膽管癌患者組織中NLRP3炎性小體的表達水平與其臨床病理特征及預后的關系

余和斌，蒙喜云，郭 勇

(重慶市長壽區人民醫院肝膽外科 401220)

膽管癌是起源于膽管上皮的惡性腫瘤，可累及肝內、肝門及遠端膽管樹。目前，膽管癌是僅次于肝細胞癌的第二大常見肝臟惡性腫瘤，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，特別是大多數患者就診時已為中晚期，5年生存率不足30%[1]。近年來研究顯示，由免疫細胞觸發的炎癥與腫瘤形成、病情進展及預后密切相關[2]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體是驅動機體免疫炎性反應的主要機制，可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)，活化的caspase-1可介導蛋白水解切割和促炎細胞因子白細胞介素(IL)-1β和IL-18的釋放[3]。目前已發現NLRP3炎性小體在炎癥性疾病如糖尿病、動脈粥樣硬化、肝癌等疾病中明顯激活[4-6]，但目前在膽管癌研究較少。本研究通過檢測膽管癌患者NLRP3炎性小體表達水平，探討其與膽管癌患者臨床病理特征及預后的關系，以期為膽管癌患者的臨床治療提供新的靶點和預后評估提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年4月至2018年4月本院收治的行手術切除治療的142例膽管癌患者的臨床資料，其中男82例，女60例，年齡(59.4±10.4)歲；TNM分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期35例，Ⅲ期45例，Ⅳ期30例。納入標準：(1)經術后病理確診；(2)診治滿足膽管癌診治指南[7]；(3)未接受過放化療、生物治療及相關手術治療。排除標準：(1)存在其他膽系疾病；(2)各種急慢性感染；(3)近期使用過激素、免疫抑制劑；(4)存在其他部位惡性腫瘤。另選取40例正常膽管上皮組織作為對照，其中男22例，女18例，年齡(58.6±10.8)歲。對照組與膽管癌組在性別、年齡等方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院倫理委員會批準(AM201604102)并征得患者書面知情同意。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR檢測相關基因mRNA水平

收集研究對象組織樣本，采用RNeasy Tissue Mini試劑盒(美國Qiagen公司)提取總RNA。逆轉錄試劑盒(上海生工公司)從1 μg總的RNA中合成逆轉錄cDNA。Sybr-Green和CFX96 Thermal Cycler進行實時PCR定量反應。反應條件及相關基因(NLRP3和caspase-1)引物參考既往文獻[8]，以GAPDH為內參，計算各組相應基因的相對表達量。

1.2.2炎性細胞因子的檢測

采用ELISA法測定組織上清液IL-1β和IL-18水平，具體操作方法見武漢博士德生物公司提供的試劑盒說明書進行。

1.2.3臨床資料收集

收集患者臨床病理資料，包括性別、年齡、TNM分期、組織類型、腫瘤分化程度、是否發生淋巴結轉移及有無脈管侵犯等。

1.2.4隨訪

通過復診、電話和微信等方式進行隨訪，隨訪3年，截止時間為2021年4月，記錄患者生存狀況，分析NLRP3炎性小體表達與患者預后的關系。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組NLRP3炎性小體及下游通路指標水平比較

與對照組比較，膽管癌組患者組織NLRP3炎性小體和caspase-1 mRNA、 IL-1β及IL-18水平明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 兩組NLRP3炎性小體、caspase-1 mRNA及相關炎性因子水平比較

2.2 NLRP3炎性小體表達對患者長期生存狀態的預測能力

通過ROC曲線分析膽管癌患者NLRP3炎性小體表達水平對患者長期生存狀態的預測能力，其AUC為0.826(95%CI：0.766～0.887)，確定NLRP3炎性小體的最佳截斷界值為2.61，見圖1。以2.61為界，將142例患者分為低表達組(84例)和高表達組(58例)。

圖1 NLRP3炎性小體表達預測患者生存狀態ROC曲線

2.3 NLRP3炎性小體表達與膽管癌患者臨床病理關系

NLRP3炎性小體表達與患者性別、年齡、組織類型等無關(P>0.05)，與TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及脈管侵犯等有關(P<0.05)，見表2。

表2 NLRP3炎性小體表達與膽管癌患者臨床病理關系[n(%)]

2.4 NLRP3炎性小體表達與膽管癌預后的關系

NLRP3炎性小體高表達患者3年生存率25.86%(15/58)低于NLRP3炎性小體低表達患者55.95%(47/84)，差異有統計學意義(χ2=10.95，P<0.001)，見圖2。

續表2 NLRP3炎性小體表達與膽管癌患者臨床病理關系[n(%)]

圖2 Kaplan-Meier生存曲線比較

2.5 膽管癌患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析

單因素分析顯示，TNM分期、分化程度、淋巴結轉移、脈管侵犯及NLRP3炎性小體高表達與膽管癌患者的生存預后相關(P<0.05)，見表3。多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期、分化程度、淋巴結轉移及NLRP3炎性小體高表達是影響膽管癌患者生存預后的獨立因素(P<0.05)，見表4。

表3 膽管癌臨床病理特征與預后的關系[n(%)]

續表3 膽管癌臨床病理特征與預后的關系[n(%)]

表4 Cox多因素回歸分析膽管癌生存預后的影響因素

3 討 論

膽管癌是一種預后較差的惡性腫瘤，有報道顯示，即使經過根治性肝切除術，其5年總生存率也不足30%，其主要原因在于術后復發率高，同時缺乏全身有效的治療方案[9]。因此，探尋有效的評估患者病情及預后的分子指標，對于指導膽管癌的治療和改善預后，具有重要的臨床價值。

既往研究顯示，持續的炎性反應與惡性腫瘤的發生、發展密切相關[10]。NLRP3炎性小體是炎性反應激活的重要通路之一，其廣泛表達于腫瘤組織和非腫瘤組織中，其激活有賴于Toll樣受體磷酸化，隨后激活核因子-κB(NF-κB)[11]。相關研究顯示，NLRP3炎性小體除了參與惡性腫瘤的發生、發展以外，還與糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病的發生及進展相關，其可作為影響患者病情嚴重程度及預后的獨立危險因素，同時也可能是上述炎癥性疾病潛在的治療靶點[4-5]。有研究報道，NLRP3炎性小體在正常組織中的表達水平較低，但在早期胚胎和惡性腫瘤中呈現高表達，表明NLRP3炎性小體除了炎性反應外，還可能在高等真核生物生長和惡性腫瘤細胞的增殖和分化方面，發揮重要作用[12]。本研究結果顯示，膽管癌組織NLRP3炎性小體及相關下游通路指標表達水平明顯高于對照組，提示NLRP3炎性小體可能參與了膽管癌的發生過程，這與相關NLRP3炎性小體在肝癌中的研究結果一致。

NLRP3炎性小體相關通路的激活可能參與多種腫瘤的發生及進展[13]。前期有研究發現，乳腺癌患者及動物模型中NLRP3炎性小體表達水平明顯上調，并且其高表達與乳腺癌轉移和生存期相關[14]。其機制主要是NLRP3炎性小體激活下游IL-1β，調控基質金屬蛋白酶1(MMP1)、MMP3和MMP10的表達，同時IL-1β可激活NF-κB相關信號，招募單核細胞進入腫瘤局部微環境，促進腫瘤細胞侵襲和轉移[15]。而敲除或干擾NLRP3炎性小體表達，可明顯抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，通過抑制NLRP3炎性小體相關通路，可能成為乳腺癌治療的重要靶點[16]。NLRP3炎性小體還可介導IL-18的分泌，通過以下途徑抑制腫瘤的發生及發展[17]：(1)誘導和增強NK細胞對小鼠肝臟及結腸腫瘤細胞的殺傷活性；(2)促進IL-22結合蛋白的下調，從而抑制轉錄因子STAT3的過度活化和抗凋亡及增殖相關分子的表達。本研究結果發現，NLRP3炎性小體表達與膽管癌臨床病理分期、淋巴結轉移、分化程度和脈管侵犯有關，表明NLRP3炎性小體可能在膽管癌的發生和發展中發揮重要的生物學作用。進一步研究發現，NLRP3炎性小體與膽管癌患者臨床預后有關，NLRP3炎性小體高表達的膽管癌患者總生存率較低，多因素Cox回歸分析顯示，NLRP3炎性小體高表達是影響膽管癌患者生存預后的獨立因素。

綜上所述，NLRP3炎性小體在膽管癌患者中呈高表達，其可能與促進膽管癌的病理進程及多項臨床病理特征相關，高表達NLRP3炎性小體預示更差的臨床預后和更短的生存期。通過干預NLRP3炎性小體，有望成為膽管癌的潛在治療靶點，但具體作用機制還有待于進一步研究。