牛傳染性鼻氣管炎病毒gI 蛋白截短表達與單克隆抗體制備

侯麗娜，于明華，劉春羽，趙洪哲，鄭秉武，溫永俊，王鳳雪

（1.內蒙古農業大學獸醫學院，農業農村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018；2.呼和浩特市動物園，內蒙古呼和浩特 010050）

牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）又稱牛皰疹病毒Ι型（bovine herpes virus type 1，BoHV-1），是 具有囊膜的雙鏈DNA 病毒，基因大小約138 kb，編碼70 種蛋白，可引起以結膜炎和鼻氣管炎為主要特征的牛傳染性鼻氣管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）[1-2]。IBRV 是引起牛呼吸道疾病綜合征（BRDC）的病原之一，通過呼吸道或生殖道急性感染宿主局部神經元并建立潛伏期，可自我激活或在應激和皮質類固醇治療條件下被重新激活，隨后通過呼吸道、眼部或生殖道分泌物以及感染公牛的精液傳播[3-5]。IBRV 感染導致的直接生產損失主要表現為，奶牛產奶量降低、體重減輕以及繼發性細菌感染所致的奶牛流產和不孕[6]。目前主要通過接種滅活或減毒疫苗對IBR 進行預防，以降低該病對畜牧業造成的經濟損失，但這并不能有效預防IBR[7]。現研究人員正嘗試使用亞單位疫苗、缺失或重組疫苗來控制或根除該病。

在IBRV 結構蛋白中，gI 蛋白位于囊膜，在病毒傳播、擴散、與宿主細胞融合以及誘導宿主免疫應答中發揮重要作用[8]。gI 蛋白由IBRVUs7所編碼，包括一個信號肽區域。雖然IBRV 核衣殼和囊膜結構已經被廣泛研究，但IBRV 核衣殼和囊膜中多數蛋白質的特征尚不清楚[9]。本研究以IBRVgI基因作為研究對象，通過在線軟件對gI 蛋白信號肽、跨膜區、抗原決定簇位點、親水性和二級結構進行了預測，去除其信號肽序列，設計了擴增gI截短型基因的PCR 引物，然后通過PCR 方法獲得gI截短基因序列，構建原核表達質粒，通過表達和純化具有生物學活性的gI 蛋白，成功制備了抗IBRV gI 蛋白的單克隆抗體（以下簡稱“單抗”）。本研究為IBRV 診斷試劑研制和深入研究gI 蛋白抗原表位及蛋白功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、載體、細胞和血清 IBRV NM14毒株、MDBK 細胞、COS-7 細胞、EGFP 質粒和pET-32a 載體，由內蒙古農業大學獸醫學院農業農村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室保存；pMD19-T 載體，購自大連寶生物工程有限公司；DH5α 感受態細胞、BL21（DE3）感受態細胞，購自天根生化科技有限公司；SP2/0 細胞，購自奧陸生物公司（上海）；IBRV 陽性血清，為實驗室鑒定臨床血清樣品后保存。

1.1.2 試劑及試驗動物 DNA Marker，購自大連寶生物工程有限公司；T4 連接酶，購自NEB 公司；限制性內切酶（BamH I/XhoI）、180 ku Prestained Protein Ladder、ECL 顯影液，購自Thermo Fisher Scientific 公司；質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自OMEGA 公司；Ni-IDA 6FF 預裝重力柱，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；卡那霉素、YA1044 型透析袋，購自Solarbio公司；Anti-His Antibody，購自天根生化科技有限公司；HRP 標記的兔抗鼠IgG 抗體、FITC 標記的羊抗鼠IgG 抗體、FITC 標記的兔抗牛IgG 抗體，購自Abcam 公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購自SIGMA 公司；5 周齡SPF 級BALB/c 雌性小鼠，購自維通利華公司（北京）。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參考GenBank 公布的IBRV gI蛋白序列（登錄號：NP_045371.1），使用軟件對IBRV gI 蛋白信號肽區域、跨膜區域、抗原決定簇位點、親水性和二級結構進行預測。經生物信息學分析后選取截短表達區域，并使用BLAST 對截短表達區域進行同源性比對。根據截短表達區域的單克隆酶切位點情況和pET-32a 質粒多克隆酶切位點區域情況，利用Primer Premier 5.0 軟件和DNAstar 7.1 系列PrimerSelect 軟件設計引物。上游引物（IBRV-gI-F）：5'-CGCGGATCCATGCCGCGCGT CGCGAAC-3'；下游引物（IBRV-gI-R）：5'-CCGC TCGAGCGAGCCCGCTCTCGTCG-3'。下劃線處為BamH I、XhoI 酶切位點，預計擴增目的片段大小約474 bp。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2.2 重組質粒構建及鑒定 提取實驗室保存的IBRV NM14 病毒基因組DNA，以其為模板對IBRVgI截短基因進行PCR 擴增并添加ployA 尾；PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳后，參照DNA 膠回收試劑盒說明書回收DNA，回收產物用BamH I 和XhoI 進行雙酶切，然后利用T4 DNA 連接酶將其連接至pMD19-T 載體轉化DH5α 感受態細胞；經PCR、雙酶切鑒定后，將鑒定正確的重組質粒與pET-32a 載體用BamH I 和XhoI 酶切、回收并連接，轉化至BL21（DE3）感受態細胞；PCR、雙酶切后的產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，同時將質粒送往上海生工生物科技有限公司測序驗證，將鑒定正確的重組質粒命名為pET-32a-gI。以相同方法構建真核表達質粒pcDNA3.1-gI。

1.2.3 重組蛋白可溶性分析及純化 將pET-32a空載體菌液和鑒定成功的pET-32a-gI 陽性菌液在恒溫振蕩培養箱中37 ℃、200 r/min 活化3 代，各取200 μL 菌液接種至20 mL 含有氨芐青霉素的LB 液體培養基中，培養至菌液處于對數生長期（OD600nm=0.6～0.8）；分裝10 mL 菌液作為陰性對照，剩余10 mL 菌液添加100 mmol/L 的IPTG溶液至其終濃度為1 mmol/L，在恒溫震蕩培養箱中16 ℃、100 r/min 培養12 h 后收集菌泥；將菌泥用PBS 清洗3 次，以超聲波破碎（35%工作效率，超聲5 s，暫停10 s），4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，分離上清與沉淀；將上清蛋白與鎳柱結合，使用含不同濃度咪唑的洗脫液對表達蛋白進行純化，收集流穿液；流穿液與蛋白上樣緩沖液混勻，100 ℃金屬浴10 min，進行SDS-PAGE 電泳。

1.2.4 單抗制備 將表達純化的gI 蛋白免疫4 只SPF 級BALB/c 雌性小鼠，制備IBRV gI 蛋白單抗。首先將gI 蛋白與弗氏完全佐劑乳化后進行初次免疫，免疫蛋白量為50 μg/只；兩周后，將gI 蛋白與弗氏不完全佐劑乳化后進行二次加強免疫，免疫蛋白量為30 μg/只；兩周后，對所有小鼠通過眼眶靜脈叢采血并分離血清，采用間接ELISA 檢測血清效價，當血清效價達到規定值后，進行細胞融合；在細胞融合前3 d，將gI 蛋白腹腔注射免疫小鼠（50 μg/只），采用PEG 法將小鼠脾細胞與SP2/0 細胞融合，融合完成后以半固體培養基（含HAT）進行篩選；挑取細胞單克隆，培養于96 孔細胞板中，采用ELISA 方法進行第1 次篩選；根據間接ELISA 篩選數據，挑出陽性值較高的細胞孔，用DMEM 培養基懸浮進行細胞計數，吹勻后滴加至96 孔板；7～10 d 后在顯微鏡下觀察，挑取陽性單克隆細胞繼續進行篩選，用該方法連續亞克隆3 次，以保證能挑選出分泌高水平抗體且穩定傳代的細胞株。利用體內誘生法制備抗IBRV gI 蛋白的單抗腹水。

1.2.5 Western blot 檢測將被IBRV 感染的MDBK 細胞SDS-PAGE 電泳后，轉印至PVDF 膜上，以5%脫脂奶于4 ℃封閉過夜；PBST 洗滌3 次，以本試驗制備的單抗（1:500、1:1 000、1:2 500、1:5 000、1:10 000 稀釋）為一抗4 ℃過夜孵育；PBST 洗滌3 次，以HRP 標記的兔抗小鼠IgG（1:8 000 稀釋）為二抗，室溫孵育1.5 h；PBST洗滌3次，加入顯影液，在凝膠成像系統上分析結果。

1.2.6 間接免疫熒光（IFA）檢測 將IBRV NM14 毒株按50 TCID50稀釋度接種MDBK 細胞，24 h 后棄掉培養液，用PBS 洗滌3 次；以4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.5% Triton X-100 通透20 min，5% BSA 封 閉30 min，PBST 洗 滌3 次，用篩選的陽性單抗（1:100 稀釋）4 ℃孵育過夜，IBRV 陽性血清（1:100 稀釋）作為陽性對照；以FITC 標記的羊抗鼠IgG（1:2 000 稀釋）37 ℃孵育1 h，陽性對照使用兔抗牛IgG（1:2 000 稀釋）孵育；PBST 洗滌3 次，置于熒光顯微鏡下觀察結果（以未接毒MDBK 細胞為陰性對照）。同時將gI14 單抗按原液以及1:10、1:50、1:100 和1:200 稀釋液，用上述方法進行IFA 檢測。

1.2.7 真核轉染鑒定 參照Lip 3 000 轉染試劑說明書，將重組質粒pcDNA3.1-gI 和EGFP 質粒轉染COS-7 細胞，培養48 h 后對制備的gI 單抗進行IFA 鑒定，具體步驟參照1.2.6。

2 結果與分析

2.1 目的蛋白生物信息學分析

在線軟件TMHMMM SERVERV 2.0 預測顯示，該蛋白無跨膜區域（圖1-A）；在線軟件SignalP-5.0 預測顯示，該蛋白在第20 和21 位氨基酸（aa）處為信號肽切割位點（圖1-B）；DNAstar Protean 預測的抗原決定簇位點和親水性見圖1-C；SOPMA 軟件分析結果（圖1-D）顯示，參與形成α-螺旋的aa 有144 個（占37.70%），參與延伸鏈形成的aa 有58 個（占15.18%），參與無規則卷曲結構的aa 有152 個（占39.79%），參與β-轉角形成的aa 有28 個（占7.33%）。避開跨膜區域和信號肽切割位點，選擇親水性較強區域和抗原決定簇正分高處，最終確定截短表達區域為277～750 bp。

2.2 重組質粒pET-32a-gI 鑒定

pET-32a 質粒大小為5 900 bp，截短表達區域基因組為474 bp。重組質粒pET-32a-gI 經BamH I和XhoI 雙酶切后，對酶切產物進行核酸凝膠電泳檢測，出現大小約5 900 和474 bp 的2 個目的條帶（圖2-A），片段大小符合預期；對pET-32a-gI 質粒進行PCR 擴增，產物經核酸凝膠電泳檢測，目的條帶約為474 bp（圖2-B）。pET-32a-gI 質粒測序信息Blast 比對結果顯示，目的基因為IBRVgI基因，pET-32a-gI 質粒構建正確。

2.3 gI 重組蛋白誘導表達及可溶性分析

利用IPTG 初步探索誘導表達，經SDS-PAGE分析發現，IPTG 未誘導的重組菌液和IPTG 誘導后的空載體均未出現特異性條帶，而IPTG 誘導后的pET-32a-gI 重組菌液出現了特異性條帶，其大小約為34 ku，與預期蛋白相對分子質量大小相符，且表達的gI 重組蛋白主要為可溶性蛋白（圖3）。

2.4 gI 重組蛋白純化

將超聲波破碎后收集的上清溶液掛鎳柱后，分別用含10、50、100、200、300、400和500 mmol/L 咪唑的緩沖液洗脫，分別收集洗脫流穿液，以SDS-PAGE 電泳檢測蛋白純化效果。結果（圖4）顯示，300、400 mmol/L 咪唑洗脫緩沖液均可將目的蛋白洗脫下來，其中400 mmol/L 咪唑洗脫緩沖液得到的蛋白條帶較為單一。經BCA蛋白濃度測定試劑盒測定，純化蛋白質量濃度為876 μg/μL。

2.5 小鼠陽性血清效價測定及雜交瘤細胞篩選

采用間接ELISA 檢測小鼠血清效價，待檢血清孔與陰性對照孔OD450nm比值（P/N）＞2.1 時，血清的最高稀釋度為血清抗體效價。結果（表1）顯示，4 只免疫小鼠血清抗體效價均可達到1:51 200以上，可進行細胞融合。細胞融合后，采用間接ELISA 篩選出1 株穩定分泌gI 重組蛋白抗體的雜交瘤細胞株，將其命名為gI14。利用抗原親和純化法對gI14 細胞上清進行純化，純化后的鼠單抗被鑒定為IgG 亞型。

表1 小鼠陽性血清ELISA 檢測結果（OD450nm）

2.6 Western blot 檢測

將純化的gI 重組蛋白和被IBRV 感染的MDBK 細胞變性后電泳，隨后轉印至PVDF 膜，以制備的gI14 單抗為一抗，HRP 標記的兔抗鼠IgG 為二抗，孵育并顯色。結果（圖5）顯示，純化所得的gI 蛋白在約34 ku 處出現特異性條帶，被IBRV 感染的MDBK 細胞在約45 ku 處出現特異性條帶。結果表明，制備的單抗不僅能與純化的gI 蛋白特異性結合，還可以與IBRV 產生的天然gI蛋白特異性結合。

2.7 IFA 檢測

IBRV NM14 株感染MDBK 細胞后，以上述制備的gI14 單抗及IBRV 陽性血清為一抗，FITC標記的羊抗鼠和兔抗牛IgG 為二抗，進行IFA 檢測。結果（圖6）顯示，陽性血清和gI14 單抗孵育后均有綠色熒光呈現，而陰性對照無熒光，表明gI14 單抗可以與病毒感染細胞產生的天然gI 蛋白特異性結合。同時將gI14 單抗稀釋5 個梯度，進行IFA 檢測。結果（圖7）顯示，稀釋的gI14 單抗孵育后均有綠色熒光呈現，陰性對照則無熒光。

2.8 真核轉染鑒定

將EGFP 質粒和pcDNA3.1-gI 質粒轉染COS-7 細胞，進行IFA 鑒定。結果（圖8）顯示，孵育gI14 單抗的細胞孔和陽性質粒細胞孔均可觀察到綠色熒光信號，而陰性對照孔未觀察到熒光信號，表明gI14 單抗可與真核表達的gI 蛋白特異性結合。

3 討論

據有關報道[10]，IBRV 在世界范圍內廣泛存在，大多數國家牛群中均可不同程度的檢出IBRV抗體，其中包括少數至今還未分離出病毒的南美國家。IBRV 可潛在感染宿主，在宿主發生持續和周期性應激反應時導致發病，給養牛業造成巨大經濟損失。IBRV 被世界動物衛生組織（WOAH）列為須通報動物疫病，因而一些歐洲國家制定了根除計劃，措施包括疫苗接種、帶毒牛隔離、邊界控制和屠宰等[6]。我國于1980 年首次從國外進口的奶牛中檢測出IBRV，自此許多研究人員開始對該病的流行病學進行調查，發現目前我國大部分省份存在IBRV 感染，且病例呈現逐年上升趨勢[11]。

病毒糖蛋白在病毒顆粒結合和穿透宿主細胞過程中起到關鍵作用[12]。研究[13-15]表明，IBRV gC、gD、gE、gH、gL 和gK 蛋白是病毒侵入所必須的。近年來IBRV gE 蛋白成為研究熱點，而與之相互作用形成Fc 受體的gI 蛋白卻鮮有研究，其在病毒入侵中所扮演的角色有待探索。研究[16]表明，單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）糖蛋白復合物gE-gI 可介導病毒在相鄰細胞之間的傳播，這為HSV 傳播分子機制解析提供了參考。此后，有學者研究[17]發現，IBRV gE 和gI 之間的相互作用可促進病毒在細胞間傳播，而缺失gE 和/或gI 會影響病毒傳播。因此，IBRV gI 蛋白極具研究價值。近年來，我國多個科研團隊先后成功制備了IBRV gB、gC、gD、gE 和gG 蛋白單抗[18-22]，但gI 蛋白及其單抗研究相對較少。

IBRV gI 蛋白抗原性和免疫原性的研究，需大量重組蛋白和gI 蛋白單抗作為前提條件。表達的IBRV gI 蛋白相對分子質量約34 ku，主要以可溶性蛋白形式存在，利用雜交瘤技術成功制備出抗IBRV gI 蛋白的IgG 亞型單克隆抗體。本試驗初步篩選出11 株陽性亞克隆細胞株，經過3 次后續亞克隆，最終僅篩選出1 株陽性雜交瘤細胞株。其原因可能是細胞克隆時染色體丟失，導致某些孔效價降低，或者非分泌抗體細胞抑制了陽性雜交瘤細胞株生長。此外，還通過構建真核表達載體pcDNA3.1-gI 表達真核蛋白。該蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能等方面接近天然蛋白分子，可將其作為一種檢驗手段鑒定gI 蛋白單抗。本研究為進一步研制IBRV 診斷試劑及研究IBRV gI 蛋白功能奠定了基礎。