骨鈣素在神經退行性疾病中的研究進展

康寧 楊寧 郭向陽

北京大學第三醫院麻醉科，北京 100191

1 骨鈣素的結構與功能

1.1 骨鈣素的結構

骨鈣素(osteocalcin，OC)是由成骨細胞產生的非膠原蛋白，部分存儲在骨基質中，最早由Price從牛骨和人骨中分離出來。由 49個氨基酸(在小鼠中為46個)組成，被認為是骨形成的生物標志物[1]。OC結構中含有3個谷氨酸殘基，在γ-谷氨酰基羧化酶的作用下，以維生素K、二氧化碳作為輔助因子進行羧化[2-3]。羧化的OC增加了對羥基磷灰石晶體的親和力，嵌入在骨基質中[4]。在骨吸收過程中，OC在吸收陷窩的酸性環境下脫羧，成為羧化不全骨鈣素(undercarboxylated osteocalcin，GluOC)，這降低了其對骨的親和力，GluOC會釋放進入血液循環作用于全身多個器官。見圖1。

圖1 骨鈣素與羧化不全骨鈣素的結構及相互轉變(引用并改編自文獻[5])Fig.1 Structure of OC and GluOC and transformation (cited and adapted from literature [5])

1.2 OC與外周器官

GluOC被認為是OC的活性形式[6]，除了調節骨礦化外，還可以調節全身能量代謝及性功能[7]。OC可以通過結合于脂肪細胞、肝細胞、骨骼肌細胞、胰島β細胞、睪丸間質細胞上的G蛋白偶聯受體C族6組成員A(G-protein coupled receptor family C group 6 member A，Gprc6A)，增加脂肪細胞中脂聯素的表達，使脂肪細胞對胰島素的敏感性增加[8]；增加肝細胞對胰島素的敏感性，減少肝臟中脂肪的積累[4]；促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取及細胞中線粒體的生物發生[9]；促進胰島β細胞的增殖及胰島素的合成與分泌[7]；增加睪丸間質細胞中睪酮的合成分泌，進而調節男性性功能[10]。有研究表明，骨鈣素與相應受體結合后，至少招募了兩條信號通路：①磷脂酶C(phospholipase C，PLC)-1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1, 4, 5-trisphosphate，IP3)-Ca2+；②腺苷酸環化酶(adenylyl cyclase，cAMP)-蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MEK)-細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)[11]。

1.3 OC與中樞神經系統

近年來研究還發現，血液循環中的GluOC可以穿過血腦屏障，與海馬CA3區中腦的腹側被蓋區(ventral tegmental area，VTA)、腦干中縫背核(dorsal raphe nucleus，DRN)和中縫內核(medial raphe nucleus of brainstem，MRN)神經元上的Gpr158結合，進而促進單胺類神經遞質、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和視網膜母細胞瘤結合蛋白48(retinoblastoma associated protein 48，RbAp48)的合成，減少GABA的合成，從而促進空間學習和記憶，抑制焦慮、抑郁行為和年齡相關性記憶喪失[1]。最近Li等[12]的動物實驗表明OC通過GPR37(G protein coupled receptor 37，Gpr37)調節中樞神經系統少突膠質細胞分化和髓鞘化的作用。Paula等[13]研究顯示在0～9個月齡的雌性及雄性小鼠血清中OC水平呈現逐漸下降的趨勢。Bradburn等[14]研究表明在30歲前的女性和50歲前的男性血OC水平迅速下降。Lori等[15]將3個月齡的野生型小鼠富含OC的血漿注射給16個月齡的老年小鼠體內，新物體識別實驗和高架十字迷宮實驗結果顯示老年小鼠的認知水平得到改善，焦慮減輕。Oury等[16]在動物實驗中發現OC會穿過胎盤屏障，促進胎兒神經發育，防止細胞凋亡。此外，在成年小鼠中，建立空間學習和記憶需要來自于母體的OC。以上提示OC水平的改變可能與年齡相關的認知記憶減退相關。見圖2、3。

圖2 骨鈣素對全身器官的影響Fig.2 Effects of osteocalcin on systemic organs

圖3 骨鈣素對中樞神經系統的影響(引用并改編自文獻[1])Fig.3 Effects of osteocalcin on central nervous system (citation and adapted from the literature [1])

2 OC與阿爾茨海默癥

2.1 阿爾茨海默癥的發生發展與骨代謝存在聯系

阿爾茨海默癥(Alzheimer disease，AD)是癡呆癥最常見的病因，約占所有癡呆癥病例的一半，主要影響年齡在65歲以上的人群[17]。AD患者的特征性癥狀主要包括記憶喪失、語言障礙、執行功能障礙、定向障礙、情緒波動、失去動力、無法自我照顧和其他行為問題[18]。骨質疏松也是一種老年退行性疾病，主要發生在年齡大于65歲的老年人中。Zhao等[19]的研究表明AD患者髖骨骨折風險比正常對照組較高(OR=1.80，95%CI=1.54～2.11)。進一步分析顯示，AD患者的髖關節骨密度(bone mineral density，BMD)較健康對照組低(SMD=-1.12，95%CI=-1.34～-0.90)。Natalia等[20]對71例早期AD患者和69例非AD對照組參與者進行了全身BMD測量，MRI檢查并計算標準化全腦體積，評估認知功能。與對照組相比，早期AD組的平均BMD較低，且與年齡、性別、體育活動、吸煙、抑郁、雌激素替代治療和E4載脂蛋白狀態無關；在AD組患者中，BMD與全腦體積和認知功能呈正相關。以上結果表明AD患者骨量更容易丟失，并且可能與中樞機制有關。Zhou等[21]對946名年齡范圍在60～75歲的男性和女性進行了腰椎和髖部雙X線BMD測定研究，并在5年期間每年進行隨訪，采用中文版簡易精神狀態檢查(mini-mental state examination，MMSE)和日常生活工具活動(activities of daily living，ADL)評估患者的認知和功能狀態，結果顯示BMD減少的程度與認知功能下降程度呈正相關，BMD在最低1/4的受試者與對照組相比，患AD的風險增加了2倍。以上研究提示，骨質疏松和AD發病之間可能存在著共同的生物學機制，骨代謝與AD的發生發展可能存在關聯。

2.2 OC直接作用于中樞神經系統減輕AD中樞病變

骨是一個活躍的內分泌器官，可以通過分泌一系列蛋白影響其他器官功能。由成骨細胞分泌的OC會穿過血腦屏障影響中樞神經系統，并可能影響AD的病理生理過程。Oury等[16]的研究顯示OC可以穿過大鼠血腦屏障與海馬CA3區神經元結合，增加單胺類神經遞質合成，減少GABA類神經遞質合成從而改善大鼠認知功能。Shan等[22]給AD小鼠中樞和外周注射GluOC，結果顯示一段時間后小鼠海馬和皮質的淀粉纖維樣斑塊沉積以及海馬APP和Aβ蛋白的表達明顯減少，AKT/mTOF相關蛋白表達增加；體外實驗采用老化Aβ1-42處理PC12細胞24 h，并提前2 h采用不同濃度GluOC干預，結果顯示GluOC可減輕老化Aβ-42造成的PC12細胞活性損傷，增加細胞中AKT/mTOR相關蛋白的表達。以上研究提示在體內和體外實驗GluOC均可以通過AKT/mTOR通路減輕AD小鼠中樞神經系統病變并且對受損神經元起到保護作用。

2.3 OC通過調節脂質代謝減輕AD的中樞病變

OC還可以通過影響脂代謝間接影響中樞神經系統，Chen等[23]用放射免疫法測定了783名男性和946名絕經后女性的血清總OC及血脂，發現血清OC水平和甘油三酯和總膽固醇呈負相關。Zhang等[24]研究發現GluOC通過抑制肝臟新生脂肪生成和促進脂肪酸β氧化改善了KKAy小鼠的血脂異常并減輕了肝臟脂肪變性并且這種改善作用呈劑量依賴性。Otani等[25]的動物實驗顯示高劑量GluOC通過激活CREB-p300的方式上調質膜FasL，進而激活鄰近脂肪細胞的Fas信號，從而觸發脂肪細胞壞死。以上研究表明OC可以調節全身脂代謝。高血脂會通過載脂蛋白增加β淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)的形成來破壞神經突觸的完整性，從而導致AD的病理變化[26]，而OC可能通過調節血脂減輕AD中樞神經系統的病理變化。

2.4 OC通過調節糖代謝降低AD的發生風險

神經元對葡萄糖毒性較為敏感，急性或者慢性血糖紊亂都可以引起神經元損傷從而損害認知功能。有一項流行病學研究報告顯示[27]，2型糖尿病(tpye 2 diabetes mellitus，T2DM)患者患AD的風險比健康人高50%～100%。Yaffe等[28]對1 983名女性進行了研究，發現HbA1c水平>7.0%的參與者發生認知功能障礙的風險比健康人群增加了4倍。神經元攝取葡萄糖并不依賴胰島素，當在高血糖環境下，細胞內葡萄糖水平會異常升高。在這種情況下，葡萄糖會被氧化形成自由基和活性羰基，進一步激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，從而改變細胞表型狀態，繼而導致神經元受損。有研究顯示[29]，鼻內滴胰島素可以改善AD患者認知水平。OC對糖代謝具有強大的調控作用，也許OC可以間接調節認知功能。Yang等[30]的一項研究顯示與健康對照組相比，老年T2DM患者認知功能評分低于對照組(P=0.025),并且血清骨鈣素水平低于對照組(P<0.01)；并且在老年T2DM患者中MMSE分值與骨鈣素水平呈正相關(r=-0.462，P=0.014)。以上研究結果提示，OC可能參與了糖尿病患者認知功能損害的過程，補充OC可能對于降低糖尿病轉變為AD的風險具有一定的作用。

3 OC與帕金森病

3.1 帕金森病的發生發展與骨代謝存在聯系

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常見的神經退行性疾病，以黑質多巴胺能神經元(dopaminergic neuron，SN)進行性缺失和紋狀體多巴胺損耗為主要的病理缺陷[31]。臨床上以運動癥狀為主，包括肌強直、靜止性震顫和運動遲緩。而由成骨細胞分泌的OC可與中腦神經元結合，促進多巴胺類神經遞質的形成[16]，可以推測PD與骨代謝之間存在聯系。近年來有研究顯示PD患者更容易發生骨質疏松。Bezza等[32]收集了52例PD患者和52名對照人員，用雙能X線測量腰椎和髖骨BMD，結果顯示PD患者BMD明顯低于對照組(spine：1.031 vs. 1.175 g/cm；hip：0.968 vs. 1.054)。Lin等[33]收集了50例PD患者腦脊液及50例年齡相匹配的健康人的腦脊液，檢測其中的OC，結果顯示 PD患者腦脊液中OC水平明顯低于健康對照組[PDvsHC 14 817.5 pg/mL (8 145.9～18 998.3) vs. 18 264 pg/mL (12 835.5～22 342.3)]。Guo等[34]在PD大鼠模型中得到了相同的結論。

3.2 OC可減少多巴胺能神經元的耗竭

Guo等[34]將OC直接注射到PD大鼠的右側紋狀體，結果顯示6周后實驗組大鼠的運動距離明顯長于對照組，OC改善了實驗組大鼠運動功能。進一步探究發現實驗組大鼠黑質和紋狀體TH+神經元耗竭明顯減少。以上結果表明OC可以直接減輕PD大鼠中樞病變從而改善PD大鼠的運動功能障礙。Guo等[34]又進行了離體實驗，觀察OC對6-OHDA誘導的PC12細胞毒性的保護作用，并采用CCK8，流式細胞凋亡和凋亡蛋白檢測手段進行驗證；同時觀察細胞模型組中AKT/GSK3β信號通路變化，并采用AKT/GSK3β相應抑制劑確認OC對神經細胞保護作用的機制。研究結果表明AKT/GSK3β介導了OC對PC12細胞的保護作用。以上研究提示OC可以通過AKT/GSK3β通路減少PD大鼠中多巴胺能神經元損耗進而改善PD大鼠運動癥狀。

3.3 OC可減輕中樞神經炎癥

TNF-α和IL-1β等促炎因子的過表達是PD的常見特征[35]，星形膠質細胞和小膠質細胞是大腦中最常見的兩種與慢性炎癥反應相關的細胞，參與PD等神經退行性疾病的發生發展[36-37]。Guo等[34]用6-OHDA損傷大鼠黑質并且測量了紋狀體中TNF-α和IL-1β的mRNA水平，然后將黑質和紋狀體中GFAP和Iba1陽性膠質細胞進行染色。結果顯示，用6-OHDA損傷的大鼠黑質中，損傷側星形膠質細胞顯著增加；給予OC后紋狀體中TNF-α和IL-1β的表達降低并且黑質中星形膠質細胞和小膠質細胞數量顯著減少。以上研究提示OC可以通過降低炎癥因子的表達以及抑制星形膠質細胞和小膠質細胞的增殖改善PD癥狀[38]。

3.4 OC通過腸道菌群影響PD

近年來，腸道菌群與中樞神經系統疾病的關系越來越受到關注[39-41]，短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)是腸道微生物的主要代謝物，將腸道微生物群的信號傳遞給宿主。有研究表明[42-43]，SCFAs對調節腦功能和血液組織屏障的完整性有有益的作用。然而，與一般公認的有益作用相反，一項研究[40]顯示，在PD模型中，SCFAs是加速神經炎癥和α-突觸核蛋白病的主要調節因子。因此，從微生物群角度尋找治療PD的方法具有重要意義。

Hou等[44]用16SrRNA測序結果顯示PD小鼠與對照組小鼠相比腸道菌群發生了明顯的改變，厚壁菌門和擬桿菌門顯著減少；而OC處理后顯著逆轉了這種變化。并且與對照組相比，PD小鼠糞便丙酸顯著減少，但給予OC后顯著逆轉了這種變化。以上研究提示腸道群菌改變是PD的病理變化之一，OC可以改善PD小鼠腸道群菌組成，或許可以對PD患者起到一定治療作用。

4 小結與展望

OC可以通過多種方式對AD及PD的病理過程產生影響。Oury等[16]提出，隨著年齡增長改善骨骼健康可能對認知功能產生有益影響。Cheng等[45]的動物實驗表明小鼠小膠質細胞自噬功能缺陷會激活炎癥小體進而引起帕金森樣癥狀。OC是否會影響小膠質細胞自噬從而改善PD相關癥狀，有待于進一步探究。亨廷頓舞蹈癥也是一種神經退行性病變，有研究顯示亨廷頓舞蹈癥與多巴胺系統功能障礙有關[46]，OC是否會對亨廷頓舞蹈癥病理過程產生影響有待于進一步探索。未來，有必要更深入地研究OC對神經退行性疾病的作用機制，為OC作為外周潛在靶點治療神經退行性疾病提供更多實驗依據。