丹參及其活性單體成分調控骨質疏松癥相關信號通路的研究進展

王偉偉 歐志學 章曉云 李時斌 周毅 李統

1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530000 2.桂林市中醫醫院，廣西 桂林 541002

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種臨床上比較常見的骨科疾病，其特征是每單位體積的骨量減少，導致骨強度受損，多見于老年男性和絕經后女性[1]。根據相關流行病學研究顯示，預計2050年將有599萬例患者因骨質疏松而發生骨折，其醫療支出將超1 745億元，無論是對個人、家庭還是社會，都將是一個巨大的負擔[2]。目前臨床上治療OP多以西藥為主，但往往存在費用高等問題。因此，開發低毒安全、價格低廉的藥物就成為了目前骨質疏松癥研究的一大熱點。

丹參又名紅根，味苦、微寒、無毒，入心肝血分，是唇形科植物丹參的根及根莖。根據現代研究顯示，丹參具有改善微循環、抗氧化、防止血栓等功效[3]。近年來隨著中藥藥理學研究的不斷深入，相關人員發現，丹參在促進骨骼生長、愈合的同時，還能有效降低絕經期婦女或老年骨質疏松患者血液中骨吸收生物相關指標[4]。此外，相關基礎研究[5-6]也證實，丹參及其活性單體可調節相關骨性細胞增殖、凋亡以及分化。但目前臨床治療上，丹參往往是以復方形式存在，鮮有以單味中藥或活性單體形式治療骨質疏松癥，因此，本文欲通過總結近些年來，丹參及其活性成分在治療骨質疏松癥的相關性研究，從而為其基礎研究和臨床應用提供一些幫助。

1 丹參及其活性成分治療骨質疏松癥的相關性研究

相關研究顯示，目前丹參共分離出50余種活性成分，包含水溶性成分：丹參素、丹酚酸、紫草酸等，脂溶性成分：丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA，丹參酮ⅡB、隱丹參酮等，以及三萜類、黃酮類等其他成分[7]。其中以丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA和隱丹參酮為主，因此闡明丹參及其活性成分參與抗OP的機制研究，將更有利于其相關研究的開展，從而推動中醫藥的現代化研究。

1.1 丹參素

丹參素是一種來自中藥丹參的多酚類活性成分，具有抑制細胞凋亡、抗氧化等多種功能[8-9]。目前研究表明[10]，丹參素對于去勢大鼠的骨質量有著明顯的提升作用，是目前OP藥物防治領域的一大熱點。其中，申健等[11]通過研究發現，丹參素可顯著增加大鼠骨形成指標和減小骨吸收指標，從而達到防治OP的作用。機制研究方面，王秉義等[12]通過實驗發現，丹參素能激活MC3T3-E1細胞中磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號通路，從而拮抗成骨細胞凋亡。沙鑫等[13]研究觀察到，丹參素可下調磷酸化AKT的表達水平，從而抑制核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)誘導的破骨細胞分化，這可能與不同細胞中丹參素的靶基因不相同有關，而其具體作用機制則有待后續研究進一步探討。由此可見，筆者認為無論是在促進骨形成還是抑制骨吸收方面，丹參素都能發揮一定作用，值得深入研究，從而為其臨床應用提供一些幫助。

1.2 丹酚酸B

丹酚酸B是丹參中一種水溶性單體，其顯著的抗氧化作用是丹參藥用功效的主要貢獻來源[14]。相關研究表明，骨質疏松癥患者機體的氧化應激水平要明顯高于正常人[15]，因此相關學者紛紛將研究重心轉移至丹酚酸B減輕細胞氧化損傷的機制研究上。榮彩麗等[16]研究發現，丹酚酸B可恢復因氧化應激所致的成骨特異性轉錄因子(runt-related transcription factor 2，RUNX2)表達水平下降，從而恢復成骨細胞相關活性。另外，張海龍等[17]研究發現，丹酚酸B可通過激活介導AKT/轉錄因子NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)信號通路，增強牙周膜干細胞的抗氧化能力，從而減輕其對后者增殖和成骨分化的損害。

除了抗氧化應激作用，丹酚酸B還可通過其他途徑起到抗骨質疏松作用。其中，Zhang 等[18]研究證實，丹酚酸B可通過一氧化氮途徑誘導大鼠骨髓間充質干細胞的成骨分化；而劉鈺瑜等[19]研究則表明，在地塞米松引起的MC3T3-E1細胞中，丹酚酸B可抑制其Dickkopf Wnt信號通路抑制劑1(dickkopf wnt signaling pathway inhibitor 1，DKK1)mRNA的表達，從而促進骨形成。由此可見，筆者認為丹酚酸B可通過調節相關信號通路，減輕骨性細胞的氧化損傷，并同時促進成骨分化，從而起到治療骨質疏松的作用。

1.3 丹參酮ⅡA

丹參酮ⅡA是中藥丹參中有效的脂溶性成分，具有舒張血管、改善微循環以及抗炎等作用[20]。近些年其在骨質疏松領域的防治作用也逐漸引起相關學者的關注。王璽等[21]研究發現，丹參酮ⅡA可通過促進骨形成和抑制骨吸收，增加廢用性骨質疏松癥模型大鼠的骨密度。

其中在抑制骨吸收方面，Kim等[22]發現，丹參酮ⅡA能抑制RANKL誘導破骨前體細胞的細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、AKT和核轉錄因子(nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB)信號轉導通路，從而降低整合素b3和降鈣素受體的mRNA表達水平。另外，丹參酮ⅡA還可通過調節成骨細胞增殖與分化，起到防治作用。莫朝論等[23]通過體外實驗發現，在一定時間內，適宜濃度的丹參酮ⅡA可促進大鼠成骨細胞增殖，其通過上調骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)的mRNA表達來促進成骨分化。由此可見，無論是在骨形成還是骨吸收過程中，丹參酮ⅡA都有一定的研究價值。

1.4 隱丹參酮

隱丹參酮是一種脂溶性蒽醌類衍生物，具有祛瘀止痛、抗菌抗炎和抗氧化等作用[24]。其在抗骨質疏松領域的作用目前也在被不斷挖掘。Lee等[25]通過實驗證實，0.5～2.5 μg/mL的隱丹參酮可有效抑制破骨細胞的增殖分化。Wang等[26]在研究中同樣發現，炎性環境下，隱丹參酮可通過阻斷NF-κB信號通路來抑制破骨細胞生成。

而隨著機制研究的不斷深入，相關研究發現，NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路在隱丹參酮調控破骨細胞過程中發揮著重要作用。張翕等[27]研究發現，隱丹參酮可下調即早基因(c-fos)、組織蛋白酶 K(Cathepsin K)和活化T-細胞核因子(recombinant nuclear factor of activated T-cell cytoplasmic 1，NFATc1)等破骨細胞特異性基因的表達，從而抑制MAPK信號通路誘導破骨細胞生成作用。Wang等[28]研究同樣發現，在骨髓源性巨噬細胞中，隱丹參酮可抑制骨髓源性巨噬細胞中破骨形成相關標記蛋白的表達。另外，他們還發現隱丹參酮可減弱RANKL誘導的ERK磷酸化和NF-κB激活。這些結果皆表明，隱丹參酮通過抑制ERK磷酸化和NF-κB激活，抑制RANKL誘導的破骨細胞發生。由此可見，隱丹參酮主要是通過抑制NF-κB和MAPK信號通路來抑制破骨細胞生成，進而抑制骨吸收，最終起到防治作用。

2 丹參及其活性成分治療骨質疏松癥的相關機制

2.1 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)通路是Wnt信號通路中公認的經典通路，可誘導一系列骨代謝和骨發育的重要調節因子表達，以此起到防治骨質疏松的作用。Wnt蛋白與低密度脂蛋白受體相關蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein，LRP)/Frizzled受體結合后，通路被激活，其胞質內散亂的蛋白也被相應激活，糖原合成激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)活性被抑制，從而阻礙β-catenin與細胞支架蛋白(Axin)、GSK-3β以及大腸腺瘤樣息肉蛋白(APC)結合形成β-catenin降解復合物，而后β-catenin進一步磷酸化，導致胞內游離β-catenin增多，其達到閾值后會向核內轉移并與TCF/LEF轉錄復合物結合，激活相關靶基因，從而促進成骨細胞增殖分化及抑制其凋亡。

其中，丹參素和丹酚酸B皆已被證實，可通過調節Wnt/β-catenin信號通路來促進成骨細胞分化。Cui等[29]研究表明，丹酚酸B和丹參素可抵抗糖皮質激素誘導的間充質干細胞中DKK1表達和促進β-catenin表達。另外，閆小飛等[30]研究通過丹參素干預成骨細胞發現，后者細胞核內β-catenin表達量要明顯高于對照組，并通過抑制該通路，進一步證實丹參素能通過調節Wnt/β-catenin通路來促進成骨細胞分化。由此可見，Wnt/β-catenin信號通路促進成骨細胞增殖分化的調控機理，在丹參及其活性單體治療骨質疏松癥的過程中發揮著重要作用。但由于目前有關文獻仍較為欠缺，因此還需后續研究進一步補充及深入探討(圖1)。

圖1 丹參及其活性單體介導Wnt信號通路抗骨質疏松的作用機制Fig.1 Anti osteoporosis mechanism of Wnt signaling pathway mediated by salvia miltiorrhiza and its active monomers

2.2 OPG/RANKL/RANK軸

骨保護素(osteoprotegerin，OPG)/RANKL/核因子κB受體激活因子(receptor activator of nuclear factor Kappa B，RANK)軸是近年來破骨細胞領域中研究較為廣泛的一種傳導機制。RANKL是誘導破骨前體細胞分化的重要細胞因子，由骨基質細胞和成骨細胞產生，與RANK相結合后，可增強破骨細胞活性從而促進骨吸收[31]。而RANK是RANKL的最主要受體，常見于破骨細胞的胞膜上。OPG則為RANKL的另一種受體，可競爭性結合RANKL來阻斷RANK/RANKL信號通路的傳遞[32]。而腫瘤壞死因子受體相關蛋白6(tumer necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)、NF-κB以及MAPK是RANKL/RANK軸的中下游信號位點，當RANKL與RANK結合后，刺激信號會以級聯反應方式沿著這些信號位點傳遞至NFATc1，而在破骨細胞分化的最后階段，NFATc1與c-Fos/c-Jun二聚體結合共同轉錄破骨細胞特異性基因，最終調節破骨細胞分化。

Wang等[33]通過實驗發現，在脂多糖誘導的破骨細胞中，丹酚酸B鎂可抑制RANKL、c-Src等表達，表明丹酚酸B通過抑制RANKL/RANK傳導途徑，抑制破骨細胞生成。張曉燕等[34]研究則發現，丹參素能夠通過調控OPG-RANKL-RANK軸，抑制破骨細胞活性；并在后續研究中發現，丹參素可同時增加OPGmRNA和蛋白的表達，從而促進成骨細胞增殖[35]。由此可見，丹參及其活性單體可通過調控OPG-RANKL-RANK軸，抑制RANKL在破骨細胞中的信號傳導來抑制破骨細胞生成，最終起到治療骨質疏松癥的作用(圖2)。

圖2 丹參及其活性單體介導OPG/RANKL/RANK軸抗骨質疏松的作用機制Fig.2 Mechanism of anti osteoporosis of OPG/RANKL/rank axis mediated by salvia miltiorrhiza and its active monomers

2.3 MAPK信號通路

MAPK是一類絲裂原活化蛋白激酶，可將細胞外的刺激信號轉導至細胞內，從而引起不同的細胞反應。其主要有4條分支路線，其中與防治OP聯系密切的主要為ERK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)及p38/MAPK三條分支[36-37]。而目前已有研究證實，丹參及其活性單體可通過調控MAPK信號通路來防止骨量流失。

夏慶泉等[38]發現，丹參注射液可通過激活ERK1/2傳導途徑，促進成骨細胞增殖分化。Xu等[39]研究則顯示，丹酚酸B對骨髓間充質干細胞無明顯毒性作用，并且可顯著提高骨髓間充質干細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALT)活性、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和RUNX2表達，從而證實了丹酚酸B可通過激活ERK信號通路促進骨髓間充質干細胞成骨分化。除此之外，Cheng等[40]通過實驗發現，丹參酮ⅡA還能抑制RANKL誘導MAPK通路激活，導致破骨相關標志物cathepsin K、TRAF6、基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase9，MMP9)和NFATc1的表達降低，從而抑制破骨細胞分化和生成。由此可見，丹參及其活性單體可通過調控MAPK信號通路的ERK分支，來保護骨髓間充質干細胞及促進其成骨分化，并同時促進成骨細胞分化和抑制破骨細胞生成，最終起到防治OP的作用(圖3)。

圖3 丹參及其活性單體介導MAPK信號通路抗骨質疏松的作用機制Fig.3 Anti osteoporosis mechanism of MAPK signaling pathway mediated by salvia miltiorrhiza and its active monomers

2.4 NF-κB信號通路

NF-κB信號通路可通過影響破骨細胞生成及活化，從而在骨質疏松癥的防治過程中發揮重要作用。靜息狀態下，p50或者p65以與核因子κB抑制因子A(recombinant inhibitory subunit of NF Kappa B Alpha，IκBα)形成共聚體的形式存在于胞質內，而在外界相關信號如脂多糖、RANKL等刺激下，IκBα磷酸化并進行降解，使得p50或者p65進入細胞核內，從而促進破骨細胞生成以及活化相關因子的轉錄[41]。而目前相關研究已證實，丹參及其活性單體可通過調控NF-κB信號通路來調節骨性細胞的生物活性。王麗麗等[42]研究通過丹酚酸B干預小鼠后發現，丹酚酸B可有效降低NF-κB-p65和Cathepsin K的表達，改善干預組小鼠牙槽骨骨密度下降，并且發現丹酚酸B可有效改善高脂飲食所導致的氧化應激，最終防止小鼠牙槽骨骨質流失。洪瑛等[43]研究則表明，丹參酮ⅡA可抑制重組人白介素1(IL-1beta protein，IL-1β)誘導的軟骨細胞中TRAF6、p65以及p-p65的表達，通過抑制NF-κB信號通路，從而改善IL-1β對軟骨細胞的炎性損傷。由此可見，丹參及其活性抗體可通過調控NF-κB信號通路，改善機體氧化應激損傷以及軟骨細胞的炎性損傷，并同時抑制破骨細胞生成，從而防止機體的骨質流失。但目前在抗骨質疏松領域中，丹參及其活性單體調控NF-κB通路的相關性研究較少，這有待后續研究進一步探討(圖4)。

圖4 丹參及其活性單體介導NF-κB信號通路抗骨質疏松的作用機制Fig.4 The anti-osteoporosis mechanism of NF-κB signal pathway mediated by salvia miltiorrhiza and its active monomers

2.5 PI3K/AKT信號通路

PI3K/AKT作為機體內關鍵的信號轉導途徑，已被證實在多種生物學過程中發揮著重要作用[44]。PI3K在受到上游激活信號后，其胞膜上的磷脂酰肌醇4，5(phosphatidylinositol-4，5-bisphos-phate，PIP2)會轉化成第二信使磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol-3，4，5-bisphosphate，PIP3)，并作用于靶基因AKT，PIP3與AKT相結合，活化AKT[45]，傳遞信號至下游效應分子，進而調節下游多種激酶，影響細胞的分化和代謝效果，最終對骨質疏松起到防治作用。

其中，李汪洋等[46]研究發現，紫草酸能通過上調B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和p-Akt，下調Bax，從而緩解H2O2誘導的骨髓間充質干細胞凋亡。曹慧敏等[47]研究則發現，丹參酮ⅡA可降低內皮細胞中丙二醛的含量，增強超氧化物歧化酶的活性，促進其自噬，并同時檢測細胞中PI3K、AKT以及p-雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)的表達，從而表明丹參酮ⅡA可通過調節PI3K/AKT促進自噬，對內皮細胞氧化應激損傷起到一定的保護作用。孟如丹等[48]亦通過實驗證實，丹參酮ⅡA可通過抑制PI3K/AKT信號通路，抑制軟骨細胞的炎癥反應，從而對IL-1β誘導的軟骨細胞起到保護作用。除此之外，林院等[49]研究發現，丹酚酸B可通過激活PI3K/AKT信號通路，上調 OPN、ALP和骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)表達，從而刺激MC3T3-E1細胞成骨分化。由此可見，丹參及其活性單體可通過調控PI3K/AKT信號通路，影響相關骨性細胞的增殖、凋亡、自噬、抗氧化以及炎癥反應，從而起到防治骨質疏松的作用(圖5)。

圖5 丹參及其活性單體介導PI3K/AKT信號通路抗骨質疏松的作用機制Fig.5 Anti osteoporosis mechanism of PI3K/Akt signaling pathway mediated by salvia miltiorrhiza and its active monomers

3 總結與展望

目前有關丹參防治OP的研究較為零散，多數僅僅局限于某個活性單體在某種骨性細胞上的作用，而中醫治療具有多靶點、多途徑的特點，因此本文通過總結近年來丹參及其活性單體在該領域的相關研究，從整體方面來對丹參的抗骨質疏松機制進行探討。并通過總結發現，丹參及其活性單體相對西藥毒性較小，其主要通過調控Wnt/β-catenin、OPG/RANKL/RANK、NF-κB、PI3K/AKT信號通路以及MAPK信號通路的ERK分支，促進骨形成、抑制骨吸收，從而發揮抗骨質疏松的作用。并且還發現，丹參及其活性單體調控骨性細胞氧化應激反應是其抗骨質疏松的另外一種重要方式。

相關研究表明[50]，氧化應激會導致成骨細胞體內產生過多的活性氧，進而抑制其分化，成骨細胞數量減少使得骨質流失加速；同時，氧化應激與前體破骨細胞內抗氧化酶、谷胱甘肽水平降低以及NADPH氧化酶的激活有關，激活前體破骨細胞分化，從而增強骨吸收[51]。由此可見，進一步深化丹參抗氧化與骨代謝平衡之間的機制研究，將對今后中醫藥抗骨質疏松具有重要意義。除此之外，本文還發現該領域的研究現狀存在如下問題，目前有關研究多集中于丹參素、丹酚酸B 、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等幾種活性單體，其余成分研究較少，且目前調控機制研究的有關驗證也略顯不足，這都有待后續研究進一步探討與完善。

但總體來說，在促進骨形成和抑制骨吸收，尤其是在改善骨性細胞氧化應激損傷方面，丹參及其活性單體具有一定的研究前景，相關中藥通過改善骨性細胞氧化應激損傷也將是今后中醫藥抗骨質疏松研究的一種新思路。