羊痘病毒屬病毒通用Cycleave PCR檢測(cè)方法的建立

南文龍，鞏明霞，陸 游，李金明，王永杰，哈 達(dá)，吳發(fā)興，李 林，王英麗，陳義平，吳曉東

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；3.錫林郭勒盟動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古錫林浩特 026099）

牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（LSDV）、山羊痘病毒（GTPV）、綿羊痘病毒（SPPV）同為羊痘病毒屬（CaPVs）成員，由于傳播迅速且可造成重大經(jīng)濟(jì)損失，其導(dǎo)致的牛結(jié)節(jié)性皮膚病（LSD）、山羊痘（GTP）和綿羊痘（SPP）被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病。在我國(guó)，均被列為二類動(dòng)物疫病。我國(guó)于2019 年8 月首次在新疆伊犁哈薩克自治州確診LSD[1]，2020 年6 月以來，LSD 在我國(guó)境內(nèi)迅速蔓延，已有福建、江西、內(nèi)蒙古等十余省份報(bào)告發(fā)生。LSDV 可導(dǎo)致泌乳牛產(chǎn)奶量下降，公牛短暫或永久不育，懷孕牛流產(chǎn)，皮革損壞，病牛有時(shí)因繼發(fā)細(xì)菌感染而死亡[2]，嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，是我國(guó)近3年密切關(guān)注并重點(diǎn)防控的動(dòng)物疫病之一。GTP 和SPP 合稱羊痘，數(shù)年來在我國(guó)部分地區(qū)持續(xù)流行，2021 年內(nèi)蒙古、山西、河北等多地報(bào)告疫情發(fā)生[3]。該病臨床癥狀為發(fā)熱，無毛或少毛部位的皮膚或黏膜發(fā)生紅斑、丘疹、皰疹、水泡等，發(fā)病率為50%～80%，發(fā)病后成年羊死亡率達(dá)40%，羔羊死亡率可達(dá)100%，嚴(yán)重影響羊肉和羊毛質(zhì)量[4-5]。因此，開發(fā)一種可以快速準(zhǔn)確檢測(cè)CaPVs 的方法對(duì)于防控上述疫病和維護(hù)牛、羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。

Cycleave PCR 是一類新型熒光定量PCR 技術(shù)，采用1 對(duì)引物和1 個(gè)嵌合RNA 位點(diǎn)的DNA 探針擴(kuò)增模板，探針和模板雜交后于RNA 位點(diǎn)處切割探針而產(chǎn)生標(biāo)記熒光，具有特異、敏感、快速及熒光背景低、信噪比高等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于布魯氏菌病、丙型肝炎、肺癌等畜牧獸醫(yī)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域疾病研究[6-9]。鑒于LSDV、GTPV 和SPPV 基因組具有高度同源性，本研究以其共同保守區(qū)為基礎(chǔ)，建立了一種CaPVs 通用的Cycleave PCR 檢測(cè)方法，以期為上述疫病防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、核酸和臨床樣本 LSDV/China/XJ/2019-1，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國(guó)家外來動(dòng)物疫病研究中心分離鑒定；GTPV（AV41株）、口蹄疫病毒O 型（FMDV/Re-O/MYA98/JSCZ2013 株）、口蹄疫病毒A 型（FMDV/Re-A/WH/09 株）、羊口瘡病毒（GO-BT15-30 株）、牛病毒性腹瀉病毒（NMG 株）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（LY 株），購自市售商品化疫苗；SPPV（GL 株）DNA 模板，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；藍(lán)舌病病毒DNA 模板，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；89 份臨床疑似感染LSDV 牛全血、唾液、皮膚結(jié)節(jié)樣品，42 份臨床疑似感染羊痘的山羊或綿羊全血、血清、唾液、皮膚組織核酸樣品，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心和內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 主要儀器和試劑 全自動(dòng)核酸提取儀（西安天隆公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Bio-Rad 公司），超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo 公司），高速冷凍離心機(jī)（Thermo 公司），瓊脂糖凝膠電泳儀（Bio-Rad 公司），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）。核酸提取試劑盒（西安天隆公司），引物和探針（TaKaRa 公司），Cycleave PCR 試劑盒（TaKaRa 公司），質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen 公司），pMD19-T 載體（TaKaRa 公司），DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣本核酸提取 全血、血清、唾液、病毒等液體樣本直接利用商品化核酸提取試劑盒和全自動(dòng)核酸提取儀提取核酸；皮膚組織樣品經(jīng)過勻漿和離心后，取上清按相同方法提取核酸。獲得的核酸樣本于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物和探針設(shè)計(jì) 從GenBank 數(shù)據(jù)庫中查找下載已有的全部27 株LSDV、12 株GTPV和13 株SPPV 基因組全序列。利用生物信息學(xué)軟 件BLAST 和Lasergene MegAlign，將LSDV、GTPV、SPPV 基因組全序列進(jìn)行比對(duì)，分析篩選CaPVs 代表性保守區(qū)域。基于上述結(jié)果，利用Cycleave?PCR Assay Designer 軟件，綜合考慮SNP 位點(diǎn)兩翼序列的保守性、堿基組成、GC 含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)形成、Tm 值等因素設(shè)計(jì)Cycleave PCR 反應(yīng)引物及探針。本研究根據(jù)ORF028 基因174～430 位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和探針。CaPV-F：5'-TGGAAATRGATCCACCAGTTAAAG-3'；CaPV-R：5'-TCGMACTAGCGAACATGGAA-3'；CaPV-P：5'-AAGGATGAAGA-3'（下劃線位置為標(biāo)記的RNA 位點(diǎn)）。其中，探針的5'端進(jìn)行羧基熒光素FAM 標(biāo)記，3'端進(jìn)行淬滅基團(tuán)Eclipse 標(biāo)記。引物和探針與LSDV、GTPV、SPPV 基因組序列配對(duì)結(jié)果見圖1。

1.2.3 反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件 總反應(yīng)體系25.0 μL，包含2×Cycleave PCR 反應(yīng)液12.5 μL，CaPV-F 和CaPV-R（濃度均為5 pmol/μL）各1.0 μL，CaPV-P（5 pmol/μL）1.0 μL，雙蒸水7.5 μL，DNA 模板2.0 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s（收集FAM 信號(hào)），共40 個(gè)循環(huán)。被檢樣品擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型“S”形且Ct ≤40，判定為陽性；無典型擴(kuò)增曲線，判定為陰性。

1.2.4 靈敏度試驗(yàn) 以中國(guó)流行株LSDV/China/XJ/2019-1 病毒核酸為模板，采用引物CaPV-F 和CaPV-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，回收PCR 產(chǎn)物并連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，鑒定結(jié)果與預(yù)期相符的作為陽性菌種，提取質(zhì)粒作為陽性質(zhì)粒。采用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定陽性質(zhì)粒濃度，根據(jù)質(zhì)粒拷貝數(shù)（copies/μL）=（質(zhì)粒濃度×10-9×稀釋倍數(shù)×6.02×1023）/（660 道爾頓/堿基×堿基數(shù)），計(jì)算拷貝數(shù)。對(duì)陽性質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋，濃度范圍為4.98×107～4.98×10-1copies/μL。采用建立的Cycleave PCR 檢測(cè)方法，對(duì)上述系列稀釋樣品進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)本方法的最低檢出限并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 采用建立的Cycleave PCR 方法分別對(duì)LSDV、GTPV、SPPV、口蹄疫病毒、羊口瘡病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒和藍(lán)舌病病毒核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)方法的特異性。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)濃度范圍為4.98×102～4.98×106copies/μL 的陽性質(zhì)粒，采用同批次配制的Cycleave PCR 反應(yīng)體系重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)；采用3 個(gè)不同批次配制的Cycleave PCR 反應(yīng)體系重復(fù)檢測(cè)3 次，計(jì)算批間變異系數(shù)。變異系數(shù)計(jì)算公式為CV=（標(biāo)準(zhǔn)偏差SD/平均值Mean）×100%。

1.2.7 臨床樣本檢測(cè) 采用建立的Cycleave PCR方法和WOAH 推薦的常規(guī)PCR 方法，對(duì)89 份臨床疑似感染LSDV 的牛核酸樣品和42 份臨床疑似感染羊痘的山羊或綿羊核酸樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，比較2 種方法的檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算符合率。

2 結(jié)果

2.1 陽性質(zhì)粒構(gòu)建

以中國(guó)流行株LSDV/China/XJ/2019-1 病毒核酸為模板，采用引物CaPV-F 和CaPV-R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出大小為257 bp 的目的條帶（圖2）。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證與預(yù)期目的基因序列相符，表明成功構(gòu)建陽性質(zhì)粒。

2.2 靈敏度試驗(yàn)

采用Cycleave PCR 方法檢測(cè)系列稀釋的陽性質(zhì)粒，以水作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，當(dāng)陽性質(zhì)粒濃度為4.98 copies/μL 時(shí)，仍可見明顯擴(kuò)增曲線（圖3-A）；標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=-3.380x＋45.212，R2=1.000，擴(kuò)增效率E=97.6%，表明本方法具有較高擴(kuò)增效率且在檢測(cè)范圍內(nèi)模板濃度與檢測(cè)Ct 值間具有良好線性關(guān)系（圖3-B）。

2.3 特異性試驗(yàn)

采用建立的Cycleave PCR 方法檢測(cè)相關(guān)病毒樣品，以LSDV、GTPV、SPPV 核酸樣品作為陽性對(duì)照，水作為陰性對(duì)照。結(jié)果（圖4）顯示，LSDV、GTPV、SPPV 核酸樣品均出現(xiàn)典型“S”形擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)；口蹄疫病毒、羊口瘡病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、藍(lán)舌病病毒核酸樣品均未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，說明本方法與常見牛、羊病毒無交叉反應(yīng)。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

采用建立的Cycleave PCR 方法重復(fù)檢測(cè)系列稀釋的陽性質(zhì)粒，結(jié)果批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)為0.33%～0.77%，批間重復(fù)變異系數(shù)為0.80%～1.94%，均小于2%（表1），表明本方法具有良好的重復(fù)性。

表1 批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測(cè)

采用建立的Cycleave PCR 方法和WOAH 推薦的常規(guī)PCR 方法[2]平行檢測(cè)131 份臨床樣品。結(jié)果顯示，Cycleave PCR 檢出CaPVs 陽性樣品66份、陰性樣品65 份；WOAH 方法檢出CaPVs 陽性樣品60 份、陰性樣品71 份。與WOAH 方法相比，Cycleave 熒光PCR 方法敏感性為100%，特異性為91.55%，總符合率為95.42%。將2 種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的6 份樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段并測(cè)序鑒定，證實(shí)均含有CaPVs 核酸序列。結(jié)果表明，Cycleave PCR 方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，與WOAH 推薦的常規(guī)PCR 方法符合率良好，且具有更高的陽性檢出率。

3 討論

LSDV 感染后，發(fā)病率一般為5%～45%，死亡率通常在10%以下，盡管死亡率不高，但造成的經(jīng)濟(jì)損失較大，特別是泌乳高峰的奶牛最易感LSDV，對(duì)奶牛產(chǎn)業(yè)危害尤為嚴(yán)重。Somasundaram等[10]研究測(cè)算，中東地區(qū)集約化奶牛場(chǎng)因LSD造成的直接生產(chǎn)損失約占總損失的45%～65%。與LSD 相比，GTP 和SPP 的發(fā)病率和死亡率更高，由于動(dòng)物死亡和存活動(dòng)物生產(chǎn)性能下降，可導(dǎo)致年平均收入損失30%～43%[11]。目前，WOAH 推薦的CaPVs 檢測(cè)方法有病毒分離、病原檢測(cè)（透射電鏡、組織病理學(xué)、熒光抗體試驗(yàn)等）和PCR 等，與前兩類方法相比，常規(guī)PCR 和熒光定量PCR 等分子方法檢測(cè)速度快且操作簡(jiǎn)便，適用于群體無疫、臨床病例確診、感染流行率監(jiān)測(cè)、根除政策實(shí)施等多種檢測(cè)用途[2，5]，是我國(guó)基層實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用的技術(shù)類型。

Cycleave PCR 方法以RNA 和DNA 構(gòu)成的雜合Cycling 探針與核糖核酸酶H 組合使用方式，基于PCR 技術(shù)實(shí)現(xiàn)目的基因的高效檢出，其檢測(cè)靈敏度高且特異性好。本研究建立的CaPVs 通用Cycleave PCR 檢測(cè)方法，在40 min 內(nèi)即可特異性檢出LSDV、GTPV、SPPV，且與口蹄疫病毒等常見牛、羊病毒無交叉反應(yīng)；靈敏度高，最低檢出限為4.98 copies/μL；重復(fù)性好，批內(nèi)和批間重復(fù)變異系數(shù)均小于2%；在檢測(cè)臨床樣品時(shí)，與WOAH推薦方法檢測(cè)結(jié)果符合率良好，并具有更高的陽性檢出率。

綜上，本研究建立的Cycleave PCR 檢測(cè)方法反應(yīng)時(shí)間短、敏感特異且操作簡(jiǎn)便，適用于CaPVs的臨床高通量、快速檢測(cè)。