月桂酰精氨酸乙酯的抗菌活性及對牦牛鮮肉腸貯藏品質(zhì)的影響

彭美玲，郝剛*，唐善虎，李思寧，蔡寅川

(1.西南民族大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.四川阿壩州工業(yè)經(jīng)濟(jì)研究所，四川 汶川 623000)

月桂酰精氨酸乙酯(lauroyl arginine ethyl ester，LAE)是一種新型食品保鮮劑，在不同基質(zhì)食品中的抗菌性能有差別[1]。LAE在體內(nèi)可分解為月桂酸和精氨酸乙酯，安全性較好[2-3]。LAE對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母均有抑菌作用[4]。2005年，美國FDA將LAE列為一般公認(rèn)(Generally Recognized as Safe，GRAS)的食品添加劑，可添加到畜、禽肉類食品中[5]。2007年，歐洲食品安全管理局(EFSA)批準(zhǔn)了LAE的食品安全認(rèn)證[6]。根據(jù)衛(wèi)健委《食品添加劑新品種管理辦法》相關(guān)規(guī)定，2018年，我國國家食品安全風(fēng)險評估中心發(fā)布了關(guān)于食品添加劑LAE的征求意見，內(nèi)容中規(guī)定了LAE用于新鮮果蔬的最大添加量為200 mg/kg[7]。LAE可通過直接添加或制成包裝薄膜的方式應(yīng)用于肉制品、乳制品、果蔬產(chǎn)品的保鮮[8-10]。LAE可與其他水溶性保鮮劑復(fù)配以提高其保鮮能力[11-13]。有報道表明LAE與山梨酸鉀有協(xié)同抗菌作用，LAE與山梨酸鉀復(fù)配能夠抑制榨菜中微生物增殖1～2個數(shù)量級[14]。將LAE、尼泊金和殼聚糖復(fù)配用于青椒的防腐保鮮，結(jié)果顯示其對青椒具有顯著的保鮮效果[15]。因牦牛生活在高海拔、低氧濃度的高寒極端環(huán)境，牦牛肉形成了獨(dú)特的肉品品質(zhì)，具有高蛋白、富含多種氨基酸、低脂肪的特質(zhì)，營養(yǎng)價值極高[16]，但牦牛肉制品在貯藏過程中容易受到微生物污染導(dǎo)致變質(zhì)[17]，因此，探究牦牛肉的保鮮方法顯得尤為必要。目前國內(nèi)外研究肉類保鮮的方法諸多[18]，添加保鮮劑是其中之一。殼聚糖(chitosan, CS)與乳酸鏈球菌素(Nisin)是抗菌保鮮效果顯著且生物相容性較好的天然食品保鮮劑[19]。本文研究了月桂酰精氨酸乙酯的抑菌活性以及將月桂酰精氨酸乙酯、殼聚糖和乳酸鏈球菌素復(fù)配用于牦牛鮮肉腸的保鮮，考察其對牦牛鮮肉腸貯藏品質(zhì)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豬肥膘：購于成都正規(guī)農(nóng)貿(mào)市場；體質(zhì)健壯的3歲齡公牦牛背最長肌：購于四川紅原牦牛肉食品有限公司；食鹽、雞精、五香粉、料酒：購于紅旗超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

月桂酰精氨酸乙酯(BR)：成都傲飛生物化學(xué)品有限責(zé)任公司；殼聚糖(食品級)：深圳市星牧生物工程有限公司；乳酸鏈球菌素(食品級)：山東元泰生物工程有限公司；石油醚(沸程30～60 ℃)、無水乙醇、酚酞、氫氧化鉀、三氯乙酸(TCA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)、酚酞、氯仿、氯化鈉(AR)、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉、馬鈴薯培養(yǎng)基(BR)：成都科隆化學(xué)品有限公司；多聚甲醛(AR)：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)菌株：綠膿桿菌(PeseudomonasaeruginosaCMCC10104)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCMCC63501)、英諾克李斯特菌(ListeriainnocuaATCC33090)、白假絲酵母(CandidaalbicansATCC10231)、黑曲霉(AspergillusnigerCMCC98003)：購于海博生物技術(shù)有限公司；鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellatyphimuriumATCC14028)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureussubsp. ATCC29213)、弗氏檸檬酸桿菌(CitrobacterfreundiiATCC51459)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC51459)：由本校動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BSA224S-CW型電子天平 賽多利斯儀器有限公司；WF32型色差儀 深圳威孚光電科技有限公司；XR53648型電熱恒溫水浴鍋 金壇區(qū)西城新瑞有限公司；UV1810S型紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；5810R型臺式冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZWY-2102C型恒溫振蕩培養(yǎng)器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 牦牛鮮肉腸的制作

將原料(牦牛肉∶豬肥膘為7∶3)、輔料(原料以100%計，食鹽3.5%，雞精0.4%，五香粉0.5%，料酒1.0%)充分混勻，置于4 ℃冰箱中腌制24 h，分別將LAE各保鮮組分混入腌制完畢的牦牛肉中混合均勻后攪碎，灌裝成長度約為5 cm的腸體，用排氣針扎眼排除腸內(nèi)氣體后置于4 ℃冰箱中貯藏，于第1，3，6，9，12，15天測定指標(biāo)，各實(shí)驗(yàn)處理組如下：

對照組：將牦牛肉、豬肥膘與輔料充分混勻后灌腸，不添加保鮮劑。

低濃度LAE組：將牦牛肉、豬肥膘與輔料再加入0.1 g/kg LAE，混勻后灌腸。

高濃度LAE組：將牦牛肉、豬肥膘、輔料再加入0.3 g/kg LAE，混勻后灌腸。

LAE+Nisin組：將牦牛肉、豬肥膘、輔料再加入0.2 g/kg LAE+0.3 g/kg Nisin，混勻后灌腸。

LAE+CS組：將牦牛肉、豬肥膘、輔料再加入0.2 g/kg LAE+5 g/kg CS，混勻后灌腸。

LAE+Nisin+CS組：將牦牛肉、豬肥膘、輔料再加入0.2 g/kg LAE+0.3 g/kg Nisin+5 g/kg CS，混勻后灌腸。

1.4.2 LAE的抗菌活性測定

1.4.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)

將用平板活化后的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，11000 r/min離心5 min棄上清液，加入無菌生理鹽水清洗1次后再以11000 r/min離心5 min棄上清液，沉淀用LB液體培養(yǎng)基稀釋為1×108CFU/mL作為待測菌液。

1.4.2.2 真菌的培養(yǎng)

取經(jīng)平板活化的真菌轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，11000 r/min離心5 min棄上清液，加入無菌生理鹽水清洗1次后再以11000 r/min離心5 min棄上清液，沉淀用PDA液體培養(yǎng)基稀釋為4×104CFU/mL作為待測菌液。

1.4.2.3 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)測定法

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)菌和真菌的待測菌液分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入100 μL待測菌液，隨后加入經(jīng)倍比稀釋的LAE溶液100 μL，LAE的濃度分別為4，8，16，32，64，128 μg/mL，以多聚甲醛為陽性對照，無菌水為陰性對照。細(xì)菌置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，每隔0.5 h用酶標(biāo)儀測630 nm處的吸光值。真菌置于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，每隔0.5 h用酶標(biāo)儀測630 nm處的吸光值，吸光值與初始值相比，沒有顯著變化的最小LAE濃度為LAE對該菌的最低抑菌濃度。

按最低抑菌濃度(MIC)測定法測定LAE對英諾克李斯特菌等革蘭氏陽性菌、綠膿桿菌等革蘭氏陰性菌、白色念珠菌等真菌的抗菌活性。

1.4.3 酸價的測定

參考GB 5009.229-2016《食品中酸價的測定》測定牦牛鮮肉腸的酸價。

1.4.4 色度的測定

將牦牛肉腸橫切成1 cm高的圓柱體，用色差計測定肉腸切面的亮度值L*、紅綠值a*、黃藍(lán)值b*，每個樣品測定3次取平均值，儀器使用前用標(biāo)準(zhǔn)板校正[20]。

1.4.5 硫代巴比妥酸值(TBA)的測定

參考GB 5009.181-2016《食品中丙二醛的測定》方法進(jìn)行測定。

1.5 持水性測定

參考儀淑敏等[21]的方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAE的抗菌活性檢測

采用MIC法考察了LAE對綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、英諾克李斯特菌等微生物的抑菌活性。LAE對各菌的最低抑菌濃度見表1，對大腸桿菌、綠膿桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、英諾克李斯特菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉的MIC分別為32，32，64，32，16，16，8，16，32 μg/mL。LAE對各種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌都有顯著的抑制作用，具有廣譜抗菌活性，且對革蘭氏陽性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌。

表1 最低抑菌濃度(MIC)Table 1 The minimum inhibitory concentration (MIC)

2.2 牦牛鮮肉腸貯藏過程中酸價的變化

酸價是用來衡量肉與肉制品酸敗程度的重要指標(biāo)[22]。牦牛鮮肉腸酸價的變化見圖1。

圖1 牦牛鮮肉腸貯藏過程中酸價的變化

由圖1可知，各處理組在15 d貯藏期內(nèi)的酸價均呈現(xiàn)增加的趨勢(P<0.05)，第1天各處理組的酸價變化差異不顯著(P>0.05)，牦牛鮮肉腸貯藏過程中酸價逐漸增大的原因一方面是在貯藏過程中肉腸內(nèi)源性脂肪酶水解脂肪生成游離脂肪酸，另一方面是牦牛肉腸中的脂肪隨著貯藏時間的延長，由于熱和微生物的作用而逐漸水解生成游離脂肪酸[23]。對照組在15 d貯藏期內(nèi)酸價增加的趨勢最為顯著(P<0.05)，第15天時達(dá)1.19 mg/g，LAE對酸價的增加有一定的抑制作用，且濃度越大，抑制作用越明顯。LAE+Nisin 與LAE+CS復(fù)配組能協(xié)同抑制由于微生物繁殖導(dǎo)致的酸價增加，后者的抑制作用更明顯，說明LAE+CS協(xié)同抑制酸價增加的效果優(yōu)于LAE+Nisin復(fù)配。3種保鮮劑復(fù)配時，第15天時酸價增加最小，抑制酸價增加的效果最強(qiáng)。

2.3 牦牛鮮肉腸貯藏過程中色度的變化

2.3.1 牦牛鮮肉腸貯藏過程中L*值的變化

肉制品的色澤是影響消費(fèi)者購買與否的重要因素，對肉腸顏色感官評價可對牦牛鮮肉腸的新鮮度進(jìn)行快捷簡單的評定。貯藏期間牦牛肉腸的L*值變化見表2。

表2 牦牛鮮肉腸貯藏過程中L*值的變化Table 2 Changes of L* values of yak meat sausage during storage

由表2可知，在15 d貯藏期內(nèi)各處理組的L*值總體呈現(xiàn)下降的趨勢(P<0.05)，對照組的下降趨勢較為明顯，第1天時各處理組的L*值變化差異不顯著(P>0.05)。添加LAE后肉腸亮度的下降趨勢略減緩，高濃度LAE和低濃度LAE對亮度值的影響不大，LAE+Nisin與LAE+CS復(fù)配組在一定程度上可抑制亮度降低，且LAE+CS的復(fù)配效果優(yōu)于LAE+Nisin。LAE+Nisin+CS的復(fù)配效果最好，說明LAE與兩種保鮮劑復(fù)配后有較為顯著的護(hù)色作用。

2.3.2 牦牛鮮肉腸貯藏過程中a*值的變化

牦牛鮮肉腸貯藏期內(nèi)各處理組的a*值變化見表3。

表3 牦牛鮮肉腸貯藏過程中a*值的變化Table 3 Changes of a* values of yak meat sausage during storage

肉色能直觀反映肉的新鮮程度，a*值越大表示肉色越鮮紅，其變化主要是由于肌紅蛋白(Mb)的幾種存在方式，即鮮紅色氧合態(tài)MbO2、褐紅色氧化態(tài)MMb以及紫紅色還原態(tài)Mb相互轉(zhuǎn)化的速率來決定的，而MMb還原速率或Mb氧合速率越快，則MbO2的含量越高，肉色越鮮紅，a*值越大。由表3可知，牦牛肉腸在貯藏期內(nèi)各處理組的a*值總體呈現(xiàn)下降的趨勢(P<0.05)，第1天和第3天各處理組的a*值變化差異不顯著(P>0.05)，高濃度LAE組的a*值在第15天時略高于低濃度LAE組，說明LAE的濃度對a*值有一定影響，且濃度越大護(hù)色能力越強(qiáng)。第6天后各組的a*值變化差異顯著(P<0.05)，高濃度LAE組與LAE+Nisin復(fù)配組在第15天時a*值變化差異不顯著(P>0.05)。第15天時LAE+Nisin組與LAE+CS組的a*值變化差異顯著，LAE+CS組的a*值高于LAE+Nisin組，說明CS的護(hù)色效果明顯優(yōu)于Nisin，3種保鮮劑復(fù)配效果最好，因殼聚糖具有良好的抗氧化效果，在實(shí)驗(yàn)過程中能顯著延緩血紅蛋白及類胡蘿卜素等呈色物質(zhì)氧化，LAE與另外兩種保鮮劑均具有一定抗菌能力，在牦牛肉貯藏過程中可有效延緩由于微生物生長導(dǎo)致的肌肉組織水分流失與結(jié)構(gòu)的損壞[24]。

2.3.3 牦牛鮮肉腸貯藏過程中b*值的變化

牦牛鮮肉腸貯藏期內(nèi)各處理組的b*值變化見表4。

表4 牦牛鮮肉腸貯藏過程中b*值的變化Table 4 Changes of b* values of yak meat sausage during storage

由表4可知，隨著貯藏時間的延長，各處理組的b*值呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(P<0.05)。隨著貯藏時間的延長，肉腸會發(fā)生腐敗，細(xì)菌等微生物在腸體內(nèi)不斷生長繁殖，部分蛋白被分解，使得肉腸的色澤發(fā)黃、發(fā)綠、發(fā)青并且產(chǎn)生黃光，導(dǎo)致肉腸的a*值逐漸下降，b*值逐漸上升[25]。前3 d各處理組的b*值變化差異不顯著(P>0.05)，第6天后對照組與其他處理組在各測定時間點(diǎn)b*值變化差異顯著(P<0.05)，高濃度LAE組的b*值在第15天時高于低濃度LAE組，說明LAE在一定程度上可以抑制牦牛肉腸b*值的改變，高濃度LAE組與LAE+Nisin組的護(hù)色能力相差不大，LAE+CS組的護(hù)色效果優(yōu)于LAE+Nisin組，這可能與殼聚糖的護(hù)色效果有關(guān)。在15 d貯藏期內(nèi)，對照組增加的趨勢最顯著，LAE+Nisin+CS組b*值增加的趨勢最緩慢，其護(hù)色效果明顯優(yōu)于其他處理組。

2.4 牦牛鮮肉腸貯藏過程中硫代巴比妥酸值(TBA)的變化

在冷藏過程中，隨著貯藏時間的延長，牦牛鮮肉腸中脂肪的氧化程度過高，會產(chǎn)生不愉快的氣味，影響肉腸的品質(zhì)及營養(yǎng)價值[26]。隨著貯藏時間的延長，牦牛肉腸中不飽和脂肪酸會逐漸氧化形成丙二醛，丙二醛會與硫代巴比妥酸發(fā)生反應(yīng)形成有色物質(zhì)，測定TBA值可評價貯藏過程中牦牛肉腸的脂肪氧化程度。牦牛肉腸貯藏期間TBA值的變化見圖2。

圖2 牦牛肉腸貯藏過程中TBA值的變化

由圖2可知，整個貯藏期內(nèi)所有組別的TBA均呈現(xiàn)增加趨勢(P<0.05),說明肉腸在貯藏過程中發(fā)生了脂肪氧化，且對照組的增加趨勢比添加保鮮劑組更顯著(P<0.05)，添加保鮮劑可抑制肉腸中脂肪氧化，高含量LAE組的抑制效果強(qiáng)于低含量LAE組，復(fù)配組的抑制效果強(qiáng)于單一保鮮的抑制效果。LAE+CS組比的抑制脂肪氧化能力稍強(qiáng)于LAE+Nisin組，可能是殼聚糖具有良好的成膜性，能夠選擇性抑制O2滲入，使微環(huán)境中CO2增多，以達(dá)到抗氧化的目的。LAE與Nisin、CS復(fù)配使用時效果最顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，3種保鮮劑復(fù)配可以協(xié)同降低肉腸中微生物對脂肪氧化的作用。

2.5 牦牛鮮肉腸貯藏過程中持水性的變化

持水性是評價肉品品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，對肉的顏色、嫩度和多汁性都有著直接的影響。肉品的持水性過低將會導(dǎo)致肉中營養(yǎng)成分，例如游離氨基酸和核苷酸成分流失，降低肉品的營養(yǎng)價值[27]。持水性越高說明牦牛肉腸中的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，束縛水的能力越強(qiáng)。肉腸在貯藏過程中部分蛋白質(zhì)會水解，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞內(nèi)的水分會向細(xì)胞外逐漸擴(kuò)散，增加汁液流失率，另外，細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶也能加大蛋白的水解程度，隨著貯藏時間的延長，肉腸內(nèi)微生物快速繁殖，加快了細(xì)胞破壞速度與蛋白水解速度，使得牦牛鮮肉腸持水性持續(xù)下降。牦牛鮮肉腸貯藏期間持水性的變化見圖3。

圖3 牦牛鮮肉腸貯藏過程中持水性的變化

各處理組的持水性在15 d貯藏期內(nèi)呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢(P<0.05)，其中對照組的持水性下降最為顯著(P<0.05)，其次是低濃度LAE組與高濃度LAE組，再次為LAE+Nisin組與LAE+CS組，而LAE+Nisin+CS組在第15天持水性下降最低，說明3種保鮮劑復(fù)配能顯著緩減肉腸中水分在外力作用下的流失，結(jié)合殼聚糖對畜、禽肉制品的持水力以及抗氧化能力對肉腸品質(zhì)有較好的改善效果，這與王黎明等的研究結(jié)果一致[28]。

3 結(jié)論

LAE具有廣譜抑菌活性，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌均有顯著的抑制效果，且對革蘭氏陽性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌。將LAE單獨(dú)及與天然保鮮劑Nisin和CS復(fù)配用于牦牛鮮肉腸的保鮮，最優(yōu)配方為0.2 g/kg LAE+0.3 g/kg Nisin+5 g/kg CS，在貯藏第15天時其酸價、紅度值、亮度值、硫代巴比妥酸分別為0.423 mg/g、10.86 mg/g、39.05 mg/g、0.702 mg/kg，3種保鮮劑復(fù)配能較好地保持牦牛鮮肉腸的貯藏品質(zhì)。通過將LAE與Nisin、CS復(fù)配可有效抑制貯藏過程中牦牛鮮肉腸脂肪氧化酸敗，保持較好色澤，延長保質(zhì)期，為牦牛肉制品保鮮技術(shù)提供了新思路。