NGF介導Fabp4/LCN-2蛋白對骨質疏松大鼠骨微結構及骨強度的影響

鄧寧 胡慶芬* 邱宇陽 梁彩虹 張瓏維 譚雅瓊

1.重慶市開州區人民醫院內分泌科，重慶 開州 405400 2.貴陽市第二人民醫院急診科，貴州 貴陽 550081

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以低骨量和骨組織微結構破壞為特征，導致骨質脆性增加和易于骨折的全身性代謝性骨病[1]。據流行病學調查結果顯示，OP發生率存在性別差異，女性和男性發病率為8∶1，該病致殘率較高并影響患者生活質量[2]。OP早期患者無明顯癥狀，隨著疾病發展可出現局部或全身性疼痛。近些年隨著組織工程學的發展，干細胞移植治療骨科疾病取得了良好的效果，能夠修復骨缺損、改善骨代謝。神經生長因子(nerve growth factor,NGF)在骨代謝中發揮成骨細胞調節作用，能夠平衡骨代謝、有利于成骨活動[3]。相關研究[4]證實，NGF能夠通過增加骨折骨痂形成加快骨組織修復。間充質干細胞(MSCs)是來源于中胚層、存在于骨髓及多種組織中的多向分化的一類干細胞，MSCs具有廣泛的獲得性并擁有多向分化的潛能，被認為具有較強促再生能力的MSCs在治療OP中具有廣泛的應用前景。

脂質運載蛋白2(lipocalin-2，ICN-2)是一種分泌型糖蛋白，主要由成骨細胞分泌，能夠通過血液循環達到血腦屏障參與骨代謝。大量研究[5]證實，ICN-2與成骨細胞關系密切，當成骨細胞分化降低時能夠抑制葡萄糖代謝。在OP患者中發現ICN-2表達異常，且抑制ICN-2能夠影響成骨分化能力。脂肪酸結合蛋白4(fatty acid binding protein 4, Fabp4)屬于細胞內脂肪酸結合蛋白(FABPs)成員之一，主要在脂肪細胞及巨噬細胞中表達，主要作用為參與細胞內脂肪酸運輸作用，被發現在OP疾病中表達降低，說明其異常表達能夠參與疾病的發生發展[6]。但是目前關于NGF介導Fabp4/LCN-2水平的研究較少，本研究擬通過腹腔注射NGF，探討Fabp4/LCN-2對骨微結構及骨強度的影響，為組織工程學防治OP的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:60只雌性無菌Wistar大鼠購自廣東省醫學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(粵)2018-0015，平均體重225～300 g，在室溫、飽和濕度下飼養一周后按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。本研究經重慶醫科大學動物實驗倫理委員會批準(批準號201912001)。

1.1.2主要藥物、試劑及儀器:注射用鼠神經生長因子(武漢海特生物制藥，批準文號：S20020117)；維甲酸片(山東良福制藥)；Fabp4抗體及GAPDH抗體(美國Introvigen公司)；LCN抗體(美國Santa cluz公司)；蘇木素染色液(北京鼎國昌盛生物)；戊巴比妥鈉(湖北鴻運隆生物科技)；雙能X線BMD儀(品源博聯醫療設備上海公司)；Micro CT(杭州越波生物科技)；生物力學檢測儀(濟南中創工業測試系統公司)；蛋白電泳系統及PCR儀器(杭州厚澤生物科技)。

1.2 方法

1.2.1OP建模：將維甲酸片劑研磨成細粉末，加入無菌蒸餾水制成維甲酸混懸溶液，制備成足量的溶液，保存在-4 ℃的恒溫冰箱中備用。對大鼠采用維甲酸混懸液連續灌胃，每日一次，每次70 mg/kg，連續灌胃4周，同時在室溫及飽和濕度下按照標準飲食飼養，獲得OP大鼠實驗動物模型。

1.2.2分組及干預方法：將60只大鼠按照平均體重分別4組，分別為正常組、OP組、NGF組及干預對照組，每組15只。建模成功后，對NGF組及干預對照組分別行腹腔注射NGF、MSCs，劑量為2.0 μ/kg ，正常組及OP組均經腹腔注射等體積的PBS生理鹽水，每日一次，連續注射3 d。

1.2.3酶聯免疫試劑盒(ELISA)法檢測血清中骨代謝指標：抽取各組大鼠眼眶血1.5 mL，放入無菌EP管中，按照3 000 r/min(半徑為10 cm)離心15 min，后采用ELISA檢測堿性磷酸酶水平(ALP)、骨鈣素(BGP)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)含量。具體步驟如下：實驗過程中設置空白對照組，在血清樣本中加入鏈霉素45 μL，青霉素45 μL，加入ALP、BGP及TRAP抗體，再次添加鏈霉素45 μL。將試管輕輕震蕩，充分搖晃，在37 ℃下保存60 min。每個孔內部加入50 mL顯色液。隨后再次加入50 mL顯色液，輕輕搖動后，在4 ℃避光環境下進行染色，時間為15 min。中止反應：在每個孔內加入40 μL終止溶液，顏色從藍色變為黃色。用空白孔凋零點后測定各孔A值，在450 nm處測量每個孔吸光度。

1.2.4組織提取：通過1 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死各組大鼠，解剖雙下肢股骨，經0.9 %生理鹽水沖洗、4 %多聚甲醛固定24 h，用15 %乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)脫鈣14 d觀察骨形態學改變。

1.2.5HE染色觀察股骨組織病理形態[7]：將各組大鼠股骨組織切片放入37 ℃復溫15 min，經二苯甲脫蠟后分別用100 %、95 %、85 %及75 %乙醇進行逐層脫水，蘇木精染色8～10 min，自來水沖洗，1 %鹽酸乙醇處理10 s，伊紅染色液復染10 s，逐層脫水，中性樹脂封片后通過顯微鏡觀察組織形態，在200倍光學顯微鏡下觀察股骨病理。

1.2.6Micro CT測量股骨骨微結構及骨組織形態指標：取股骨組織，將左側股骨浸泡于10 %甲醛中固定，用于骨微結構Micro CT分析。Micro CT掃描參數：球管電壓45 v；電流165 μA；曝光時間500 ms；旋轉角度和步長分別為180°和0.4°，采用0.5 AL的Filter分辨率為5 μm。骨組織形態指標：Micro CT分析骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.2.7測量股骨骨強度：選擇各組大鼠左側全段股骨，股骨組織骨密度(BMD)和骨礦含量(BMC)表示骨強度，采用Hologic雙能X線骨密度儀測量，利用該系統軟件進行分析并自動統計。

1.2.8免疫印跡檢測股骨組織Fabp4/LCN-2蛋白含量[8]：在此實驗環節加入Fabp4抑制劑組(對OP大鼠灌胃FABP4抑制劑BMS3094030，40 mg/kg，每日灌胃一次，灌胃3 d)，取各組大鼠股骨組織，采用0.125 %胰蛋白酶消化，3 000 r/min(半徑10 cm)離心15 min后，保留上清液后加入樣孔，進行電泳實驗。PVDF膜TBS浸泡10 min，反復PBS沖洗3次，5 min/次，加入1抗Fabp4(1∶2 000)、LCN-2(1∶2 000)和GAPDH抗體(1∶2 000 )，加入HRP標記羊抗鼠IgG2抗(1∶5 000)。膜浸入ECL工作液獲取圖像。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠血清生化指標比較

OP組大鼠血清中BGP、ALP及TRAP表達與正常組相比顯著升高(P<0.05)，與OP組相比，NGF組及干預對照組大鼠血清BGP、ALP及TRAP表達均降低，組間比較存在差異(P<0.05)，NGF組及干預對照組血清BGP、ALP及TRAP表達均無差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清生化指標比較Table.1 Comparison of serum biochemical parameters in each

2.2 各組大鼠股骨組織的病理改變

正常組大鼠股骨組織骨小梁分布密集，呈現紅紫色，粗細均勻，數目較多，排列緊致，骨髓細胞數目較多。OP組大鼠股骨組織骨小梁分布降低，數目減少且存在斷裂及骨髓腔表變大。NGF組和干預對照組與OP組相比，骨小梁數目增多且分布較規則，結構和正常組相似。見圖1。

圖1 HE染色檢測各組大鼠股骨組織形態比較(100×)Fig.1 Comparison of the morphology of femur in each group detected by HE staining (100×)

2.3 各組大鼠股骨組織微結構及骨形態指標比較

采用Micro-CT小動物活體檢測系統檢測各組大鼠的股骨微結構，經三維重建后，OP組大鼠股骨組織中TB·Th、TB·N含量與正常組相比降低，TB·Sp含量升高，存在差異(P<0.05)，NGF組和干預對照組TB·Th、TB·N含量升高，TB·Sp含量降低，和OP組比較存在差異(P<0.05)，其余組別比較無差異(P>0.05)，見圖2、表2。

圖2 各組大鼠股骨組織微結構比較Fig.2 Comparison of femur microstructure in each group

表2 各組大鼠股骨形態指標比較Table.2 Comparison of morphological indexes of femur in each

2.4 各組大鼠股骨骨強度比較

OP組BMD及BMC降低，與正常組比較存在差異(P<0.05)，NGF組和干預對照組BMD及BMC水平升高，與OP組比較存在差異(P<0.05)，其余組別無差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠股骨骨強度比較Table.3 Comparison of femoral bone strength of rats in each

2.5 各組大鼠股骨組織中Fabp4及LCN-2蛋白比較

OP組大鼠股骨組織中Fabp4蛋白水平升高，LCN-2蛋白水平降低，與正常組比較存在差異(P<0.05)，NGF組和干預對照組Fabp4蛋白降低，LCN-2蛋白升高，與OP組比較存在差異(P<0.05)，Fabp4抑制劑組的Fabp4表達低于NGF組(P<0.05)，其余組別無差異(P>0.05)，見表4、圖3、圖4。

圖3 各組大鼠股骨組織中Fabp4蛋白圖Fig.3 Fabp4 protein diagram in femur tissues of rats in each group

圖4 各組大鼠股骨組織中LCN-2蛋白圖Fig.4 LCN-2 protein diagram in femur tissue of rats in each group

表4 各組大鼠股骨組織中Fabp4及LCN-2蛋白比較Table.4 Comparison of Fabp4 and LCN-2 proteins in femur tissues of rats in each

3 討論

在骨代謝過程中新骨形成及舊骨沉積的過程會將骨鈣釋放到血液循環中，BGP是體液成牙質細胞及肥大軟骨細胞分泌合成的非膠質骨帶包，表達升高對鈣代謝疾病有診斷價值[9-10]。ALP在OP時由于骨吸收增加由靜止狀態轉變為活躍狀態是反應破骨細胞活性的重要指標[11-12]。NGF是一種多肽蛋白復合物，主要發揮營養神經的作用，NGF不僅在神經系統發揮促進神經修復及營養作用， 同時在骨

愈合中也有重要意義[13]。NGF能夠對神經系統起調控作用，對交感神經發揮穩定作用進而影響骨代謝[14]。隨著對NGF研究的深入，內外源性的NGF均可以參與成骨細胞活性調節，能夠增加和LNGFR受體的親和力、促進成骨細胞磷酸化，增加成骨細胞增殖能力。本研究證實，外源性NGF具有改善OP大鼠骨代謝水平、維持骨吸收及骨生成平衡的作用。

本研究采用HE染色及Micro CT分別檢測各組大鼠股骨組織病理及微結構，并對其進行量化分析，了解骨小梁結構參數，從而有利于預測骨的力學強度改變。骨微結構可直接決定骨量，目前骨微結構因子有TB·Th、TB·N及TB·Sp等。骨質疏松家兔體外局部注射NGF后進行CT檢測發現能夠增加骨新生，提高骨小梁分布，這與NGF能夠增加成骨、新骨礦化及鈣化提高骨質量有關[15]。從骨微結構來看，NGF腹腔注射后能夠通過提高相關成骨細胞活性增加基質鈣化，進而改善骨小梁分布。劉宇鵬等[16]研究顯示對肋骨骨折大鼠損傷部位腹腔注射NGF能夠提高骨小梁分布，提高抗折彎度，增加骨強度及抗骨折能力。這與劉治軍等[17]研究相似。

本研究證實，NGF能夠提高OP大鼠股骨組織中BMD及BMC表達，說明NGF能夠通過增加BMD及BMC水平進而提高骨強度。在正常成熟的成骨細胞中發現NGF表達，而OP疾病中表達降低，外源性提高NGF能夠提高骨小梁新生，NGF-β能夠對成骨細胞成骨能力起促進作用，進而增加骨量，提高骨強度。在骨折發生后NGF能夠促進I型膠原蛋白分泌并加快II型膠原蛋白吸收，增加骨結痂形成進而增加愈合。NGF能夠提高OP大鼠生物力學，這與NGF可誘導神經引入骨生長中、加快P物質等釋放進而調節骨代謝并一進步抑制骨吸收、增加骨形成提高骨密度等有關。

Li等[18-19]研究提示，在OP大鼠骨組織中FABP4表達升高，能夠通過與PPARγ結合后靶向一些下游信號通路而增加脂質氧化作用。LCN2主要具有抑制破骨細胞分化及形成的作用。成骨細胞中存在NGF及相關受體LNGFR受體表達，上調NGF能夠增加與受體的親和力而發揮細胞信息傳遞作用，介導成骨細胞生物學活性而提高成骨形成能力[20]。NGF能夠抑制OP大鼠股骨組織中FABP4蛋白及激活LCN2表達而發揮骨保護作用，推測是NGF通過提高成骨細胞活性及成骨能力而上調LCN2活性。玉竹及其多糖主要是通過降血糖、降血脂及激活NFG水平從而降低FABP4水平[21]。本研究推測NGF能夠通過上調成骨能力、增加LCN2活性、改善脂肪及糖分進而抑制FABP4表達。

綜上所述，對骨質疏松大鼠腹腔注射NGF能夠改善大鼠股骨組織生化指標，增加骨強度及骨微結構，原因可能與調節Fabp4/LCN-2表達有關。