利用電子順磁共振技術研究美拉德產物對不同自由基清除活性的影響

章銀良,黃天琪,王悅,王明雷,李振城,陳科宇

(鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，鄭州 450001)

美拉德反應(Maillard reaction，MR)是指在一定條件下含羰基的碳水化合物與含氨基的氨基酸、多肽或蛋白質之間的兩種基團發生縮合反應，形成的棕黑色聚合產物即美拉德反應產物(Maillard reaction products,MRPs)[1-2]。 MRPs具有還原酮、呋喃、類黑精等物質，因此具有較強的抗氧化活性[3-5]。MRPs中抗氧化活性物質能夠很好地提高食品的貨架期、抑菌性等性能[6-8]。在食品加工過程中，合理控制美拉德反應條件以此提高抗氧化活性產物的生成，可以減少食品中人工合成的抗氧化劑的使用，提高食品的安全性[9-10]。

電子自旋共振(electron spin resonance，ESR)是一種快速、簡單、能直接以譜圖的形式反映自由基的種類及數量的技術[11]。可根據自由基的ESR譜圖的強度變化來反映物質的抗氧化活性能力。常用的紫外分光光度法在抗氧化活性研究中容易受到樣品本身的影響。例如郭學文等[12]在類胡蘿卜素的抗氧化活性研究中發現，ESR法與紫外法所測抗氧化活性不一致，可能是番茄紅素本身在517 nm處能與DPPH光譜特征峰重疊所致。

在前期研究中，運用紫外分光光度法和ESR法對美拉德反應的單因素結果相差甚大，且隨著美拉德反應條件的變化，MRPs的褐變程度也產生變化，這極大程度地干擾到了運用紫外法對MRPs抗氧化活性的最優條件的確定[13]。目前應用ESR技術研究MRPs的抗氧化活性的報道甚少，且應用ESR法測定其他材料的抗氧化活性的指標較為單一，本實驗借助芬頓反應以及2種自制合成材料，通過自由基與捕獲劑隨時間的動態變化，確定最佳測定時間以及MRPs的最佳測定濃度，擴大了MRPs抗氧化活性研究指標，為深入研究MRPs提供了參考依據。

1 材料、設備與方法

1.1 試劑與材料

D-核糖(AR)、D-阿拉伯糖(AR)、L-精氨酸(AR)、L-賴氨酸(AR)、L-甘氨酸(AR)：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉(AR)、無水乙醇(AR)：天津市永大化學試劑有限公司；鹽酸、雙氧水(30%過氧化氫)：煙臺市雙雙化工有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基 (DPPH(AR)，進口試劑)；5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)：上海麥克林生化科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)(AR)：天津市富宇精細化工有限公司；硫酸亞鐵(AR)：天津市化學試劑三廠；甲醇(AR)：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器設備

SQP電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；E-scan Bruker電子順磁共振波譜儀 德國布魯克科技(北京)有限公司；FE20 pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；HH-1智能型數顯恒溫油浴槽、HH-S水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司；T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Tecan Spark 20M多功能微孔板讀數儀 瑞士Tecan公司；Microsolar 300 氙燈穩流電源、氙燈光源 北京泊菲萊科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MRPs制備

準確稱量1.25 g的一種糖(D-阿拉伯糖、D-核糖)和一種氨基酸(L-賴氨酸、L-精氨酸、L-甘氨酸)，共同溶解于45 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調整pH至10.0，然后用去離子水定容至50 mL，混合均勻。量取10 mL反應液轉移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，置于120 ℃恒溫油浴槽中反應1 h。反應結束后快速置于冰水中冷卻并進行相關測定，每組反應平行3次，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 MRPs清除羥基自由基的測定

1.3.2.1 反應時長確定

根據Aleksandra等[14]的研究方法，于2.5 mL離心管中依次加入20 μL DMPO、420 μL去離子水、20 μL 5 mmol/L FeSO4并用渦旋儀振蕩40 s。隨后添加20 μL 50 mmol/L H2O2并計時。用毛細管虹吸23.77 μL(d=0.93 mm, h=35 mm)樣品于90 s開始測量，每隔30 s掃描一個ESR圖譜，共測1 h并記錄第2條主峰峰高。

測量參數：頻率9.790245 GHz，調制幅度1.01 G，時間常數20.48，掃描時間10.49 s，掃描間隔時間19.51 s，接收機增益為1.00×103，中心磁場3487 G，功率5.00 mW，掃描寬度100 G，調制頻率86.00 kHz，橫坐標點數512。

1.3.2.2 不同濃度和不同種類的MRPs對羥基自由基清除率的影響

在2.5 mL離心管中依次加入20 μL DMPO、420 μL去離子水、20 μL 5 mmol/L FeSO4并用渦旋儀振蕩40 s。再加入20 μL不同濃度的核糖與精氨酸反應產生的MRPs(未稀釋、2倍稀釋、5倍稀釋、15倍稀釋、20倍稀釋、50倍稀釋)以及10倍稀釋的不同種類的MRPs，以等量去離子水作為空白組。隨后吸取20 μL 50 mmol/L H2O2并計時，用毛細管虹吸23.77 μL樣品于150 s開始測量并記錄第2條主峰峰高。空白組記為 Ac,實驗組記為 As。羥基自由基清除率計算公式如下：

測量參數：掃描間隔時間0，其余參數同上。

1.3.3 MRPs清除超氧陰離子自由基的測定

1.3.3.1 反應時間確定

依照Zhang Jingtao等[15]制備的碳點和鈀共修飾自摻雜二氧化鈦(CdS/Pd/Ti3+-TiO2)納米材料，取20 mg納米材料加20 mL無水甲醇溶液、50 μL DMPO氙燈照射25 min后(冷循環降溫)，用0.22 μm尼龍膜過濾。用毛細管虹吸23.77 μL濾液于6 min開始測量，每隔1 min掃描一次，共測30 min，并記錄第1條主峰峰高。

ESR測定條件；頻率9.793810 GHz，中心磁場3487 G，調制幅度2.02 G，時間常數20.48，掃描時間10.49 s，掃描間隔時間19.51 s，接收機增益為1.42×103，氙燈功率為300 W，其余參數同1.3.2。

1.3.3.2 不同濃度以及不同種類的MRPs對超氧陰離子自由基清除率的影響

于2.5 mL離心管中加入250 μL上述光照材料濾液、10 μL不同濃度的核糖與精氨酸反應產生的MRPs(未稀釋、5倍稀釋、50倍稀釋、100倍稀釋、200倍稀釋)以及50倍稀釋的不同種類的MRPs，以等量去離子水作為空白組。用毛細管虹吸23.77 μL(d=0.93 mm, h=35 mm)樣品于8 min開始測量并記錄譜圖二重積分值。空白組記為Ac,實驗組記為As。超氧陰離子自由基清除率計算公式如下:

ESR測定條件；掃描間隔時間0，其余參數同上。

1.3.4 MRPs清除羧基自由基的測定

1.3.4.1 反應時長確定

參考Tong Meiping等[16]的方法制備磁性Fe3O4/MoS2納米復合材料，取20 mg復合材料、500 μL 30% H2O2溶于20 mL DMSO中，磁力攪拌后用0.22 μm尼龍膜過濾，于2.5 mL離心管中依次加入10 μL DMPO、800 μL過濾樣品液，并用渦旋儀振蕩20 s。用毛細管虹吸23.77 μL樣品于2 min開始測量，每隔2 min掃描一個ESR圖譜，共測200 min并記錄第1條主峰峰高。

測量參數：頻率9.791555 GHz，調制幅度1.80 G，時間常數40.96，掃描時間20.97 s，掃描間隔時間99.03 s，接收機增益為3.17×103，其余參數同1.3.2。

1.3.4.2 不同濃度以及不同種類的MRPs對羧基自由基清除率的影響

于2.5 mL離心管中依次加入10 μL DMPO、800 μL上述過濾液并分別加入10 μL不同濃度的阿拉伯糖與甘氨酸反應產生的MRPs(20倍稀釋、50倍稀釋、100倍稀釋、200倍稀釋、600倍稀釋、1000倍稀釋)以及200倍稀釋的不同種類的MRPs，以等量去離子水作為空白組。渦旋振動后暗反應30 min用毛細管虹吸23.77 μL樣品并測量，并記錄第1條主峰峰高，空白組記為Ac,實驗組記為As羧基自由基清除率計算公式如下：

ESR測定條件：掃描時間間隔0，其余參數同上。

1.4 數據處理

所有的實驗均做3次平行，采用WINEPR-Processing、Origin 8.0、Mathematics 4.0及其相關方法進行處理，并用SPSS軟件進行顯著性分析(p<0.05表示差異顯著)。

2 結果與討論

2.1 MRPs對清除羥基自由基活性的影響

2.1.1 測量時間的確定

羥基自由基第2條峰峰值強度隨時間變化關系曲線見圖1。

圖1 羥基自由基第2條峰峰值強度隨時間變化關系曲線Fig.1 The change curve of peak intensity of the second peak of hydroxyl radicals with time

由圖1可知，DMPO捕獲羥基自由基后不穩定，羥基自由基的含量隨著時間的延長呈現出減少的趨勢。在30 min內，羥基自由基含量減少迅速，在30～60 min接近平緩。因此，羥基自由基測量可采取兩種方式。第一種方法可將混合樣品暗反應30 min后測量，此方法所得ESR譜圖信號強度較弱。第二種方法即確保每個樣品在加入H2O2后3 min之內的同一時間測量，此方法重復性較好且ESR譜圖清晰。考慮實際上樣所需時間，本實驗采用第二種方法混合反應物并計時150 s進行測量。

2.1.2 不同稀釋倍數的MRPs對羥基自由基清除率的影響

不同稀釋倍數的MRPs對羥基自由基清除率的影響見圖2。

由圖2可知，羥基自由基的ESR譜圖為中間高、兩端低的四重峰。在加入MPRs后，其峰高和面積逐漸減小，但峰形基本保持不變。MRPs對羥基自由基的清除效果較為明顯，隨著MRPs濃度降低，對羥基自由基的清除率逐漸減小。為了很好地得到羥基自由基ESR譜圖的同時又能保證樣品之間的清除效果對比明顯，采用10倍的MRPs稀釋液作為測量不同濃度的MRPs對羥基自由基清除能力影響的反應物。

2.1.3 不同種類的MRPs對羥基自由基清除率的影響

不同種類的MRPs對羥基自由基清除率的影響見圖3。

圖3 不同種類的MRPs對羥基自由基清除能力的影響關系圖Fig.3 Effects of different kinds of MRPs on scavenging ability of hydroxyl radicals

由圖3可知，不同氨基酸與糖在同一模擬體系下反應產生的MRPs對羥基自由基的清除效果不同，清除能力由大到小依次為核糖與甘氨酸>阿拉伯糖與甘氨酸>阿拉伯糖與賴氨酸>核糖與賴氨酸>核糖與精氨酸>阿拉伯糖與精氨酸。在所選材料研究范圍內發現，MRPs對超氧陰離子的清除效果與氨基酸的種類關系密切，即當糖類固定時，不同氨基酸對羥基自由基清除能力大小依次為甘氨酸>賴氨酸>精氨酸。

2.2 MRPs對清除超氧陰離子自由基活性的影響

2.2.1 ESR反應時間的確定

超氧陰離子自由基第1條峰峰值強度隨時間變化關系曲線見圖4。

圖4 超氧陰離子自由基第1條峰峰值強度隨時間變化關系曲線Fig.4 The change curve of peak intensity of the first peak of superoxide anion radicals with time

由圖4可知，在6～36 min內，超氧陰離子強度隨著時間延長呈現出波動穩定的狀態，呈現出波動的原因可能是材料在共振腔內有少量的超氧陰離子自由基產生，而超氧陰離子自由基和DMPO結合的化合物隨著時間的延長而減少。在本實驗研究中，6～36 min內超氧陰離子自由基強度值的極差值為0.573，因此在光照后需要固定時間再使用。本實驗以下研究選取樣品測量時間為8 min。

2.2.2 不同濃度的MRPs對超氧陰離子自由基清除率的影響

不同濃度的MRPs對超氧陰離子自由基清除率的影響見圖5。

由圖5可知，超氧陰離子自由經過DMPO捕獲后，其波譜圖由6個主要的峰構成，在加入MPRs后，其峰高和面積逐漸減小，但峰形基本保持不變(有少數峰出現分叉主要是檢測樣品的超氧陰離子濃度過低導致)。MRPs 對超氧陰離子清除效果較為明顯，隨著MRPs濃度降低，超氧陰離子的自由基的清除率逐漸減小。因此，采用50倍的 MRPs 稀釋液作為超氧陰離子自由基清除的反應物，可以很好地得到超氧陰離子自由基的ESR譜圖，同時又能保證樣品之間的清除效果對比明顯。

2.2.3 不同種類的MRPs對超氧陰離子自由基清除率的影響

不同種類的MRPs對超氧陰離子自由基清除率的影響見圖6。

圖6 不同種類的MRPs對超氧陰離子自由基清除能力的影響關系圖Fig.6 Diagram of effects of different types of MRPs on scavenging ability of superoxide anion radicals

由圖6可知，不同氨基酸與糖在同一模擬體系下反應產生的MRPs對超氧陰離子的清除效果不同，清除能力由大到小依次為核糖與精氨酸>阿拉伯糖與精氨酸>阿拉伯糖與賴氨酸>核糖與賴氨酸>核糖與甘氨酸>阿拉伯糖與甘氨酸。在所選材料研究范圍內發現，MRPs對超氧陰離子自由基的清除效果與氨基酸的種類關系密切，即當糖類固定時，不同氨基酸對超氧陰離子自由基的清除能力大小依次為精氨酸>賴氨酸>甘氨酸。

2.3 MRPs對清除羧基自由基活性的影響

2.3.1 ESR反應時間的確定

羧基自由基峰值強度隨時間變化關系曲線見圖7。

圖7 羧基自由基隨時間變化關系圖Fig.7 The change curve of carboxyl radicals with time

由圖7可知，DMPO捕獲的羧基自由基具有相對穩定性，羧基自由基的含量隨著時間的延長呈現出先增加后減少的趨勢。在2～38 min內，羧基自由基急速增大，于38 min達到最大值。隨后呈現緩慢減少趨勢，在28～76 min內，羧基自由基增減較為平緩，極差值為0.536。根據本實驗樣品數量實際情況綜合考慮，可采取暗反應40 min進行測量。此時間階段測量使羧基自由基的ESR圖清晰且可以減少由于測量時間的不同造成的實驗誤差。

2.3.2 不同濃度的MRPs對羧基自由基清除率的影響

不同濃度的MRPs對羧基自由基清除率的影響見圖8。

由圖8可知，在加入MPRs 后，羧基自由基的ESR譜圖的峰高和面積逐漸減小，峰形基本保持不變。MRPs對羧基自由基的清除效果較為明顯，隨著MRPs濃度降低，羧基自由基清除率逐漸減小。為了很好地得到羧基自由基ESR譜圖的同時又能保證樣品之間的清除效果對比明顯，因此采用200倍的MRPs稀釋液作為羧基自由基清除的反應物。

2.3.3 不同種類的MRPs對羧基自由基清除率的影響

不同種類的MRPs對羧基自由基清除率的影響見圖9。

圖9 不同種類的MRPs對羧基自由基清除能力的影響關系圖Fig.9 Diagram of effects of different kinds of MRPs on scavenging ability of carboxyl radicals

由圖9可知，不同氨基酸與糖在同一模擬體系下反應產生的MRPs對羧基自由基的清除效果不同，清除能力大小順序為阿拉伯糖與賴氨酸>核糖與賴氨酸>核糖與甘氨酸>阿拉伯糖與甘氨酸>核糖與精氨酸>阿拉伯糖與精氨酸。在所選材料研究范圍內發現，MRPs對超氧陰離子自由基的清除效果與氨基酸的種類關系密切，即當糖類固定時，不同氨基酸對超氧陰離子自由基清除能力大小順序為賴氨酸>甘氨酸>精氨酸。

3 結論

MRPs對超氧陰離子自由基、羧基自由基、羥基自由基的清除能力大小不同，說明MRPs具有較好的抗氧化活性，且MRPs清除不同自由基的機理可能不同，這需要進一步實驗進行研究。不同種類的MRPs對于同種自由基的清除能力大小與氨基酸的種類以及MRPs的濃度密切相關，證明上述合成的兩種自制材料與芬頓反應產生的自由基都可應用于抗氧化活性的研究指標。通過自由基與捕獲劑(DMPO)的動態研究發現，不同的自由基與DMPO結合后的穩定性不同，因此測量時間的確定十分關鍵。