當歸雞血藤化裁方發揮類雌激素作用保護去卵巢大鼠骨量流失

余旭東 劉淑剛 高曉璐 陳虎,3*

1.河北中醫學院，河北 石家莊 050090 2.河北醫科大學第四醫院，河北 石家莊 050011 3.河北省中醫藥科學院，河北 石家莊 050030

骨質疏松癥是一種漸進性的全身代謝性骨疾病，臨床以骨量低下，骨組織微結構破壞為主要特征[1]。該病好發于絕經后婦女，其主要發病機制為內源性雌激素水平急劇下降，松質骨進行性退變，繼而導致骨量嚴重丟失與骨脆性的增加[2]。遺憾的是，雖然傳統的雌激素替代療法(estrogen replacement therapy，ERT)確實可以降低骨質疏松的風險，但是也極大地增加了心血管、乳腺、子宮等靶器官的負擔[3-4]。目前臨床上采用鈣鹽或雙膦酸鹽、雌激素受體調節劑、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PHT)等方法治療骨質疏松癥，雖然取得了一定的療效，但仍存在改善癥狀不完全或者停藥后骨丟失反彈等不良事件[5-7]。在此背景下，一部分患者傾向選擇植物來源的膳食補充劑。其中，中草藥具有明顯優勢，中醫臨床中發現當歸雞血藤化裁方對骨質疏松效果明顯，為進一步探索其作用機制，筆者設計了本實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

方劑組成與制備：當歸20 g，雞血藤20 g，威靈仙10 g，荊芥10 g，羌活10 g，川芎10 g，秦艽10 g。采用中藥顆粒規格，一日一劑，療程12周，中藥顆粒均由江陰天江藥業有限公司提供。

實驗試劑：堿性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAcP-5b)、Ⅰ型膠原C端肽(CTX-1)、17β-雌二醇(17β-E2)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，骨保護素(OPG)購自美國Affinity Biosciences，核因子κB 受體活化因子(RANK)抗體購自武漢博士德工程有限公司，核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)、細胞外調節蛋白激酶(ERK)抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，蘇木素染色液，戊巴比妥鈉，液氮，10%中性福爾馬林溶液，PBS洗液，凝膠配置液，PVDF膜均由河北醫科大學第四醫院動物實驗中心提供。

實驗儀器：雙能X射線骨密度儀，倒置熒光數碼顯微鏡，生物蛋白質垂直電泳儀，高速低溫離心機，全波長掃描式多功能讀數儀，各量程單通道移液器。

實驗動物：30只SPF級SD大鼠，3月齡，雌性(未交配)，體重(250±10)g，購自河北醫科大學動物實驗中心。動物生產許可證編號：SCXK(冀)2018-004。本實驗通過河北醫科大學第四醫院倫理委員會審核，批號：IACUC-4th Hos Hebmu-2020015。

1.2 藥物劑量

按成年婦女體重60 kg每日用藥量90 g計算，每日用藥濃度為1.5 g/kg，換算成大鼠等效量劑量1.5 g/kg×6.3=9.45 g/kg。

1.3 實驗方法

30只大鼠適應性飼養兩周后，隨機分為3組：假手術組(Sham組)、去卵巢模型組(OVX組)、去卵巢加藥物治療組(OVX+T組)，每組10只。對空白組大鼠行假手術(只打開腹腔，取部分脂肪組織，不切除卵巢)，對其他2組大鼠均進行雙側卵巢去勢手術。依據前期去勢大鼠造模成功經驗于術后2個月后開始進行正式實驗，其中Sham組與OVX組不干預，OVX+T組進行中藥灌胃干預，12周后檢測骨密度。次日麻醉大鼠行腹主動脈采血后，離心取上層血清置于-80 ℃備用。取股骨漂洗后剔除殘余組織，進行形態學與蛋白分析。

1.4 指標檢測

1.4.1骨密度檢測：雙能X線骨密度儀測定大鼠第1～5段腰椎及右股骨的骨密度。

1.4.2血清指標測定：按試劑盒說明書操作，測定血清中17β-E2、CTX-1的含量和ALP、TRAcP-5b的活性。

1.4.3骨組織形態學檢測：將股骨置于福爾馬林溶液中固定48 h后脫鈣處理，放入梯度乙醇脫水、浸蠟、石蠟包埋，之后沿正中矢狀面連續切片，厚度約為4 μm，用于蘇木精-伊紅染色，最后統計大鼠骨小梁面積并進行組織學形態學觀察。

1.4.4蛋白表達檢測：取大鼠右側股骨稱重，液氮中磨碎，加入RIPA緩沖液裂解提取蛋白。測定蛋白濃度后，使用SDS-PAGE電泳分離蛋白。將電泳后凝膠上的蛋白質轉移PVDF膜上，并使用以下一抗：OPG(1∶1 500)，RANKL(1∶1 000)，RANK(1∶1 000)，ERK(1∶1 000)與合適的二抗進行處理，最后將PVDF膜平放至覆有保鮮膜的暗盒中進行曝光處理，掃描膠片并用Tanon Gis軟件測定條帶灰度值。

1.5 統計學分析

采用SPSS 23.0進行統計學分析。計量數據以均數加減標準差表示，數據進行正態性和方差齊性檢驗，若符合要求，運用單因素方差分析，組間差異兩兩比較采用LSD法，若不符合，則用非參數秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。圖形繪制由 Graphpad Prism 8.0 軟件完成。

2 結果

2.1 當歸雞血藤化裁方對OVX大鼠血清雌激素水平的影響

使用ELISA雙抗夾心法對經12周治療后的3組大鼠進行血清雌激素水平測定。如圖1示，與Sham組相比，OVX組大鼠體內雌激素水平顯著降低(P<0.05)，與OVX組相比，OVX+T組大鼠雌激素水平升高(P<0.05)。

圖1 治療12周后大鼠血清雌激素水平結果Fig.1 Results of serum estrogen levels in rats after 12 weeks of treatment注：與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05。

2.2 當歸雞血藤化裁方對OVX大鼠骨密度的影響

采用雙能X線檢測大鼠的右側股骨與腰椎的骨密度。如圖2所示，經12周藥物干預后，與Sham相比，OVX大鼠的右側股骨和腰椎的總骨密度均顯著降低(P<0.05)。與OVX組相比，OVX+T的治療顯著增加了右側股骨和腰椎總骨密度(P<0.05)，但低于Sham組的水平。

圖2 治療12周后大鼠股骨(A)及腰椎(B)X線掃描結果Fig.2 X-ray scan results the femur (A) and lumbar (B) in rats after 12 weeks of treatment注：與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，##P<0.01。

2.3 當歸雞血藤化裁方對OVX大鼠骨組織形態的影響

三組大鼠股骨HE切片見圖3，與Sham組相比，OVX組大鼠骨小梁數量明顯降低，部分區域出現骨小梁斷裂等骨質疏松的現象；經12周藥物干預后，與OVX組相比，OVX+T組骨小梁連接的致密程度、骨小梁數量明顯升高。

圖3 治療12周后大鼠股骨組織形態結構(HE，×40)Fig.3 Morphological structure of the femur in rats after 12 weeks of treatment (HE, ×40)注：A：假手術組 B：模型組 C：治療組

2.4 當歸雞血藤化裁方對OVX大鼠血清骨代謝指標的影響

采用可見光比色法和ELISA雙抗夾心法分別測定血清中ALP、CTX-1、TRAcP-5b的含量或活性。如圖4所示，OVX組大鼠的血清CTX-1含量及TRAcP-5b、ALP活性均高于Sham組(P<0.05)，但低于OVX+T組水平(P<0.05)。

圖4 治療12周后大鼠血清ALP、CTX-1、TRAcP-5b活性結果Fig.4 Results of serum ALP, CTX-1, TRAcP-5b activity in rats after 12 weeks of treatment注：與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.5 當歸雞血藤化裁方對OVX大鼠骨組織中RANKL/RANK/OPG與ERK信號通路相關蛋白表達的影響

用蛋白質印跡法測定大鼠股骨中RANKL、RANK、OPG、ERK的表達水平。如圖5所示，與Sham組相比，OVX組大鼠OPG、ERK表達水平顯著降低，而RANKL、RANK、RANKL/OPG的比率顯著升高(P<0.05)。經過藥物12周干預后，OPG、ERK表達水平顯著升高，而RANKL、RANK、RANKL/OPG的比率均顯著降低(P<0.05)。

圖5 治療12周大鼠Western blot蛋白表達結果Fig.5 Western blotting results of protein expression in rats after 12 weeks of treatment注：A：假手術組，B：模型組，C：治療組。與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

當歸雞血藤湯出自《中醫傷科學》，臨床主要用于骨傷患者氣血虛弱，白細胞或血小板減少癥等。已有研究表明當歸雞血藤湯對肩周炎和跟痛癥有較好地改善作用[8-9]，但缺乏對骨質疏松療效的案例報道。針對骨質疏松患者多虛多瘀的病理特點[10]，本研究結合當歸雞血藤湯配伍思路及現代中藥藥理學研究成果，選用當歸、雞血藤、威靈仙、荊芥、羌活、川芎、秦艽7種中藥，組成具有養血活血，祛風除濕止痹功效的當歸雞血藤化裁方，旨在舒筋活絡，強健筋骨，改善骨質疏松的癥狀。

在本實驗中，雙側卵巢切除術引起的雌激素缺乏顯著降低了骨密度、破壞了骨微組織結構(圖2、3)。經過此方12周的治療，模型大鼠血清雌二醇水平上升，骨密度、骨量及骨微組織均得到明顯改善，提示此方在保護模型大鼠骨丟失方面發揮了與雌激素類似的治療作用(圖1)。現代藥理學已證明，當歸提取物(1%藁本內酯)對去卵巢大鼠和完整大鼠均具有類雌激素作用[11]；雞血藤主要的活性成分黃酮類化合物與雌激素結構類似[12]；秦艽-威靈仙主要活性成分與ESR1靶點的關系十分密切，而ESR1是雌激素受體主要類型之一，提示秦艽-威靈仙有調節雌激素的作用[13]；川芎成分的中心靶點NCOA1介導了雌激素信號通路[14]。這些藥物可能是此方發揮類雌激素作用保護骨量的物質基礎。

OPG是一種破骨細胞生成抑制因子，通過與RANKL競爭性的結合抑制骨吸收。RANKL/OPG的比率是評價破骨細胞分化與吸收程度的重要指標[15]。機制研究證明，低水平的雌激素抑制OPG的合成[16-18]，促進RANKL與破骨細胞上的受體RANK結合，激活信號通路并誘導RANKL高表達[19]，繼而增強破骨細胞上抗酒石酸酸性磷酸酶活性并大量降解依附在骨細胞上的I型前膠原肽[20-21]，導致血清中TRAcP-5b 及CTX-1的活性水平升高。本實驗也證實雌激素的缺乏上調了RANKL/OPG比率及血清TRAcP-5b 、CTX-1的水平，提示雌激素通過RANKL/OPG調控破骨細胞形成與功能。相比之下，當歸雞血藤化裁方能增加OPG的合成并抑制RANKL-RANK的表達(圖5)，改善TRAcP-5b 、CTX-1等骨吸收指標(圖4)。

本實驗發現該方上調OPG表達的同時可以降低ALP的活性，提示該方劑對成骨的有益作用。MAPK是二級信使家族，可響應各種刺激將信號從細胞表面傳遞到細胞核內，參與調節細胞生長、增殖、凋亡等多種生理功能。其中，ERK/MAPK信號通路在驅動MSCs像成骨細胞譜的轉化中發揮著重要的作用。據報道，ERK信號通路可以激活成骨相關轉錄調節因子，如Runt相關轉錄因子(RUNX2)和 Osterix (OSX)[22-23]。ERK通路的失活會導致骨量嚴重地丟失和顱骨的發育不全[24]。一項最新的研究也發現有規律的ERK活性波可以控制成骨細胞的再生[25]。雌激素可以通過膜內的雌激素受體(ER)快速起作用，導致細胞內ERK信號轉導通路迅速激活，進而以配體非依賴性方式激活生長因子受體，延長成骨細胞存活時間并促進其分化[26-27]。此外，植物性雌激素與成骨細胞膜上的ER相結合后也可以達到類似的效果[28-29]。與之前的報道一致，當歸雞血藤化裁方可以正向調控模型大鼠股骨中ERK蛋白的表達水平，提示此方可以通過激活ERK/MAPK通路，增強成骨細胞的活性，降低骨量流失的風險。

4 結論

當歸雞血藤化裁方發揮類雌激素的作用抑制骨的高轉化率，通過OPG/RANKL/RANK信號通路來促進骨形成并抑制骨吸收，進而來防治由雌激素缺乏引起的骨質疏松癥。該方對成骨的積極作用還可能與激活ERK通路有關。這些發現擴展并補充了許多現有信息，有助于中藥的發掘并在臨床上治療絕經后骨質疏松癥提供一種全新的思路。