NLRP3、GSTs、TLR4基因多態性與COPD易感性的關聯分析*

石 赟,陳艷蓉,張 凈,羅 佳

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院老年醫學科，北京100050)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以持續性氣流受限為特征，發病率逐年升高。影響COPD發生的因素較多，目前認為與遺傳、環境、吸煙、免疫、慢性炎癥等關系密切。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3)是NLRPs蛋白家族主要成員之一，已被證實在COPD的發生、發展中具有重要作用[1]。NLRP3基因多態性與多種炎性疾病有關，但與COPD間關系的研究目前較為缺乏。有研究顯示[2]，谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferases，GSTs)基因變異是影響COPD發生的獨立危險因素。但GSTs基因多態性與COPD的關系仍具有一定爭議。文獻指出[3]，Toll樣受體(toll-like receptors 4，TLR4)是天然免疫的重要分子，可識別內外源性病原體，介導炎性反應。本研究分析NLRP3、GSTs、TLR4基因多態性與COPD易感性的關聯，為臨床工作提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2021年1月本院收治的131例COPD患者為觀察組，另選取同期健康體檢者120例為對照。納入標準：(1)COPD患者符合《慢性阻塞性肺疾病基層診療指南(2018年)》[4]診斷標準；(2)年齡≥18歲。排除標準：(1)臨床數據不完整，對研究結果造成影響；(2)合并嚴重肝、腎功能異常；(3)合并免疫、血液系統疾病、全身感染或惡性腫瘤。本研究經本院醫學倫理委員會批準(2018-P2-137-01)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)檢測NLRP3、GSTs、TLR4的基因多態性。采集所有研究對象清晨外周靜脈血10 mL，采用酚-氯仿法提取外周血淋巴細胞中基因組DNA。經NanoDrop-2000c(美國Thermo Scientific公司)檢測DNA濃度。采用0.2 mL 96孔光學反應板(ABI 7300，美國Biosystemes公司)對NLRP3(rs3582941、rs10754558、rs3806265、rs4612666)、GSTs[GSTP1(rs1695)、GSTM1、GSTT1]、TLR4(rs2737190、rs7873784、rs10759932)進行基因分型。每微孔中總體積20 μL，通過10 μL MasterMix(ABI 700，美國Biosystemes公司)、0.5 μL AssayMix(美國ABI公司)、4.5 μL去離子水及5 μL DNA樣品組成。制備成含有1 000 μL MasterMix、50 μL AssayMix及450 μL去離子水混合物，取15 μL混合物與5 μL DNA樣品加入每個微孔。PCR反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個循環。反應完后使用等位基因辨別程序得到檢測結果。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組基本資料比較

兩組性別、年齡、飲酒比例、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、尿酸等比較無明顯差異(P>0.05)，觀察組吸煙比例明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組基本資料比較

組別n舒張壓(x±s,mmHg)空腹血糖(x±s,mmol/L)總膽固醇(x±s,mmol/L)甘油三酯(x±s,mmol/L)尿酸(x±s,μmol/L)對照組12080.20±8.575.85±1.034.20±0.651.36±0.38386.75±30.69觀察組13181.05±8.786.01±1.104.11±0.681.40±0.40390.65±31.02t/χ20.7751.1871.0720.8111.000P0.4390.2670.2840.4180.318

2.2 基因型及等位基因分布

經Hardy-Weinberg平衡檢驗，納入研究基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。單位點分析結果顯示，NLRP3(rs3806265)、TLR4(rs2737190、rs10759932)基因多態性與COPD發病有關(P<0.05)，見表2。

表2 基因型和等位基因分布

2.3 影響COPD發病的危險因素分析

吸煙、NLRP3 rs3806265位點、TLR4 rs2737190位點、TLR4 rs10759932位點是COPD發病的獨立影響因素(P<0.05)，見表3。

續表2 基因型和等位基因分布

表3 影響COPD發病的危險因素分析

3 討 論

COPD是全球范圍內發病率、死亡率均較高的呼吸系統疾病，發病機制目前尚不明確，普遍認為與吸煙等行為造成有害顆粒及有害氣體誘導肺部異常炎性反應有關。本研究顯示吸煙是影響COPD發病的獨立危險因素。但臨床數據顯示[5]，僅約20%長期吸煙者最終會發展為COPD。提示COPD的發病風險不僅與吸煙相關，還存在一定個體差異。相關流行病學調查顯示[6]，COPD的發生具有一定家族聚集性。全基因組關聯研究表明[7]，COPD遺傳學中發現許多疾病發病機制的相關候選基因，如維生素D結合蛋白基因、基質金屬蛋白酶基因、細胞外超氧化物歧化酶基因等，提示遺傳因素在COPD的發生中可能占據重要地位。

已有研究表明[8]，氧化與抗氧化失衡在COPD的發生、發展中具有重要意義。GSTs是機體Ⅱ相代謝酶，具備廣泛生物催化特性，通過排除親電子的外源物質發揮抗氧化作用，另外還可以滅活氧化應激反應形成的次生代謝物，如氫過氧化物、環氧化合物等。GSTs由至少8個基因位點編碼，其中GSTP1、GSTT1、GSTM1基因在一般人群中具有基因多態性，GSTM1與GSTT1基因多態性表現為缺失，導致酶活性喪失，GSTP1基因多態性表現為位于105密碼子的異亮氨酸轉變為纈氨酸，對酶催化活性有一定影響[9]。本研究結果顯示，GSTP1、GSTT1、GSTM1的基因多態性均與COPD發病無明顯關系。

NLRP3基因位于染色體1q44，基因編碼中含有pyrin結構域、核苷酸結合位點結構域及富含亮氨酸重復序列的pyrin樣蛋白，該蛋白是NLRP3炎性體復合物成員[10]。NLRP3炎性小體已被證實是核因子-κB(NF-κB)信號通路上游激活劑，在炎癥、細胞凋亡及免疫應答等反應中發揮調節作用[11]。另外有研究指出[12]，NLRP3炎性體的激活會激活半胱天冬蛋白酶-1，后裂解多種白細胞介素因子并將其釋放，與集體慢性炎癥及癌癥的發生、發展關系密切。陳幸等[13]研究發現NLRP3 rs4612666位點基因多態性與慢性牙周炎易感性關系密切。劉璐等[14]指出，NLRP3 rs10754558、rs3806268位點基因多態性與新疆地區漢族男性痛風的發生有一定關聯。本研究結果顯示，NLRP3 rs3582941、rs10754558、rs4612666位點基因多態性與COPD的發生均無明顯關聯。對照組與觀察組NLRP3 rs3806265位點T基因差異有統計學意義(P<0.05)，經多因素分析顯示，NLRP3 rs3806265位點基因多態性是COPD發生的獨立影響因素，與張之海等[15]研究結論一致。

TLRs家族在樹突細胞、單核細胞及巨噬細胞中廣泛表達，在機體炎性免疫應答反應中起關鍵作用。相關大鼠實驗研究顯示[16]，COPD大鼠模型中TLR4被激活，通過級聯反應激活NF-κB 信號通路中p65，并使其轉移至細胞核內與促炎基因的啟動子結合，擴增炎性反應，造成肺部組織炎性損傷。另有研究表明[17]，COPD患者外周血TLR4水平明顯升高，異常高水平TLR4將激活單核細胞導致氣道平滑肌細胞分泌大量炎性因子，推動氣道慢性炎癥發展。本研究結果顯示，兩組TLR4 rs2737190位點G、AG、AA及rs10759932位點C、CC、CT差異有統計學意義(P<0.05)，經多因素分析顯示TLR4 rs2737190、rs10759932位點基因多態性是COPD發生的獨立影響因素。

綜上所述，NLRP3 rs3806265位點、TLR4 rs2737190、rs10759932位點基因多態性影響COPD易感性，是COPD發病的獨立影響因素。