：00。在不同干旱脅迫取樣時間內選取中上部長勢一致的健康葉片、迅速放入冰盒，帶回室內放入-40 ℃超低溫冰柜中保存，待用。所有指標均采用實驗室方法進行測定。葉綠素（chlorophyll，Chl）含量采用酒精浸提法［9］測定，脯氨酸含量采用磺基水楊酸法［9］測定，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法［10］測定，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用氮藍四唑法［11］測定，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創木酚比色法［11］測定，過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用紫外吸收法［11］測定，可溶性糖（soluble sugar，SS）含量采用蒽酮法［11］測定。

1.3.2相對值的計算 計算公式［12］如下：抗旱脅迫指數(drought resistance index，DRI) =

1.3.3抗旱性評價 在植物抗旱性研究中，模糊數學隸屬函數法［12］被廣泛應用，本研究也采用此方法對不同牧草種質資源的抗旱性進行評價。

式中：μxj表示第j個指標的隸屬函數值；xj表示第j個指標值；xmin表示第j個指標最小值；xmax表示第j個指標最大值，xˉj表示第j個指標平均值；xij表示式中為i材料j性狀的隸屬函數值；vj表示第j個指標標準差系數；wj表示第j個指標的權重；D表示各材料的抗旱生理評價值。

1.3.4土壤含水量測定與計算 花盆土壤含水量采用稱重法［13］測定。試驗開始前對每個空花盆進行編號并稱重（G2，kg）。在試驗結束后，將每個帶土花盆稱重后倒出所有土，然后將不同土層的濕土混勻，并取6 個土樣，放入鋁盒中帶回實驗室在105 ℃烘箱內烘干，求取含水量以計算各花盆中的干土重（G3，kg）。然后，利用試驗期間每日花盆重（G1，kg），計算每日各花盆的土壤質量含水量（T1，%）。

田間土壤含水量采用Hydra Probe 土壤多參數傳感器（Stevens water 公司，美國）測定。每月定期進行土壤體積含水量的監測，每月測定3 次，每個牧草3 次重復。

1.3.5綠葉數和株高測定 試驗脅迫開始前將花盆牧草進行定株，每日記錄定株苗上的綠葉數與株高。

1.3.6土壤含水量閾值確定 采用均方根偏差法計算

式中：Wi和Gi分別是土壤水分和葉片數。Wmin和Wmax分別是土壤水分在所有樣本中的最小值和最大值，Gmin與Gmax分別是綠葉數在所有樣本中的最小值和最大值。

如圖1 所示，RMSD 通過某一綠葉數和土壤水分坐標點到1∶1 線的距離來表征二者之間的權衡關系，在1∶1 線上（如點C），二者權衡為0；距離1∶1 線越遠（如點A 與B），二者權衡度越大。此外，數據點相對于較1∶1 線的位置也可說明哪種指標的收益更多一些，點B 表示土壤水分收益，即土壤水分足以維持當前植物綠葉數（未受脅迫）；而點A 表示綠葉數收益，意味著土壤水分不足以維持當前植物綠葉數（受脅迫）。

圖1 均方根偏差法Fig.1 Root mean square deviation method

1.3.7分位數回歸 分位數回歸［14］提出的原因，就是不希望僅僅是研究因變量（y）的期望，而是希望能探索y的完整分布狀況，或者說可能在某些情況下本研究更希望了解y的某個分位數。試驗中因權衡值的引入，將數據分為了兩部分，即權衡值≥0 時認為牧草為正常生長狀態，權衡值<0 時認為植物處于脅迫狀態，為探索各牧草正常生長（權衡值≥0）的土壤含水量閾值的大小，則需要引入分位數模型，計算權衡值≥0 的數據分位點，得出分位數回歸模型，利用回歸線與X 軸交點確定土壤含水量閾值。分位數回歸模型基本情況見表3。

表3 各牧草權衡值≥0 的分位點Table 3 The quantile with the weighted value of each forage ≥0

為檢驗分位數模型是否符合實際情況，試驗前將數據分為建模組與檢驗組，樣本數詳見表3，建模后將檢驗組數據帶入分位數回歸模型中，利用實測值與預測值的擬合系數（R2）與均方根誤差（root mean square error，RMSE）判斷模型優劣，得到科學合理的分位數模型。

1.4 數據分析與處理

使用軟件Excel 和SPSS 21.0 進行數據的方差分析，利用R 語言quantreg 包建立分位數回歸模型，并用R 語言ggplot 2 包進行作圖。

2 結果與分析

2.1 綠葉數和株高對干旱脅迫的響應

2.1.1綠葉數對干旱脅迫的響應 由圖2 可知，7 種牧草對照組綠葉數隨處理時間的延長呈先上升后平穩的趨勢，各牧草處理組大體呈先上升后下降的趨勢，牧草D、E、F 與G 在試驗前期（7 月10 日-7 月13 日）出現處理組綠葉數高于對照的現象，說明適度的干旱脅迫有助于牧草D、E、F 與G 的生長，而隨干旱脅迫的增強牧草D、E、F 與G 均表現為對照組綠葉數顯著高于處理組（P<0.05），說明長時間的干旱脅迫影響了牧草正常的生活史，不利于牧草生長。

圖2 禾本科牧草綠葉數Fig.2 The green leaves number of Gramineous forage

2.1.2株高對干旱脅迫的響應 由圖3 可知，7 種牧草對照組株高隨處理時間的延長呈先上升后平穩的趨勢，各牧草處理組各時期株高大體呈先上升后下降的趨勢，各牧草試驗中后期（7 月21 日-7 月29 日）均表現為對照組株高顯著高于處理組（P<0.05），說明干旱脅迫影響了牧草的生長發育，但抗旱能力強的牧草仍能維持正常的生活史。

圖3 禾本科牧草株高Fig.3 The plant height of Gramineous forage height

2.2 土壤含水量響應閾值

2.2.1土壤含水量閾值確定 利用各抗旱植物的綠葉數與土壤含水量進行權衡分析，采用分位數回歸擬合均方根偏差（RMSD）沿土壤含水量梯度上的權衡過程和響應閾值（圖4），結果表明，各抗旱植物分位數回歸模型與0 權衡的交點即為土壤含水量的關鍵轉折點，7 種禾本科植物中僅E 與F 分位數回歸模型的截距與斜率通過了顯著性檢驗（P<0.05），其余植物分位數模型均未通過檢驗。E 與F 的干旱脅迫土壤響應閾值分別為9.1%與9.7%，即當土壤含水量低于9.7%時，牧草F 權衡值為負值且沿含水量的降低權衡增大，土壤含水量的相對收益減小。維持植物的綠葉數是以消耗土壤水分為代價，當土壤含水量等于9.7%時，權衡值為0，說明當前水分足以維持植物正常生長（圖4）。根據田間最低土壤含水量（8%）與土壤干旱程度分級標準（土壤含水量8%左右為中旱土壤），牧草E 與F 土壤含水量閾值符合中旱土壤要求，說明牧草E 與F 在該地區中旱的土壤中耐受干旱脅迫，可以作為抗旱優質牧草。

圖4 綠葉數-土壤含水率權衡沿土壤含水率梯度的分布Fig.4 The distribution of the number of green leaves-soil water content trade-off along the soil water content gradient

從圖5 可以看出，各抗旱植物分位數回歸模型與0 權衡的交點即為土壤含水量的關鍵轉折點，7 種禾本科植物中僅A、B、E、F 分位數回歸模型的截距與斜率通過了顯著性檢驗（P<0.05），其余牧草分位數模型均未通過檢驗。其中A、B、E、F 株高-土壤含水量閾值分別為13.0%、13.8%、4.9%、5.6%，根據田間最低土壤含水量（8%）與土壤干旱程度分級標準（土壤含水率5%左右為重旱土壤），牧草E 與F 土壤含水量閾值符合重旱土壤要求，說明牧草E 與F 能夠在該地區重旱的土壤中維持自身株高，耐受干旱脅迫，可以作為抗旱優質牧草。而牧草A 與B 土壤含水量閾值僅在輕度干旱（土壤含水率：12%~15%）范圍內，說明牧草A 與B 可以在該地區輕度干旱的環境下進行生長，可以作為輕度干旱區域的引種牧草。

圖5 株高-土壤含水率權衡沿土壤含水率梯度的分布Fig.5 The distribution of plant height-soil water content trade-off along the soil water content gradient

2.2.2模型檢驗 通過顯著性檢驗的共有6 個分位數模型，即牧草A 株高-土壤含水量、牧草B 株高-土壤含水量、牧草E 綠葉數-土壤含水量、牧草E 株高-土壤含水量、牧草F 綠葉數-土壤含水量與牧草F 株高-土壤含水量權衡分位數模型，利用檢驗組數據對模型進行驗證。由圖6 可知，牧草B 株高-土壤含水量權衡分位數模型擬合系數較差（0.1438），模型未通過檢驗（圖6b）；牧草F 的2 個分位數模型檢驗組擬合系數均達到0.9 以上，均方根誤差（RMSE）較小，分別為0.12 與0.09（圖6d，f），牧草E 株高-土壤含水量權衡分位數模型擬合系數為0.525，RMSE 為0.10（圖6c），綠葉數-土壤含水量權衡分位數模型的擬合系數為0.80，RMSE 為0.38（圖6e），模型精度較好；說明分位數模型可以確定維持牧草E 與F 生長（綠葉數、株高）的土壤含水量響應閾值。

圖6 模型檢驗Fig.6 Model checking

2.3 生理指標對干旱脅迫的響應

由圖7 可知干旱脅迫下，7 份供試牧草的過氧化物酶與超氧化物歧化酶活性均呈逐漸上升的趨勢，且干旱脅迫后各牧草植物葉片過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性與對照組相比均達顯著差異水平（P<0.05）。

圖7 干旱脅迫對各牧草生理指標的影響Fig.7 Effects of drought stress on physiological indexes of forage grasses

7 份供試牧草中牧草E、G 在各時期脅迫處理下與對照組過氧化氫活性均無顯著差異（P>0.05），牧草B、D、E 脅迫后期出現過氧化氫酶活性下降的趨勢，牧草B 脅迫后期過氧化氫酶活性顯著低于對照組（P<0.05）。

7 份供試牧草中葉綠素與可溶性糖含量大體呈先上升后下降的趨勢，丙二醛含量呈先下降后上升的趨勢，且干旱脅迫后各牧草植物葉片葉綠素、丙二醛、可溶性糖含量與對照組相比均達顯著差異水平（P<0.05）。

7 份供試牧草中脯氨酸含量大體呈逐漸上升的趨勢，且干旱脅迫后各牧草植物葉片脯氨酸含量與對照組相比均達顯著差異水平（P<0.05）。

2.4 抗旱性評價

選取供試7 份牧草的7 項生理指標POD、SOD、CAT、MDA、SS、Pro、Chl 進行綜合分析，計算7 份牧草各指標下的DRI 隸屬值與權重，并以綜合評價值（D 值）鑒定供試牧草抗旱性。結果表明7 種多年生牧草抗旱性大小為：A>F>E>B>C>D>G，抗旱性最強的為牧草A，抗旱性最弱的為牧草G（表4）。結合各牧草土壤含水量閾值排序（細莖冰草>格蘭馬草）與牧草生理指標抗旱評價（蒙古冰草-寧夏>格蘭馬草>細莖冰草>蒙古冰草-內蒙古>沙生冰草>扁穗冰草>老芒麥）得出細莖冰草與格蘭馬草不僅在重旱地區能夠維持自身農藝性狀，自身抗旱生理機制也十分突出，因此試驗篩選出細莖冰草與格蘭馬草作為引選牧草。

表4 抗旱性評價D 值Table 4 Physiological drought resistance evaluation D value

3 討論

3.1 綠葉數和株高對干旱脅迫的響應

作物在水分脅迫下，體內細胞在結構、生理及生物化學上發生一系列適應性改變后，最終要在植株形態上有所表現，綠葉數與株高變化是牧草植物對于干旱脅迫最為明顯的響應［15］。本研究中禾本科牧草隨干旱脅迫加劇，其綠葉數與株高均呈下降的趨勢，說明干旱脅迫程度越高，牧草的農藝性狀受到的負面影響就越大。尹飛［16］發現水分脅迫減少了單株玉米（Zea mays）葉面積，降低了株高和莖粗；吳佳寶［17］研究表明，干旱脅迫導致不同花生（Arachis hypogaea）品種葉片的萎蔫程度差異較大，并且抑制了所有花生品種的株高、葉片長，本研究結果與其一致。

試驗中還發現蒙古冰草-寧夏在脅迫中期（7 月18 日、7 月21 日）也出現綠葉數增多的情況，可能是輕度干旱脅迫下抗旱能力強的植株通過自身調節營養分配適應不良環境，促進了植株的生長發育。歐陽建勇等［18］發現適度的干旱脅迫有助于促進苦蕎（Fagopyrum tataricum）葉片的生長發育；裴保華等［19］研究表明，隨干旱脅迫時間的不斷延長，抗旱性強的檸條（Caragana korshinskii）的葉片數增多，要顯著高于抗旱性稍弱的紫穗槐（Amorpha fruticosa）和沙棘（Hippophae rhamnoides），本研究結果與其一致。

3.2 土壤水分閾值確定

土壤水分和綠葉數與株高在土壤含水量梯度上存在協同和權衡關系。牧草抗旱性狀表現不僅與水分利用密切相關，還與自身生理抗旱機制緊密相關［20］，而這些功能又與土壤水分存在明顯的相關關系。本研究發現，牧草細莖冰草、格蘭馬草土壤含水量9.1%與9.7%是維持植物綠葉數的土壤含水量的轉折點，4.9%與5.6%是維持株高正常生長土壤含水量的轉折點，在轉折點以上水分區間，綠葉數、株高與土壤水分的關系基本在零權衡以上，即株高與綠葉數、土壤水分條件是相適宜的，當前土壤水分條件能夠承載牧草生長發育。一般認為，土壤含水率5%以下時即為重旱地區，8%左右為中旱地區，降水稀少，土壤水分嚴重不足［21-22］，本研究表明，牧草細莖冰草與格蘭馬草能夠適應典型干旱區域，可以作為干旱區域的牧草引進品種，通過權衡分析界定維持牧草植物農藝性狀的土壤水分的區域，可為植被恢復與因地制宜建植牧草提供科學方法和理論依據。

3.3 抗旱性評價

植物抗旱能力強弱不僅表現在植物農藝性狀上，植物生理機制變化也是評價植物抗旱性的具體體現［23］。SOD 是植物過氧化脅迫防御體系中的第一道防線，主要參與清除O2-，產生H2O2，提高植物組織的抗氧化能力［24］，CAT 和POD 協同作用清除細胞內過多的過氧化氫，使其保持在一個較低的水平，從而保護細胞膜的結構。本研究通過測定7 種牧草抗氧化酶活性，結果表明不同牧草品種抗氧化防御能力與機制不同，部分牧草植物存在POD 活性上升，SOD 與CAT 活性下降的現象，可能是干旱脅迫下3 種酶的協同作用，在CAT 活性下降的情況下，保持相對較高的POD 活性，有利于H2O2清除，減少過氧化傷害。Fu 等［25］發現草地早熟禾（Poa pratensis）在長期的輕度干旱脅迫下，引起了SOD，POD 和CAT 活性下降。Dacosta 等［26］也發現干旱脅迫會導致翦股穎屬（Agrostis matsumurae）草坪草SOD 和CAT 活性下降，本研究結果與其一致。

丙二醛的變化能直接反映膜系統受損程度，抗性越強的種質，其MDA 的上升幅度越小［27］，因此評價牧草抗旱性時將MDA 作為負向指標，本試驗干旱脅迫下各牧草MDA 含量較對照組均有不同程度的上升，牧草格蘭馬草的丙二醛含量上升幅度最小。

Pro 和SS 的積累只是植株在嚴重缺水時的一種損傷表現，植物通過增加可溶性糖與脯氨酸含量來維持細胞內外膨壓的穩定與對逆境的忍耐力和抵抗力，達到保護細胞內的酶類的作用［28］，抗旱性強的植物增加相對較快并且含量較高，因此可以將植物體內可溶性糖的含量作為抗旱機制研究的指標。因此試驗中將Pro 與SS 作為正向評價指標。

植物的抗旱性是受多種因素影響的復雜數量性狀，尤其對植物苗期來說，其本身也是一個受多種因素影響的復雜的生理生化過程。本研究采用POD、SOD、CAT、MDA、SS、Pro、Chl 共7 項指標，結合隸屬函數法對7 種多年生禾本科牧草材料苗期的抗旱性進行綜合評價發現，牧草抗旱性由大到小分別為蒙古冰草-寧夏>格蘭馬草>細莖冰草>蒙古冰草-內蒙古>沙生冰草>扁穗冰草>老芒麥。

土壤水分是制約草地植被建植的關鍵因素，篩選抗旱性強的牧草對于區域草地植被生態恢復具有非常重要的意義，實際草地建植過程中因各地土壤含水量的差異，篩選適宜本地區土壤含水量的牧草十分困難，試驗利用牧草生理指標抗旱評價得出牧草抗旱性排序結果為：蒙古冰草-寧夏>格蘭馬草>細莖冰草>蒙古冰草-內蒙古>沙生冰草>扁穗冰草>老芒麥，在了解了植物抗旱性強弱后，研究農藝性狀-土壤含水量閾值，得出細莖冰草與格蘭馬草在中度干旱地區（土壤含水量為8%左右）能夠維持自身農藝性狀，綜合牧草農藝性狀權衡分析土壤含水量閾值與牧草自身生理抗旱機制，為植被恢復與因地制宜建植牧草提供科學方法和理論依據。

4 結論

1）干旱脅迫程度越高，牧草的農藝性狀受到的負面影響就越大；不同品種的基因型與抗旱機制不同，其耐受程度和范圍也有差異，適度的干旱可以促進抗旱能力強的牧草的生長發育并提高牧草質量；

2）細莖冰草和格蘭馬草的綠葉數-土壤含水量閾值分別為：9.1%、9.7%；細莖冰草、格蘭馬草、蒙古冰草-寧夏和蒙古冰草-內蒙古的株高-土壤含水量閾值分別為4.9%、5.6%、13.0%、13.8%；

3）7 種多年生禾本科牧草抗旱性強弱表現為：蒙古冰草-寧夏>格蘭馬草>細莖冰草>蒙古冰草-內蒙古>沙生冰草>扁穗冰草>老芒麥；

4）細莖冰草與格蘭馬草相較于其余禾本科植物抗旱能力較強，且細莖冰草與格蘭馬草土壤含水量閾值符合典型干旱區域土壤含水量，能夠適應中度干旱區域（8%左右），可以作為干旱區域的牧草引進品種；

5）傳統研究植物抗旱性多為研究植物生理變化評價植物抗旱性，且無法界定試驗中各植物自身適宜的土壤水分范圍，存在一定限制，相較于傳統抗旱性研究，本試驗引入了利用農藝性狀權衡分析土壤含水量閾值的概念，得出維持牧草農藝性狀的土壤水分閾值，使因地制宜成為可能，且綜合牧草農藝性狀權衡分析土壤含水量閾值與牧草自身生理抗旱機制，可為植被恢復與因地制宜建植牧草提供科學方法和理論依據。