基于高通量測序分析不同食鹽濃度的酸菜中微生物多樣性

賈晶晶，魏愛麗，趙虎威，燕平梅

(太原師范學院 生物系，山西 晉中 030012)

我國人口眾多，物產豐富，地域遼闊，具有民族特色的傳統食品分布全國各地。在傳統食品中極具特色的代表之一就是發酵蔬菜制品[1]。而酸菜是最具有代表性的發酵蔬菜之一，在現代生活中扮演著重要的營養角色，是將新鮮蔬菜經微生物的作用發生一些理想的生化反應而成的一種蔬菜制品。在發酵中起主要作用的微生物是乳酸菌[2]。適量食用酸菜有益人體健康，能促進腸道菌群的增長，且具有降膽固醇、降血壓、降血脂、提高人體免疫力等一系列益處[3]，還可以降解草酸鹽以防治腎臟疾病，幫助人體吸收鐵元素，因此深受人們的喜愛。

目前酸菜大多采用自然發酵的方法來制作，其發酵過程不易控制，且會因加入不合適的鹽量而產生過量對人體有害的亞硝酸鹽，帶來嚴重的食品安全隱患，故一定程度上制約了酸菜的生產數量和質量。適當濃度的鹽溶液不僅可以控制酸菜中乳酸菌的生長代謝活動，影響其風味與品質，而且可使酸菜不易腐敗，增加其保質期。

傳統的微生物純培養方法是早期對酸菜中微生物多樣性研究的主要方法，通過培養基培養的微生物根據微生物的形態或生化特征進行鑒定，然后經顯微鏡觀察法和生化鑒定來對樣品中的微生物種屬進行分類鑒定[4]。傳統的純培養方法具有原理簡單、實驗設備要求較低、微生物形態觀察和計數便捷等優勢，但其也有得到的結果不能完全反映樣品中微生物多樣性的劣勢[5]，盡管依賴純培養的方法具有很多局限性，但這種方法依然大大推動了微生物學的發展。近年來，以克服傳統微生物學鑒定的局限性，不需要任何培養步驟，通過DNA分析的Culture-Independent方法被開發出來[6-8]，如基于分子生物學的高通量測序技術[9-10]，此技術克服了傳統的微生物純培養技術的限制，能夠更加客觀地分析樣品，以及更為準確地分析微生物組成、多樣性和動態變化，揭示更為復雜的細菌多樣性，包括不可培養的微生物、亞優勢種群和后期生長的物種。高通量測序技術已經廣泛應用在分析水體、發酵食品、土壤微生物多樣性等領域[11-13]，是目前對微生物多樣性分析研究的主流方法。

本實驗運用高通量測序技術，通過對食鹽濃度分別為8%、12%的酸菜樣品中微生物群落多樣性的研究，探討了不同食鹽濃度下酸菜發酵過程中微生物群落的結構組成及變化，對于改善酸菜的風味、提高酸菜的營養價值、降低酸菜中的有害物質有著積極作用，為酸菜的工業化生產提供了一定的理論指導。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

新鮮卷白菜；食用鹽；DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 實驗儀器

DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀 北京六一儀器廠；TGL-16B型高速離心機 上海安亭科學儀器廠；JB-CJ-1000FX型潔凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；YEC4A271069型移液器 大龍興創實驗儀器(北京)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

將新鮮卷白菜置于陰涼通風處干燥脫水72 h，洗凈瀝干后分別裝入6個洗凈晾干的泡菜壇中，每壇裝200 g卷白菜，并用壓菜石壓緊。每3壇為一個對照組，分別加入160，240 g食鹽，按一層白菜一層鹽的順序壓緊，最上面用食鹽封頂后，用壓菜石壓緊，倒入2 L冷開水，淹沒白菜，蓋上壇蓋，壇沿加水，置于15 ℃陰涼通風處進行發酵。

1.2.2 樣品DNA的提取及PCR擴增

待酸菜發酵至第14天時，使用移液器分別從酸菜液的上、中、下部各取12 mL樣液總計36 mL置于離心管內，10000 r/min離心10 min，倒掉上清液，收集底部菌體，將每個對照組所收集到的3份底部菌體混合后置于2 mL的EP管內備用。

按照細菌基因組DNA提取試劑盒對6個樣品的DNA進行提取。提取完成經瓊脂糖凝膠電泳儀檢測DNA質量后，將其置于-20 ℃以備后續實驗操作。

采用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTATAAT-3′)為引物擴增細菌16S rDNA V3-V4區序列，然后按照PCR產物的檢測方法檢測。

1.2.3 高通量測序

將提取到的DNA樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行MiSeq測序。按照97%相似性對非重復序列進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類，最后采用RDP Classifier貝葉斯算法對 97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個水平統計每個樣品的群落組成，細菌使用Silva數據庫進行比對。

1.2.4 數據分析

利用Mothur軟件構建稀釋性曲線；利用QIIME軟件對樣品的Chao豐富度指數、香農(Shannon)多樣性指數、辛普森(Simpson)多樣性指數等進行計算；利用柱形圖和環狀圖展示不同分類水平下各門和屬的相對含量；利用SPSS 16.0進行統計分析，R語言制作熱圖，Excel軟件繪制柱形圖、群落分布環狀圖。

2 結果與分析

2.1 稀釋曲線

以抽取的數據量為橫坐標，以Alpha多樣性指數Shannon多樣性指數值為縱坐標繪制曲線(見圖1)，根據曲線是否達到平緩來判斷本次測序數據量是否足夠，測序深度是否可以較為可靠地表現出該樣品的微生物組成。

圖1 不同食鹽濃度樣品的稀釋曲線圖Fig.1 The dilution curves of samples with different salt concentrations

由圖1可知，6個樣品的稀釋曲線趨于平緩，故說明此次測序數據呈飽和狀態，其測序結果可以涵蓋酸菜樣品中絕大多數的物種，滿足了后續生物信息學分析的要求。

2.2 發酵酸菜中細菌序列豐度及多樣性分析

利用高通量測序方法對不同食鹽濃度的發酵酸菜液樣品進行分析，共得到40769條序列，157個可操縱分類單元(OTU)。

Shannon多樣性指數、Chao豐富度指數、Simpson多樣性指數是常見的Alpha多樣性指數。本研究中所得到的Alpha多樣性指數見表1。群落Alpha多樣性指數能夠反映出物種的豐富度和多樣性程度[14]。

表1 不同食鹽濃度發酵酸菜Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity indexes of fermented Chinesesauerkraut with different salt concentrations

由表1可知，8%食鹽的樣品Chao值和Shannon指數分別為109和2.14，高于12%食鹽濃度的104.33和1.89，故可說明在8%食鹽濃度的酸菜樣品中，其微生物的豐富度和多樣性較高。

2.3 不同食鹽濃度的發酵酸菜細菌群落結構分析

不同食鹽濃度的酸菜樣品中微生物在門水平上的相對含量分布見圖2，其細菌分屬5個門，Proteobacteria(變形菌門)和Firmicutes(厚壁菌門)為優勢菌門，此外，樣品中還有Actinobacteria(放線菌門)、Cyanobacteria(藍藻門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)。

圖2 8%、12%食鹽濃度的酸菜液在細菌門水平上的相對含量Fig.2 The relative content of Chinese sauerkraut solution with salt concentrations of 8% and 12% at the phylum level

由圖2可知，從門水平上來看，在8%食鹽濃度的酸菜樣品中，Proteobacteria的相對含量為49.27%，Firmicutes的相對含量為49.99%，另外3個門的總相對含量為0.73%；在12%食鹽濃度的酸菜樣品中，Proteobacteria的相對含量為67.01%，Firmicutes的相對含量為32.39%，其他3個門的總相對含量為0.60%。結果表明，盡管食鹽濃度不同，但其中Proteobacteria和Firmicutes均為優勢菌門。高通量測序結果與用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳結合熒光定量核酸擴增檢測系統[15]的方法來對發酵酸菜中微生物菌群結構進行分析的方法相比，研究結果更為準確、全面地揭示了酸菜中的細菌菌群結構，進一步證明了高通量測序技術在分析微生物群落結構方面的獨特優勢。

研究結果顯示：在酸菜發酵的過程中，第一優勢菌門為變形菌門，這一門的細菌通常構成了白菜本身的微生物群落，如假單胞菌和腸桿菌，第二優勢菌門為厚壁菌門。朱琳等研究在蘿卜酸菜發酵液中亞硝酸鹽的上升和回落的變化期間酸菜液中細菌群落結構的多樣性，表明在峰值期與回落期細菌多樣性大不相同，而在亞硝酸鹽的回落期酸菜液中第一優勢菌門為厚壁菌門[16]。本次實驗結果顯示：在8%食鹽濃度的酸菜樣品中，厚壁菌門(49.99%)的相對豐度高于變形菌門(49.27%)，說明其細菌群落符合亞硝酸鹽濃度回落期的細菌群落結構，可說明食鹽濃度在8%的發酵酸菜安全性相對較高。

不同食鹽濃度的酸菜液中細菌在屬水平上的相對含量(列舉前十種)見圖3和圖4。

圖3 8%食鹽濃度酸菜中微生物在屬水平上分布環狀圖Fig.3 Ring-like distribution of microorganisms in Chinese sauerkraut with 8% salt concentration at the genus level

圖4 12%食鹽濃度酸菜中微生物在屬水平上分布環狀圖Fig.4 Ring-like distribution of microorganisms in Chinesesauerkraut with 12% salt concentration at the genus level

由圖3和圖4可知，在8%食鹽濃度的酸菜樣品中，Enterobacter(腸桿菌屬)、Staphylococcus(葡萄球菌屬)、Lactococcus(乳球菌屬)、Bacillus(芽孢桿菌屬)、Weissella(魏斯氏菌屬)為優勢菌屬，其相對百分比分別為34%、25%、14%、9%、7%，此外，該樣品中還有Providencia(普羅威登斯菌屬)、Acinetobacter(不動桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Exiguobacterium(微桿菌屬)等。在12%食鹽濃度的酸菜樣品中，Lactococcus(乳球菌屬)、Enterobacter(腸桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)為優勢屬，其相對百分比分別為37%、31%、17%，此外，該樣品中還有Bacillus(芽孢桿菌屬)、Weissella(魏斯氏菌屬)、Delftia(代爾夫特菌屬)、Acinetobacter(不動桿菌屬)、Comamonas(叢毛單胞菌屬)、Lelliottia等。

二者對比，其優勢屬均有Enterobacter(腸桿菌屬)和Lactococcus(乳球菌屬)，且在12%食鹽濃度的酸菜樣品中Lactococcus的相對含量(37%)遠高于在8%食鹽濃度的酸菜樣品中的相對含量(14%)。故可知隨著食鹽濃度的增加，Lactococcus的相對含量有著升高的趨勢，且在不同食鹽濃度的酸菜樣品中乳酸菌均為優勢菌，因為其有益生作用，常作為發酵劑被廣泛應用于各類食品的生產加工過程中。

通過熱圖可視化方法可以直觀研究群落組成。由圖5可知，X1、X2、X3代表8%食鹽濃度的樣品，X4、X5、X6代表12%食鹽濃度的樣品，X2樣品中Enterobacteriaceae含量明顯高于其他樣品，可能是取樣不同造成差異明顯。所有菌群中，Lactococcus(乳球菌屬)在酸菜發酵中起主要作用，此外，Weissella(魏斯氏菌屬)也有發現，乳酸菌在酸菜發酵期間起到非常關鍵性的作用，這與國內外眾多學者的研究結果一致[17-18]。

圖5 不同樣品熱圖Fig.5 Heat map of different samples

3 討論

蔬菜的發酵作用主要是由其微環境中微生物的生長代謝活動引起的，且其中微生物的各種生長代謝活動對發酵蔬菜的各個方面都有著一定的影響。除了蔬菜中原本含有豐富的營養物質之外，發酵蔬菜中還有著蔬菜經乳酸菌的發酵作用形成的乳酸、核苷酸、醇類、醛類、酮類和酯類等物質，這些物質不僅賦予了酸菜獨特的風味，而且對人體的健康也大有裨益。

由于加工類型的不同，發酵所用的原材料品種、發酵溫度、鹽溶液濃度、發酵工藝等因素都會對發酵過程中的乳酸菌群落結構產生影響，且發酵溫度和鹽溶液濃度對其影響較大。熊濤等的研究表明，在泡菜的發酵過程中，菌系結構和其生長代謝活動對泡菜的品質有著顯著影響[19]，也有研究表明鹽度是影響大腸桿菌生長最主要的因素[20]。

本研究以8%和12%食鹽濃度的酸菜樣品為研究對象，利用高通量測序對其在發酵過程中的微生物多樣性進行了細致的研究，直觀地指出：在門水平上，Proteobacteria(變形菌門)和Firmicutes(厚壁菌門)為優勢菌門；在屬水平上，Enterobacter(腸桿菌屬)和Lactococcus(乳球菌屬)為優勢菌屬。且在12%食鹽濃度的酸菜樣品中Lactococcus的相對含量(37%)遠高于在8%食鹽濃度的酸菜樣品中的相對含量(14%)。結果表明，8%食鹽濃度的酸菜樣品中微生物的多樣性較高，而引起發酵的主要菌屬Lactococcus隨著食鹽濃度的增加有升高的趨勢。

研究不同食鹽濃度的酸菜中微生物的種類及群落差異對優化酸菜的發酵工藝，提高酸菜食品的安全性具有極其重要的作用。揭示特定環境中的微生物物種多樣性，尋找不同微生物在其特定生態系統中的相關作用仍是目前微生物生態學的熱門之一。然而目前對于酸菜中的微生物構效、互作關系及其相關的生理生化反應缺乏科學性和整體性的研究與標準，特別是缺乏對于乳酸菌在不同加工方式的酸菜中的生長規律及其在日常生活和工業中統一的、系統性的指導標準與應用，這些都將成為未來在蔬菜發酵研究過程中的重要課題。