響應(yīng)面法優(yōu)化松茸蛋白的提取工藝

賴雨微，張倩，高俊鵬，劉翔，王剛，陳光，李艷麗*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)秸稈生物學(xué)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130118；2.武漢森瀾生物技術(shù)有限公司，武漢 430120)

松茸(Tricholomamatsutake)，又名松口蘑、松菇、松菌、松蘑、合菌、大花菌、剝皮菌等[1]，位于中國“四大名菌”之首，享有“菌中之王”的美譽(yù)[2]。松茸是松櫟等樹木外生的菌根真菌，研究表明，松茸具有抗腫瘤、抗輻射、美白、抗氧化、預(yù)防糖尿病以及增強(qiáng)免疫力等營養(yǎng)和藥用價(jià)值[3-5]，目前松茸子實(shí)體在亞洲和北歐均具有重要的商業(yè)價(jià)值[6]。在我國，松茸主要分布在東北、四川、云南等地，隨著近年來研究的深入，美洲、歐洲和北美洲等地也相繼有報(bào)道[7]。松茸含有蛋白、多糖、萜類、皂苷等多種物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量明顯優(yōu)于其他食用菌，新鮮松茸中的粗蛋白含量可以達(dá)到20.07%，其中純蛋白含量在8.8%～10%；烘干后松茸中的蛋白質(zhì)含量也在13%，松茸中含有17種氨基酸和多種維生素，此外，松茸水解后的產(chǎn)物具有促進(jìn)健康和改善生物體機(jī)能的功效[8]。

目前生物體獲取的蛋白質(zhì)來源于動物、植物和食用菌中[9]。而動物源蛋白質(zhì)的開發(fā)周期長且在生產(chǎn)過程中會導(dǎo)致溫室氣體的排放[10]，食用后也可能造成心腦血管疾病等健康風(fēng)險(xiǎn)[11]。而植物源蛋白中往往必需氨基酸受限，比如豆類蛋白含硫氨基酸含量較低，谷類蛋白賴氨酸含量較低[12]，限制了其營養(yǎng)學(xué)價(jià)值。而食用菌中蛋白含量豐富[13]，與動、植物源蛋白質(zhì)相比，具有更高的營養(yǎng)價(jià)值和安全性[14-15]。研究表明松茸菌絲體可以體外培養(yǎng)，有望進(jìn)行半人工栽培[16-18]，相信隨著生物技術(shù)的逐步發(fā)展，松茸的人工栽培技術(shù)終將實(shí)現(xiàn)。這些特性都將為松茸開發(fā)成為功能性食品配料提供理論依據(jù)。因此，將松茸中的功能性物質(zhì)充分開發(fā)與利用勢在必行。

國內(nèi)外對于松茸蛋白提取的研究較少，主要集中在對松茸菌絲體中多糖或糖蛋白的提取以及其生物活性的研究，且利用超聲輔助堿提優(yōu)化松茸蛋白提取條件的研究尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用超聲輔助堿提法對松茸蛋白進(jìn)行提取，結(jié)合單因素試驗(yàn)進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對堿提松茸蛋白的工藝進(jìn)行超聲輔助優(yōu)化，并在不同的pH下對松茸蛋白的功能性質(zhì)進(jìn)行測定，為松茸蛋白的提取和進(jìn)一步綜合開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生新鮮松茸子實(shí)體、大豆油：市售；牛血清白蛋白：福州飛凈生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉：均為分析純，北京化工廠；硫酸銨：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SIN415-2903型酶標(biāo)儀 Omega公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TG2-16B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Kjeltee-8400型全自動凱氏定氮儀 丹麥福斯分析儀器有限公司；KQ-250DV型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將新鮮松茸清洗后切片陰干，于烘箱中50～60 ℃烘干至恒重，通風(fēng)冷卻后粉碎過70目篩，得松茸干粉，置于干燥環(huán)境下密封保存。

1.2.2 松茸蛋白的提取

1.2.2.1 堿提法提取松茸蛋白

經(jīng)1.2.1處理的松茸蛋白，按照一定的固液比在一定pH下進(jìn)行堿提，保持恒定溫度提取一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后以10000 r/min離心20 min，收集上清液，采用考馬斯亮藍(lán)G250法測定提取液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.2.2 超聲輔助堿提法優(yōu)化松茸蛋白提取工藝

在堿提法提取的基礎(chǔ)上，優(yōu)化超聲輔助提取松茸蛋白的條件，調(diào)節(jié)一定固液比的反應(yīng)溶液pH，在固定超聲功率200 W下超聲提取一段時(shí)間后，在恒溫下提取一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后以10000 r/min離心20 min，收集上清液采用考馬斯亮藍(lán)G250法[19]測定提取液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 松茸蛋白質(zhì)含量的測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制100 mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋到不同濃度，采用考馬斯亮藍(lán)G250法測定OD595處的吸光度，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 樣品中蛋白質(zhì)含量的測定

參照考馬斯亮藍(lán)G250法測定樣品溶液在OD595處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中松茸蛋白質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算蛋白質(zhì)的提取率。

1.3 松茸蛋白堿提取的單因素試驗(yàn)

松茸干粉→不同pH的堿液(用0.20 mol/L NaOH調(diào)節(jié)堿提液pH)→調(diào)節(jié)堿提溫度→穩(wěn)定溫度堿提一定時(shí)間。

以上述松茸蛋白堿提取的流程為基礎(chǔ)，以松茸蛋白的提取率為指標(biāo)，保持其他條件不變的情況下分別考察料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90)、堿提溫度(40，50，60，70，80，90 ℃)、堿提時(shí)間(0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 h)和pH(7.5，8.5，9.5，10.5)對松茸蛋白提取率的影響。

1.4 超聲輔助提取松茸蛋白

基于1.3中得到的最佳堿提條件，研究超聲輔助提取時(shí)間對松茸蛋白提取率的影響。以松茸蛋白的提取率為指標(biāo)，料液比為1∶50，在常溫下進(jìn)行超聲后繼續(xù)進(jìn)行堿提，堿提條件參照1.3中得到的最佳蛋白提取條件，考察最佳超聲時(shí)間(5，10，20，30，40 min)對松茸蛋白提取率的影響。

根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果，考察在超聲輔助的前提下堿提法中各單因素的變化對蛋白提取率的影響。由于料液比對松茸蛋白提取的影響很小，則固定料液比為1∶50，只選取影響顯著的3個(gè)因素：溫度(X1)、時(shí)間(X2)、pH(X3)。以松茸蛋白提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化，對提取條件進(jìn)行分析與優(yōu)化，試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.5 固體硫酸法沉淀松茸蛋白

1.5.1 鹽析法沉淀蛋白

向松茸蛋白提取液中加入不同質(zhì)量的固體硫酸銨，緩慢攪拌使其溶解，在室溫下勻速混合1 h，在4 ℃下靜置過夜，將有沉淀析出的溶液輕搖混勻后，以10000 r/min離心20 min。用PBS緩沖液溶解沉淀得松茸蛋白溶液，測定溶液中蛋白含量，確定沉淀松茸蛋白的硫酸銨溶液最佳飽和度。

1.5.2 透析除鹽

將松茸蛋白溶液置于透析袋中，4 ℃過夜，期間更換3次PBS緩沖液，進(jìn)行透析除鹽。

1.5.3 冷凍干燥

將透析后的松茸蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥，得松茸蛋白凍干粉。

1.5.4 松茸蛋白的SDS-PAGE電泳檢測

將適量松茸蛋白凍干粉用50 μL PBS (50 mmol/L， pH 7.5)緩沖液溶解，離心取15 μL樣液與15 μL 2×Buffer混合后于沸水浴中煮沸10 min，冷卻離心，每孔加20 μL上清液上樣。采用12.5%的SDS-PAGE蛋白預(yù)制膠進(jìn)行恒壓(120 V)電泳，待溴酚藍(lán)至前沿1 cm左右結(jié)束電泳，使用蛋白染色液進(jìn)行凝膠染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 松茸蛋白的提取

2.1.1 單因素對堿提法提取松茸蛋白的影響

2.1.1.1 料液比對松茸蛋白提取率的影響

由圖1可知，在相同反應(yīng)條件下，松茸蛋白的提取率隨著固液比的逐漸增大而逐漸上升，但從1∶50開始松茸蛋白提取率的上升趨勢逐漸變緩，提取率上升并不明顯。這可能是由于在1∶50之前松茸干粉在溶液中的溶解還不完全，而隨著料液比的逐漸增加，料液間的相互接觸面積逐漸增加而使提取率上升，考慮到試驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)實(shí)惠性，后續(xù)的試驗(yàn)采用固定1∶50的料液比進(jìn)行。

圖1 料液比對松茸蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of Tricholoma matsutake protein

2.1.1.2 pH對松茸蛋白提取率的影響

由圖2可知，溶液的pH由6升高到7時(shí)，提取率迅速提高。高于7以后，提取率上升趨勢變緩。當(dāng)達(dá)到9.5時(shí)，提取率達(dá)到最大值，高于此pH，提取率下降。出現(xiàn)這種趨勢的原因是溶液中合適的堿環(huán)境能夠破壞松茸細(xì)胞壁，使松茸蛋白大量釋放，進(jìn)而呈現(xiàn)提取率不斷上升的趨勢，而過高的堿濃度會使美拉德反應(yīng)的進(jìn)行加快，使提取率下降，故本試驗(yàn)選取pH 9.5為松茸蛋白堿提法提取的最佳pH。

圖2 pH對松茸蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

2.1.1.3 時(shí)間對松茸蛋白提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間由1 h提高到2.5 h時(shí)，提取率迅速升高，到2.5 h時(shí)達(dá)到最高值，此后提取率呈現(xiàn)下降趨勢。出現(xiàn)這種情況的原因是在2.5 h前松茸細(xì)胞壁在堿液的作用下還未被完全破壞，使其內(nèi)在的活性成分沒有得到完全釋放，而2.5 h后堿液破壞松茸蛋白釋放的蛋白，導(dǎo)致蛋白提取率下降，故選擇2.5 h為松茸蛋白堿提法提取的最佳時(shí)間。

圖3 時(shí)間對松茸蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of time on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

2.1.1.4 溫度對松茸蛋白提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)溶液溫度為75 ℃時(shí)，提取率最高，達(dá)到峰值。溫度由50 ℃提高到75 ℃時(shí)，提取率迅速上升，當(dāng)大于75 ℃后，隨著溫度升高，提取率迅速下降。出現(xiàn)這種情況的原因是逐漸升高的溫度會導(dǎo)致細(xì)胞壁逐漸被破壞，使蛋白質(zhì)加速釋放，而當(dāng)溫度過高時(shí)溶液中析出的蛋白質(zhì)發(fā)生變性從而導(dǎo)致提取率下降，故選擇75 ℃為松茸蛋白堿提法提取的最佳溫度。

圖4 溫度對松茸蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

綜上，對松茸蛋白的堿提條件進(jìn)行了單因素研究，確定了最佳條件：料液比為1∶50，pH為9.5，提取時(shí)間為2.5 h，溫度為75 ℃，此時(shí)松茸蛋白提取率為4.9%。

2.1.2 超聲輔助對堿提法提取松茸蛋白的影響

對松茸干粉溶液進(jìn)行超聲輔助堿提，研究超聲時(shí)間對蛋白提取率的影響。由圖5可知，超聲時(shí)間為20 min時(shí)蛋白提取率最高，為5.6%，比單獨(dú)使用堿提法提高了14%。

圖5 超聲時(shí)間對松茸蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

2.1.3 超聲輔助堿提法提取松茸蛋白的響應(yīng)面優(yōu)化

2.1.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

超聲輔助堿提法提取松茸蛋白的響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken松茸蛋白質(zhì)提取優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken optimization test design and results of Tricholoma matsutake protein extraction

續(xù) 表

在超聲輔助提取20 min的基礎(chǔ)上，采用Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，擬合二次方程為Y=8.02-0.31A-0.29B-0.25C+0.35AB-0.23AC+0.12BC-1.06A2-0.96B2-0.035C2。

2.1.3.2 二次回歸模型的建立及顯著性分析

由表3可知，模型的F=87.56，P=0.0001<0.05，說明該模型差異較顯著；失擬項(xiàng)的P=0.1197>0.05,表明回歸模型在可接受范圍內(nèi)。模型決定因素R2=0.9912，校正系數(shù)RAdj2=0.9799，說明松茸蛋白提取率與該模型擬合程度較高，能很好地反映各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系。模型中A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2均小于0.05，說明A、B、C 3個(gè)因素及3個(gè)因素的交互項(xiàng)對松茸蛋白提取率均具有顯著影響；C2值為0.5769>0.05，說明該項(xiàng)對松茸蛋白提取率無顯著影響。綜上所述，各因素對松茸蛋白提取率影響的主次順序?yàn)闀r(shí)間>溫度>pH。

表3 回歸模型各項(xiàng)方差分析Table 3 Variance analysis of each item of regression model

2.1.3.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析及驗(yàn)證試驗(yàn)

3D曲面圖平緩和陡峭的趨勢可以直觀、完整地反映出各因素對松茸蛋白提取率的影響。表面越陡，此因素對結(jié)果的影響越大，表面越光滑，則該因素對結(jié)果的影響越小。等高線圖提供了兩個(gè)獨(dú)立變量之間相互作用的更直觀視圖。等高線圖形狀越接近橢圓，則相關(guān)性越大，而越接近法線圓，則相關(guān)性越小。

由圖6～圖8可知，在pH固定的前提下，松茸蛋白的提取率隨著時(shí)間和溫度的變化其變化幅度較大；而在溫度和時(shí)間固定的前提下，松茸蛋白的提取率隨著pH的變化其變化幅度較小。這也充分說明提取溫度和時(shí)間對松茸蛋白提取率的影響較顯著，對三維曲面圖的分析與方差分析的結(jié)果較為一致。通過等高線圖比較，溫度與時(shí)間的相互作用不大，而時(shí)間與pH和溫度與pH之間的相互作用較大。

綜合分析以上結(jié)果并結(jié)合回歸模型，確定松茸蛋白質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)為時(shí)間1.46 h，溫度74.00 ℃，pH 9.06，預(yù)測理論提取率為8.39%。根據(jù)實(shí)際情況，將提取時(shí)間調(diào)整為1.5 h，溫度為74 ℃，pH值為9.0，進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：蛋白提取率為8.30%±0.21%，與模型預(yù)測理論值基本一致，說明該模型可以模擬和預(yù)測松茸蛋白質(zhì)提取率的變化。經(jīng)過響應(yīng)面法優(yōu)化條件后，提取率比優(yōu)化前提高了48%，比堿提法提高了69%。

2.2 不同飽和度的硫酸銨對松茸蛋白提取的影響

將松茸粗蛋白溶液進(jìn)行硫酸銨鹽析，結(jié)果見圖9，蛋白質(zhì)含量可以直觀地反映在OD值上。上清液OD值隨著飽和度的增加下降明顯，達(dá)到90%時(shí)幾乎檢測不到蛋白。沉淀溶解后的OD值則恰好出現(xiàn)相反的趨勢，當(dāng)飽和度達(dá)到90%時(shí)，沉淀OD值達(dá)到最大，說明此條件下，蛋白質(zhì)沉淀最完全。因此，確定硫酸銨飽和度為90%。

圖9 硫酸銨飽和度對松茸蛋白提取率的影響Fig.9 Effect of ammonium sulfate saturation on the extraction rate of Tricholoma matsutake protein

2.3 SDS-PAGE檢測結(jié)果

將松茸蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,圖10可知，松茸蛋白的亞基分布范圍廣泛。根據(jù)電泳結(jié)果，推算得出標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量(Mr) 與其相對遷移率(Rf) 之間的關(guān)系公式，即lgMr=-1.2861Rf+2.1461(R2=0.9926)。從而計(jì)算出松茸蛋白分子量集中在0.81～10.14 kDa區(qū)間，在14.3～0.81 kDa范圍內(nèi)條帶較深，說明此范圍蛋白質(zhì)亞基種類多。

圖10 松茸蛋白的SDS-PAGE電泳圖 Fig.10 SDS-PAGE electropherogram of Tricholoma matsutake protein

3 討論與結(jié)論

堿提法是提取植物蛋白最常用的傳統(tǒng)方法[20]，該方法在食用菌中也有少量報(bào)道[21-22]，其原理為破壞細(xì)胞壁[23]，斷裂二硫鍵[24]。蛋白質(zhì)堿提過程中，一定范圍內(nèi)的溫度、時(shí)間、pH對提取率的影響具有相似性。提高溫度有助于細(xì)胞壁裂解，從而使提取率增加。提高pH會使蛋白質(zhì)中的酸性氨基酸和中性氨基酸解離程度增加，從而溶解性增加使提取率增加。延長時(shí)間會增加蛋白質(zhì)在溶劑中溶解并釋放到胞外的機(jī)會，從而使提取率增加。但當(dāng)溫度、pH值、時(shí)間超過了閾值便會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,從而使提取率下降。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是生物大分子，在一定溫度和pH的溶劑中過久暴露會引起變性，從而使提取率下降。綜上，溫度、pH和時(shí)間三者相互作用，只有恰到好處，方能獲得最大提取率。本試驗(yàn)結(jié)果得出了與上述相一致的結(jié)論。

超聲法提取蛋白質(zhì)屬于非傳統(tǒng)的物理方法，是當(dāng)今食品加工中最常用的技術(shù)之一[25]，已在食用菌中有少量報(bào)道[26]。超聲提取的原理在于在超聲頻率范圍內(nèi)在溶劑中會產(chǎn)生大的空化泡，這些空化泡的崩潰導(dǎo)致極端的機(jī)械剪切力，使介質(zhì)細(xì)胞壁被破壞，從而使提取率提高[27]。本研究發(fā)現(xiàn)超聲20 min時(shí)提取率最高，超過20 min后下降，這是因?yàn)槌晻r(shí)間過短，難以破壞細(xì)胞壁；超聲時(shí)間過長，蛋白質(zhì)發(fā)生變性從而使提取率下降。

為進(jìn)一步提高提取率，對超聲輔助堿提法進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)松茸蛋白提取率比優(yōu)化前提高了48%，比單獨(dú)堿提法提高了69%。這進(jìn)一步證明響應(yīng)面法是評價(jià)多因素交互作用從而優(yōu)化工藝條件的有效方法[28]。此外，還發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)堿提法相比，最佳提取時(shí)間由2.5 h縮短到1.5 h，pH值由9.5下降到9.0。Sari等研究表明，不同來源的植物蛋白質(zhì)采用堿提法提取，得到的提取率相差較大。谷物和豆類提取率較高，微藻類提取率較低，這主要取決于細(xì)胞壁成分。參考模式擔(dān)子菌裂褶菌的細(xì)胞壁，其主要成分為不溶于堿的β-葡聚糖、幾丁質(zhì)及其他化合物[29-30]，這可能是單獨(dú)堿提法提取率較低的主要原因，而超聲輔助法可有效破壞細(xì)胞壁，從而使提取率提高。

本試驗(yàn)利用超聲輔助堿提法提取松茸蛋白質(zhì)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，最終確定了松茸蛋白質(zhì)的提取工藝，為松茸蛋白質(zhì)的開發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。